淫羊藿甙促进小鼠脾细胞IL-3 mRNA及IL-6 mRNA 的表达
作者：曹颖瑛 郑钦岳 张国庆△ 曹尉尉▲
单位：
关键词：淫羊藿甙；IL-3；mRNA；IL-6；mRNA
第二军医大学学报980240
淫羊藿甙(lcariine，ICA) 是从中药淫羊藿中提取的一种具有生物活性的成分，有免疫激活作用，能增强T细胞功能[1]，促进抗体生成[2]，有减弱小鼠产生Ts细胞的作用[3]。 近来研究表明，ICA具有诱生IL-2，IL-3和IL-6等细胞因子的作用[4]，但其免疫药理作用的分子机制罕见报道。本实验通过斑点杂交方法观察了ICA 对小鼠体外脾淋巴细胞IL-3 mRNA和IL-6 mRNA 表达的影响。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 动物 BALB/c纯系小鼠，雌雄不拘，6～8周龄，体质量(19.0±1.7)g，由本校动物房提供。
1.2 药品和试剂 刀豆球蛋白 A( Con A) 和RPMI 1640完全培养基均购自Sigma公司; 小牛血清(FCS)由本校病理学教研室提供；ICA标准品购自中国生物制品厂；非放射性DNA 标记及检测试剂盒为西德Boehringer Mannheim公司产品；IL-3，IL-6及gAPDH探针由Gillis博士惠赠；其余试剂均为分析纯。缓冲液1：100 mmol/L Tril*HCl, 150 mmol/L NaCl, pH7.5; 缓冲液2：0.5%封阻试剂配于缓冲液1中；缓冲液3：100 mmol/L Tris*HCl， 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl2, pH 9.5；缓冲液4： 10 mmol/L Tris*HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0。显色溶液：10 ml缓冲液3中加45 μl NBT溶液和35 μl x-磷酸盐溶液。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 脾细胞制备及IL-3 mRNA，IL-6 mRNA 的诱生 按文献[5]方法制备脾细胞成5×106个/ml， 加入2.5 μg/ml的Con A和不同浓度的ICA，用37℃，5%CO2恒温培养1 d后收集的细胞检测IL-6 mRNA，培养5 d后收集的细胞检测IL-3 mRNA。
1.3.2 细胞总RNA的快速提取 参照文献[6]方法略有改进。取上述收集的细胞，加入2 ml EDTA-SDS，2ml EDTA-NaAc，摇匀。再加4 ml用水平衡的酚，旋涡振荡器上振荡2 min，离心，取上层水相移至另一装有 440 μl Tris*HCl，180 μl NaCl的离心管中，加2倍体积用冰预冷的无水乙醇，混匀，0℃放置30 min。离心沉淀RNA，弃去乙醇，加50 μl EDTA-SDS溶解RNA，再加 30 μl 20×SSC，20 μl 37%甲醛，68℃水浴15 min使其变性，-20℃冻存备用。
, http://www.100md.com
1.3.3 mRNA的斑点杂交 取上述提取的mRNA加等量20×SSC在尼龙膜上直接点样。以gAPDH为内标，保证上样各点的总RNA量一致。80℃ 烘干2 h，将膜与杂交液密封于塑料袋中，68℃恒温24 h，回收杂交液。膜在缓冲液1中洗涤5 min，在缓冲液2中保温3 h，再用缓冲液1洗涤15 min，重复3次，在缓冲液3中平衡10 min，放入显色液中静置于黑暗中显色，当需要的点清晰时，用缓冲液4洗膜10 min，终止反应。将杂交所得斑点用CS-930 双波长色谱分析仪进行灰度扫描，得到各样品点的积分面积百分数，用以半定量分析比较。
2 结 果
使用非放射性标记DNA探针和样品RNA 进行斑点杂交的结果如图1。ICA对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞表达 IL-3 mRNA， IL-6 mRNA的影响见图2。结果表明，ICA对未经Con A刺激的淋巴细胞IL-3 mRNA，IL-6 mRNA表达无影响。但是ICA在0.001～10.000 μg/ml 浓度内，可促进Con A诱导的淋巴细胞IL-3 mRNA，IL-6 mRNA的表达，其促进作用具有一定的剂量依赖性，而且ICA对 IL- 6 mRNA 表达的促进作用大于对IL-3 mRNA 表达的促进作用。
, 百拇医药
图1 IL-3 mRNA与IL-6 mRNA斑点杂交
