巨噬细胞条件培养基影响乳鼠雪旺细胞分泌神经生长因子的实验研究
作者：马向阳 于涯涛 钟世镇 胡耀民 陈立龙
单位：510515 广州，第一军医大学解剖学教研室[马向阳(现在解放军第一五七医院骨科)、于涯涛、钟世镇、胡耀民]；解放军第一五七医院骨科(陈立龙)
关键词：神经生长因子；巨噬细胞活化；动物，实验
中华外科杂志980206 【摘要】 目的 探讨巨噬细胞对雪旺细胞分泌神经生长因子(NGF)的影响。方法 制备脂多糖激活的和未激活的成年大鼠腹腔巨噬细胞的条件培养基，取3种不同浓度，分别施加于纯化培养的乳鼠雪旺细胞，作用24、48、72小时，取细胞上清液，用间接ELISA法测定细胞上清液中NGF的含量。结果 脂多糖激活的巨噬细胞条件培养基和未激活者取不同浓度作用不同时间后均能不同程度的促进乳鼠雪旺细胞分泌NGF。结论 实验结果表明，巨噬细胞条件培养基中含有促进雪旺细胞分泌NGF的因子，提示巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节雪旺细胞对NGF的分泌。
, http://www.100md.com
The effect of the macrophages conditioned media(MOCM) on NGF secretion in newborn rat schwann cells in vitro Ma Xiangyang, Yu Yatao, Zhong Shizhen,et al.Department of Anatomy, First Military Medical University, Guangzhou 510515.
【Abstract】 Objective To study the influence of macrophages on nerve growth factor (NGF) secretion in newborn rat schwann cells.Methods LPS-activated and not-activated adult rat peritoneal macrophages conditioned media (MOCM) were treated on purified cultured Schwann cells for 24,48 and 72 hours in three different concentrations the NGF contents in the cultured Schwann cells suspension media were measured by a two-site enzyme-linked immunoserbent assay.Results Both L-MOCM (LPS-activated MOCM) and N-MOCM(not-activated MOCM) obviously enhanced NGF secretion in chwann cells in each different concentration or testing time.Conclusion MOCM contains some factors which can promote NGF secretion in rat schwann cells in vitro, suggesting that macrophages regulating NGF secretion by secreted certain cytokines.
, 百拇医药
【Key words】 Nerve growth factors Macrophage activation Animals，laboratory
神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，是参与损伤神经再生和功能恢复的重要因素，对于保护其效应神经元的存活和促进其再生，具有不可或缺的作用。对于神经损伤来说，如果能提高损伤后局部合成、分泌NGF的水平，必将有利于神经再生，而神经损伤后的NGF主要由局部增殖的雪旺细胞合成分泌，巨噬细胞可能参与调节了NGF的分泌[1，2]。本研究通过培养乳鼠雪旺细胞，施加成鼠巨噬细胞条件培养基，模拟在体实验条件，用间接ELISA法对培养的雪旺细胞上清中的NGF含量进行测定，以期阐明巨噬细胞对雪旺细胞分泌NGF的影响。
材料与方法
1.巨噬细胞的培养与条件培养基的制备[3]：用冲洗抽吸法无菌采集成年SD大鼠(体重250～300g)腹腔细胞悬液，差速贴壁法纯化巨噬细胞，计数后以1×105个细胞/孔，接种于24孔板内，每孔加入或不加入脂多糖(LPS)70 μg/ml，用以激活巨噬细胞，每孔液体总量相同，均用1640-A培养液(不含血清)加至1 000μl。培养24小时后分别离心后取上清，则得到LPS激活的与未激活的巨噬细胞条件培养基(L-MOCM、N-MOCM)。4℃冷藏，备用。
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2.雪旺细胞上清液样品的制备：(1)植块法培养乳鼠雪旺细胞，进而进行纯化鉴定[3]。培养纯化后的雪旺细胞，待细胞长满瓶底时，消化成单细胞悬液，然后等量(1×104个细胞/孔)接种于24孔板内，继续培养24小时。(2)设立对照组，实验组中加入激活与未激活的巨噬细胞条件培养基(浓度分别为12.5%、25.0%、50.0%)，每孔液体总量500μl，分别培养24、48、72小时。(3)作用时间完成后将上清移入无菌eppendorf小管，离心5分钟(1000r/min)，再将上清分别移入另一无菌eppendorf小管，-20℃冷藏待测。
3.细胞上清液中NGF含量的ELISA法测定[4，5]：本试验采用改良的间接ELISA法(ELISA-ABC法)。在ELISA检测仪上，于490nm处以阴性对照孔调零后测各孔OD值。所得OD值的大小与包被的细胞上清液中的NGF含量成正比，因而OD值可以间接反映NGF含量。
, 百拇医药
4.统计学处理：数据采用方差分析；对实验组和正常对照组间行均数的两两比较(Student-Newman-Keuls法)。
结果
巨噬细胞条件培养基施加于雪旺细胞作用24、48、72小时后，各个实验组较之相应的对照组均不同程度地引起了NGF的分泌量(即OD均值)增加，且基本上以L-MOCM(50%)组为最高(附表)。
附表 巨噬细胞条件培养基影响乳鼠雪旺细胞分泌NGF的ELISA测定结果 组别(浓度)
24小时
48小时
72小时
均值
, 百拇医药 标准差
变换均值
均值
标准差
变换均值
均值
标准差
变换均值
阴性对照
0.000……
0.0000……
0.0000……
正常对照
, http://www.100md.com
0.205
0.0251
1.000
0.376
0.0325
1.000
0.452
0.0338
1.000
LPS (8.75μg/ml)
0.319
0.0374
, http://www.100md.com
1.556*
0.566
0.0508
1.505*
0.694
0.0257
1.535*
LPS (17.5μg/ml)
0.471
0.0263
2.298*
, http://www.100md.com
0.741
0.0122
1.971*
0.822
0.0393
1.819*
LPS (35.0μg/ml)
0.630
0.0223
3.073*
0.775
, 百拇医药 0.0459
2.061*
0.887
0.0419
1.962*
N-MOCM(12.5%)
0.280
0.0179
1.366*
0.475
0.0264
1.263*
, 百拇医药
0.667
0.0444
1.476*
N-MOCM(25.0%)
0.679
0.0297
3.312*
0.813
0.0572
2.162*
0.954
0.0209
, 百拇医药
2.111*
N-MOCM(50.0%)
0.395
0.0353
1.927*
0.614
0.0457
1.633*
0.693
0.0337
1.533*
, 百拇医药
L-MOCM(12.5%)
0.657
0.0822
3.205*
0.933
0.0488
2.481*
1.040
0.0366
2.301*
L-MOCM(25.0%)
, 百拇医药
1.000
0.0377
4.878*
1.180
0.0612
3.138*
1.360
0.0682
3.009*
L-MOCM(50.0%)
1.050
0.0661
, 百拇医药
5.112*
1.300
0.0533
3.457*
1.560
0.0162
3.451*
注：变换均值=实验组均值/正常对照组均值，*P<0.01讨论
实验结果表明，N-MOCM、L-MOCM均引起NGF分泌增加，说明两种条件培养基中都含有促进乳鼠雪旺细胞分泌NGF的因子，并且L-MOCM的作用较N-MOCM强，提示L-MOCM中所含有的促NGF分泌因子在质与量上优于N-MOCM。然而，这两种条件培养基均来自巨噬细胞，说明巨噬细胞在调节雪旺细胞合成分泌NGF方面发挥着重要作用。再者，从本研究可以看出，LPS可以直接刺激雪旺细胞，引起NGF分泌增加，而LPS是巨噬细胞的一种激活剂；由实验数据还可以看出，任一浓度的L-MOCM在相同作用时间时的促NGF分泌作用均强于等浓度的LPS，提示吞噬LPS后激活的巨噬细胞产生的L-MOCM中含有新的或质量更高的促NGF分泌因子。
, 百拇医药
在同一作用时间，不论是N-MOCM还是L-MOCM，促进雪旺细胞分泌的NGF量都以MOCM 50%组的效应为强；而在不同的作用时间，发现促NGF分泌效应(变换均值)在24小时基本上均高于48或72小时者，表明实验因素在发挥效应过程中可能不断被消耗，因而导致效应下降。同时又表明，对于同一因素、同一浓度有其最佳作用时间，亦即每种因素发挥效应的时期不同；另一方面，对于同一因素、同一作用时间，不同浓度所发挥的效应亦各不相同。这提示体内巨噬细胞可能还通过改变调节因子的含量及释放时机来调节雪旺细胞分泌NGF的多少。
已知巨噬细胞能够合成分泌100多种蛋白质分子，它们的生物活性影响到细胞的生长、死亡以及免疫炎症反应的每一方面，而且每一种物质分子都具有多种多样的生物活性，而某一活性又是多种分泌物综合作用的结果[2]。Heumann等[1]将激活的巨噬细胞加入培养液中，结果出现了mRNANGF的缓慢升高，模仿了在体情况。为了排除mRNANGF的升高是由于巨噬细胞合成了mRNANGF，对巨噬细胞进行了检测，发现它所含有的mRNANGF水平极低，以致于很难检测到。将激活的巨噬细胞的条件培养基加入培养液中，同样引起了mRNANGF的升高，并在3小时后稳定于高水平[6]，表明mRNANGF的升高主要是由巨噬细胞的分泌物来进行调节的。提示在体内情况下，巨噬细胞可能通过合成释放细胞因子，直接或间接地激发雪旺细胞内mRNANGF转录增加，最终引起NGF的分泌增加。
, 百拇医药
参考文献