A1:RPMI 1 640; A2: 2.500 μg/ml Con A; A3～A7:
10.000， 1.000，0.100， 0.010， 0.001 μg/ml ICA
3 讨 论
淫羊藿是常用的“扶正固本，补肾壮阳”的药物，作为该药有效成分之一的ICA 可作用于多种免疫活性细胞，促进某些细胞因子的产生[1]。IL-3亦称多集落刺激因子，主要来源于激活的T淋巴细胞， 能促进多系造血前体细胞的增殖与分化，是一种重要的造血生长因子。IL-6 可由多种淋巴类和非淋巴类细胞产生，可协同IL-3支持多能造血干细胞的增殖，还可参与炎症反应，提高炎症时机体的非特异性免疫
, 百拇医药
图2 ICA对小鼠脾淋巴细胞IL-3 mRNA和
IL-6 mRNA表达的影响
□：IL-3 mRNA; □: IL-6 mRNA
功能。本实验证明的ICA促进Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞 IL- 3 mRNA及IL-6 mRNA表达，与已报道的ICA具有诱生IL-3，IL-6的作用相一致，说明这种诱生作用是由于这些细胞因子的mRNA水平升高，以致翻译表达的蛋白质数量上升所致，初步阐明了ICA 促进某些细胞因子产生的分子机制，为中药淫羊藿在免疫调节和提高造血功能方面的研究及应用提供了一定的实验依据。
中国图书资料分类法分类号 R 285
参 考 文 献
1 李书桐，李铁军，郑钦岳，等.淫羊藿甙对小鼠体外脾脏细胞增殖及产生集落刺激因子样活性的影响.第二军医大学学报，1995，16(4):340
, http://www.100md.com
2 赵 勇，崔正言，张 玲，等.淫羊藿甙协同诱生IL-2，3，6作用的研究.中国免疫学杂志，1996，12(1) :43
3 王天然，邢善田，周金黄.淫羊藿甙促进抗体生成的作用.药学通报，1987，22(9):533
4 王天然，邢善田. 淫羊藿多糖和淫羊藿甙对抑制性T细胞的作用.中国免疫学杂志，1986，2(2):74
5 韩红梅，杨贵贞. IL-3的诱生. 见：杨贵贞主编.免疫生物工程纲要与技术.长春:吉林科学技术出版社，1991.94
6 萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京:科学出版社，1993.348～352
(1997-10-27收稿，1998-03-05修回), 百拇医药
单位：
关键词：淫羊藿甙；IL-3；mRNA；IL-6；mRNA
第二军医大学学报980240
淫羊藿甙(lcariine，ICA) 是从中药淫羊藿中提取的一种具有生物活性的成分，有免疫激活作用，能增强T细胞功能[1]，促进抗体生成[2]，有减弱小鼠产生Ts细胞的作用[3]。 近来研究表明，ICA具有诱生IL-2，IL-3和IL-6等细胞因子的作用[4]，但其免疫药理作用的分子机制罕见报道。本实验通过斑点杂交方法观察了ICA 对小鼠体外脾淋巴细胞IL-3 mRNA和IL-6 mRNA 表达的影响。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 动物 BALB/c纯系小鼠，雌雄不拘，6～8周龄，体质量(19.0±1.7)g，由本校动物房提供。
1.2 药品和试剂 刀豆球蛋白 A( Con A) 和RPMI 1640完全培养基均购自Sigma公司; 小牛血清(FCS)由本校病理学教研室提供；ICA标准品购自中国生物制品厂；非放射性DNA 标记及检测试剂盒为西德Boehringer Mannheim公司产品；IL-3，IL-6及gAPDH探针由Gillis博士惠赠；其余试剂均为分析纯。缓冲液1：100 mmol/L Tril*HCl, 150 mmol/L NaCl, pH7.5; 缓冲液2：0.5%封阻试剂配于缓冲液1中；缓冲液3：100 mmol/L Tris*HCl， 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl2, pH 9.5；缓冲液4： 10 mmol/L Tris*HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0。显色溶液：10 ml缓冲液3中加45 μl NBT溶液和35 μl x-磷酸盐溶液。
, 百拇医药
1.3 方法
1.3.1 脾细胞制备及IL-3 mRNA，IL-6 mRNA 的诱生 按文献[5]方法制备脾细胞成5×106个/ml， 加入2.5 μg/ml的Con A和不同浓度的ICA，用37℃，5%CO2恒温培养1 d后收集的细胞检测IL-6 mRNA，培养5 d后收集的细胞检测IL-3 mRNA。