1 Heumann R,Lindholm D,Bandtlow C,et al. Differential regulation of mRNA encoding nerve growth factor and its receptor in rat sciatic nerve during development,degeneration and regeneration: role of macrophages. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:8735-9739.
2 马向阳,于涯涛.巨噬细胞与雪旺细胞在周围神经再生中的相互调控.神经解剖学杂志, 1995,11:383-388.
3 马向阳,于涯涛，钟世镇，等. 巨噬细胞条件培养基影响雪旺细胞NGF表达率的实验研究.中华显微外科杂志,1997,20:222-223.
, http://www.100md.com
4 汪春风. 间接ELISA检测脑损伤组织提取液中bFGF含量变化.神经解剖学杂志,1995,11:43-46.
5 Weskamp G,Otten U. An enzyme-linked immunoassay for nerve growth factor(NGF):a tool for studying regulatory mechanisms involved in NGF production in brain and in peripheral tissues. J Neurochem,1987,48:1779-1786.
6 Lindholm D,Heumann R,Meyer M,et al. Interleukin-1 regulates synthesis of nerve growth factor in non-neuronal cells of rat sciatic nerve. Nature,1987,330:658-659.
(收稿：1996-12-04 修回：1997-10-15), http://www.100md.com
单位：510515 广州，第一军医大学解剖学教研室[马向阳(现在解放军第一五七医院骨科)、于涯涛、钟世镇、胡耀民]；解放军第一五七医院骨科(陈立龙)
关键词：神经生长因子；巨噬细胞活化；动物，实验
中华外科杂志980206 【摘要】 目的 探讨巨噬细胞对雪旺细胞分泌神经生长因子(NGF)的影响。方法 制备脂多糖激活的和未激活的成年大鼠腹腔巨噬细胞的条件培养基，取3种不同浓度，分别施加于纯化培养的乳鼠雪旺细胞，作用24、48、72小时，取细胞上清液，用间接ELISA法测定细胞上清液中NGF的含量。结果 脂多糖激活的巨噬细胞条件培养基和未激活者取不同浓度作用不同时间后均能不同程度的促进乳鼠雪旺细胞分泌NGF。结论 实验结果表明，巨噬细胞条件培养基中含有促进雪旺细胞分泌NGF的因子，提示巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节雪旺细胞对NGF的分泌。
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The effect of the macrophages conditioned media(MOCM) on NGF secretion in newborn rat schwann cells in vitro Ma Xiangyang, Yu Yatao, Zhong Shizhen,et al.Department of Anatomy, First Military Medical University, Guangzhou 510515.
【Abstract】 Objective To study the influence of macrophages on nerve growth factor (NGF) secretion in newborn rat schwann cells.Methods LPS-activated and not-activated adult rat peritoneal macrophages conditioned media (MOCM) were treated on purified cultured Schwann cells for 24,48 and 72 hours in three different concentrations the NGF contents in the cultured Schwann cells suspension media were measured by a two-site enzyme-linked immunoserbent assay.Results Both L-MOCM (LPS-activated MOCM) and N-MOCM(not-activated MOCM) obviously enhanced NGF secretion in chwann cells in each different concentration or testing time.Conclusion MOCM contains some factors which can promote NGF secretion in rat schwann cells in vitro, suggesting that macrophages regulating NGF secretion by secreted certain cytokines.
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【Key words】 Nerve growth factors Macrophage activation Animals，laboratory
神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，是参与损伤神经再生和功能恢复的重要因素，对于保护其效应神经元的存活和促进其再生，具有不可或缺的作用。对于神经损伤来说，如果能提高损伤后局部合成、分泌NGF的水平，必将有利于神经再生，而神经损伤后的NGF主要由局部增殖的雪旺细胞合成分泌，巨噬细胞可能参与调节了NGF的分泌[1，2]。本研究通过培养乳鼠雪旺细胞，施加成鼠巨噬细胞条件培养基，模拟在体实验条件，用间接ELISA法对培养的雪旺细胞上清中的NGF含量进行测定，以期阐明巨噬细胞对雪旺细胞分泌NGF的影响。
材料与方法
1.巨噬细胞的培养与条件培养基的制备[3]：用冲洗抽吸法无菌采集成年SD大鼠(体重250～300g)腹腔细胞悬液，差速贴壁法纯化巨噬细胞，计数后以1×105个细胞/孔，接种于24孔板内，每孔加入或不加入脂多糖(LPS)70 μg/ml，用以激活巨噬细胞，每孔液体总量相同，均用1640-A培养液(不含血清)加至1 000μl。培养24小时后分别离心后取上清，则得到LPS激活的与未激活的巨噬细胞条件培养基(L-MOCM、N-MOCM)。4℃冷藏，备用。
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2.雪旺细胞上清液样品的制备：(1)植块法培养乳鼠雪旺细胞，进而进行纯化鉴定[3]。培养纯化后的雪旺细胞，待细胞长满瓶底时，消化成单细胞悬液，然后等量(1×104个细胞/孔)接种于24孔板内，继续培养24小时。(2)设立对照组，实验组中加入激活与未激活的巨噬细胞条件培养基(浓度分别为12.5%、25.0%、50.0%)，每孔液体总量500μl，分别培养24、48、72小时。(3)作用时间完成后将上清移入无菌eppendorf小管，离心5分钟(1000r/min)，再将上清分别移入另一无菌eppendorf小管，-20℃冷藏待测。
3.细胞上清液中NGF含量的ELISA法测定[4，5]：本试验采用改良的间接ELISA法(ELISA-ABC法)。在ELISA检测仪上，于490nm处以阴性对照孔调零后测各孔OD值。所得OD值的大小与包被的细胞上清液中的NGF含量成正比，因而OD值可以间接反映NGF含量。
, 百拇医药
4.统计学处理：数据采用方差分析；对实验组和正常对照组间行均数的两两比较(Student-Newman-Keuls法)。
结果
巨噬细胞条件培养基施加于雪旺细胞作用24、48、72小时后，各个实验组较之相应的对照组均不同程度地引起了NGF的分泌量(即OD均值)增加，且基本上以L-MOCM(50%)组为最高(附表)。
附表 巨噬细胞条件培养基影响乳鼠雪旺细胞分泌NGF的ELISA测定结果 组别(浓度)
24小时
48小时
72小时
均值
, 百拇医药 标准差
变换均值
均值
标准差
变换均值
均值
标准差
变换均值
阴性对照
0.000……
0.0000……
0.0000……
正常对照
, http://www.100md.com
0.205
0.0251
1.000
0.376
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1.000
0.452
0.0338
1.000
LPS (8.75μg/ml)
0.319
0.0374
, http://www.100md.com
1.556*
0.566
0.0508
1.505*
0.694
0.0257
1.535*
LPS (17.5μg/ml)
0.471
0.0263
2.298*
, http://www.100md.com
0.741
0.0122
1.971*
0.822
0.0393
1.819*
LPS (35.0μg/ml)
0.630
0.0223
3.073*
0.775
, 百拇医药 0.0459
2.061*
0.887
0.0419
1.962*
N-MOCM(12.5%)
0.280
0.0179
1.366*
0.475
0.0264
1.263*
, 百拇医药
0.667
0.0444
1.476*
N-MOCM(25.0%)
0.679
0.0297
3.312*
0.813
0.0572
2.162*
0.954
0.0209
, 百拇医药
2.111*
N-MOCM(50.0%)
0.395
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1.927*
0.614
0.0457
1.633*
0.693
0.0337
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, 百拇医药
L-MOCM(12.5%)
0.657
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1.040
0.0366
2.301*
L-MOCM(25.0%)