1.3.2 细胞总RNA的快速提取 参照文献[6]方法略有改进。取上述收集的细胞，加入2 ml EDTA-SDS，2ml EDTA-NaAc，摇匀。再加4 ml用水平衡的酚，旋涡振荡器上振荡2 min，离心，取上层水相移至另一装有 440 μl Tris*HCl，180 μl NaCl的离心管中，加2倍体积用冰预冷的无水乙醇，混匀，0℃放置30 min。离心沉淀RNA，弃去乙醇，加50 μl EDTA-SDS溶解RNA，再加 30 μl 20×SSC，20 μl 37%甲醛，68℃水浴15 min使其变性，-20℃冻存备用。
, http://www.100md.com
1.3.3 mRNA的斑点杂交 取上述提取的mRNA加等量20×SSC在尼龙膜上直接点样。以gAPDH为内标，保证上样各点的总RNA量一致。80℃ 烘干2 h，将膜与杂交液密封于塑料袋中，68℃恒温24 h，回收杂交液。膜在缓冲液1中洗涤5 min，在缓冲液2中保温3 h，再用缓冲液1洗涤15 min，重复3次，在缓冲液3中平衡10 min，放入显色液中静置于黑暗中显色，当需要的点清晰时，用缓冲液4洗膜10 min，终止反应。将杂交所得斑点用CS-930 双波长色谱分析仪进行灰度扫描，得到各样品点的积分面积百分数，用以半定量分析比较。
2 结 果
使用非放射性标记DNA探针和样品RNA 进行斑点杂交的结果如图1。ICA对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞表达 IL-3 mRNA， IL-6 mRNA的影响见图2。结果表明，ICA对未经Con A刺激的淋巴细胞IL-3 mRNA，IL-6 mRNA表达无影响。但是ICA在0.001～10.000 μg/ml 浓度内，可促进Con A诱导的淋巴细胞IL-3 mRNA，IL-6 mRNA的表达，其促进作用具有一定的剂量依赖性，而且ICA对 IL- 6 mRNA 表达的促进作用大于对IL-3 mRNA 表达的促进作用。
, 百拇医药
图1 IL-3 mRNA与IL-6 mRNA斑点杂交
A1:RPMI 1 640; A2: 2.500 μg/ml Con A; A3～A7:
10.000， 1.000，0.100， 0.010， 0.001 μg/ml ICA
3 讨 论
淫羊藿是常用的“扶正固本，补肾壮阳”的药物，作为该药有效成分之一的ICA 可作用于多种免疫活性细胞，促进某些细胞因子的产生[1]。IL-3亦称多集落刺激因子，主要来源于激活的T淋巴细胞， 能促进多系造血前体细胞的增殖与分化，是一种重要的造血生长因子。IL-6 可由多种淋巴类和非淋巴类细胞产生，可协同IL-3支持多能造血干细胞的增殖，还可参与炎症反应，提高炎症时机体的非特异性免疫
, 百拇医药
图2 ICA对小鼠脾淋巴细胞IL-3 mRNA和
IL-6 mRNA表达的影响
□：IL-3 mRNA; □: IL-6 mRNA
功能。本实验证明的ICA促进Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞 IL- 3 mRNA及IL-6 mRNA表达，与已报道的ICA具有诱生IL-3，IL-6的作用相一致，说明这种诱生作用是由于这些细胞因子的mRNA水平升高，以致翻译表达的蛋白质数量上升所致，初步阐明了ICA 促进某些细胞因子产生的分子机制，为中药淫羊藿在免疫调节和提高造血功能方面的研究及应用提供了一定的实验依据。
中国图书资料分类法分类号 R 285
参 考 文 献
1 李书桐，李铁军，郑钦岳，等.淫羊藿甙对小鼠体外脾脏细胞增殖及产生集落刺激因子样活性的影响.第二军医大学学报，1995，16(4):340
, http://www.100md.com
2 赵 勇，崔正言，张 玲，等.淫羊藿甙协同诱生IL-2，3，6作用的研究.中国免疫学杂志，1996，12(1) :43
3 王天然，邢善田，周金黄.淫羊藿甙促进抗体生成的作用.药学通报，1987，22(9):533
4 王天然，邢善田. 淫羊藿多糖和淫羊藿甙对抑制性T细胞的作用.中国免疫学杂志，1986，2(2):74
5 韩红梅，杨贵贞. IL-3的诱生. 见：杨贵贞主编.免疫生物工程纲要与技术.长春:吉林科学技术出版社，1991.94
6 萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京:科学出版社，1993.348～352
(1997-10-27收稿，1998-03-05修回), 百拇医药