, 百拇医药
1.000
0.0377
4.878*
1.180
0.0612
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L-MOCM(50.0%)
1.050
0.0661
, 百拇医药
5.112*
1.300
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3.457*
1.560
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3.451*
注：变换均值=实验组均值/正常对照组均值，*P<0.01讨论
实验结果表明，N-MOCM、L-MOCM均引起NGF分泌增加，说明两种条件培养基中都含有促进乳鼠雪旺细胞分泌NGF的因子，并且L-MOCM的作用较N-MOCM强，提示L-MOCM中所含有的促NGF分泌因子在质与量上优于N-MOCM。然而，这两种条件培养基均来自巨噬细胞，说明巨噬细胞在调节雪旺细胞合成分泌NGF方面发挥着重要作用。再者，从本研究可以看出，LPS可以直接刺激雪旺细胞，引起NGF分泌增加，而LPS是巨噬细胞的一种激活剂；由实验数据还可以看出，任一浓度的L-MOCM在相同作用时间时的促NGF分泌作用均强于等浓度的LPS，提示吞噬LPS后激活的巨噬细胞产生的L-MOCM中含有新的或质量更高的促NGF分泌因子。
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在同一作用时间，不论是N-MOCM还是L-MOCM，促进雪旺细胞分泌的NGF量都以MOCM 50%组的效应为强；而在不同的作用时间，发现促NGF分泌效应(变换均值)在24小时基本上均高于48或72小时者，表明实验因素在发挥效应过程中可能不断被消耗，因而导致效应下降。同时又表明，对于同一因素、同一浓度有其最佳作用时间，亦即每种因素发挥效应的时期不同；另一方面，对于同一因素、同一作用时间，不同浓度所发挥的效应亦各不相同。这提示体内巨噬细胞可能还通过改变调节因子的含量及释放时机来调节雪旺细胞分泌NGF的多少。
已知巨噬细胞能够合成分泌100多种蛋白质分子，它们的生物活性影响到细胞的生长、死亡以及免疫炎症反应的每一方面，而且每一种物质分子都具有多种多样的生物活性，而某一活性又是多种分泌物综合作用的结果[2]。Heumann等[1]将激活的巨噬细胞加入培养液中，结果出现了mRNANGF的缓慢升高，模仿了在体情况。为了排除mRNANGF的升高是由于巨噬细胞合成了mRNANGF，对巨噬细胞进行了检测，发现它所含有的mRNANGF水平极低，以致于很难检测到。将激活的巨噬细胞的条件培养基加入培养液中，同样引起了mRNANGF的升高，并在3小时后稳定于高水平[6]，表明mRNANGF的升高主要是由巨噬细胞的分泌物来进行调节的。提示在体内情况下，巨噬细胞可能通过合成释放细胞因子，直接或间接地激发雪旺细胞内mRNANGF转录增加，最终引起NGF的分泌增加。
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参考文献
1 Heumann R,Lindholm D,Bandtlow C,et al. Differential regulation of mRNA encoding nerve growth factor and its receptor in rat sciatic nerve during development,degeneration and regeneration: role of macrophages. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:8735-9739.
2 马向阳,于涯涛.巨噬细胞与雪旺细胞在周围神经再生中的相互调控.神经解剖学杂志, 1995,11:383-388.
3 马向阳,于涯涛，钟世镇，等. 巨噬细胞条件培养基影响雪旺细胞NGF表达率的实验研究.中华显微外科杂志,1997,20:222-223.
, http://www.100md.com
4 汪春风. 间接ELISA检测脑损伤组织提取液中bFGF含量变化.神经解剖学杂志,1995,11:43-46.
5 Weskamp G,Otten U. An enzyme-linked immunoassay for nerve growth factor(NGF):a tool for studying regulatory mechanisms involved in NGF production in brain and in peripheral tissues. J Neurochem,1987,48:1779-1786.
6 Lindholm D,Heumann R,Meyer M,et al. Interleukin-1 regulates synthesis of nerve growth factor in non-neuronal cells of rat sciatic nerve. Nature,1987,330:658-659.
(收稿：1996-12-04 修回：1997-10-15), http://www.100md.com