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疟疾诊断技术研究进展概况
http://www.100md.com 《右江民族医学院学报》 1998年第2期
     作者:关仲富

    单位:广西百色地区卫生防疫站 (百色 533000)

    关键词:

    右江民族医学学报9802129 随着疟防工作的深入,长期以来传统的、以镜检血液中疟原虫为依据的诊断方法已表现出它的局限性[1]。作流行病学调查时,常规镜检非常使人厌烦和费力[2],尤其是原虫率很低时,观察者常被大量的阴性血片搞得精疲力竭,很容易出现漏检或误诊。为此,探索敏感、特异、快速、简便的诊断方法已成为疟防工作的重要任务之一。随着对疟疾分子生物学研究的深入和高新技术的发展及提高,为疟疾的快速诊断提供了新途径,近10年来国内外学者作了大量的探索和研究,取得一定进展,笔者拟对一些重要进展加以综述。

    1 间接荧光抗体试验(IFAT)

, http://www.100md.com     IFAT已成为当前国内外应用最广泛的检测疟疾抗体方法,它不仅有助于诊断且广泛用于对不同种类单克隆抗体的筛选,了解它们与相应抗原作用的定位研究。近年石裕明等报告[3]用IFAT、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫酶染色试验(IEST)、胶体金凝集试验(CGAT)和胶乳凝集试验(LAT)等5种免疫学方法检测疟疾抗体进行比较,结果是IFAT检测疟疾抗体价值最高,其次为ELISA和IEST。由于IFAT具有操作简便和敏感性及特异性都较高的特点,所以十余年来我国各地广泛采用IFAT作疟疾流行病学调查和监测疟疾疫情变化,考核防治效果及搜索残存的传染源并对疟疾患者IFA的动态变化进行了系统观察[1]。国内学者认为,应用IFAT进行疟疾流行病学调查时,人群抗体率(≥1∶20)在15%以下,15岁以下低年龄组在5%以下,表示疟疾已降至低度或已得到有效控制;人群抗体率在15%~35%之间,低年龄组在5%~15%之间,表示疟疾仍有一定程度的传播或处在下降过程;人群抗体率超过35%,低年龄组超过15%,表明疟疾处在较高的流行之中。作者还认为,经过防治后,当疟疾发病率降至1或接近1时,低年龄组人群的IFAT阳性率大都在0~1%之间,为该法用于评价防治效果提供了依据[4]。目前我国已把IFAT作为疟疾的监测手段,钟园国等报告[5]用IFAT在河南省的6个县作疟疾纵向监测达18年之久,结果证明,人体抗体阳性率与发病趋势基本一致,作者认为IFAT可作常规方法用于疟疾监测。
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    2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

    近年来国内外不少学者应用ELISA及Dot-ELISA检测疟原虫抗原和抗体报道较多,许龙善等报告[6]对112例发热病人血样同时进行镜检和用McAb-McAb ELISA夹心法检测间日疟抗原;发热病人血片分别由基层镜检员和省级专业人员镜检,检出间日疟阳性率分别为30.36%和43.75%,ELISA法检测阳性率为42.86%,其敏感性和特异性均在95%以上。在上述基础上,刘克义等报告[7]通过基因工程技术,制备恶性疟原虫基因编码的融合蛋白,以此蛋白作为抗原,用Dot-ELISA法对恶性疟抗体进行检测,取得满意效果:当血精1∶100稀释时,46份病人血清全为阳性,20份正常人血清全为阴性,与IFA检查结果一致。

    3 核酸探针和多聚酶链反应(PCR)技术

    核酸探针技术应用于疟原虫检测的依据是疟原虫感染总伴有疟原虫核酸存在,自Franzen(1984)首先将核酸探针技术用于疟疾诊断以来,核酸探针已有了很大发展,目前应用的核酸探针主要有放射性或非放射性标记的基因组DNA探针、重复序列DNA探针、同源于重复序列的寡核酸探针和RNA探针。国内报道较多的有3种类型DNA探针:全基因组DNA探针[8]、质粒包含的重复碱基序列DNA探针[9]和人工合成的寡核苷酸探针[10]。3种探针应用结果表明,其敏感性和特异性都有所提高。陈锡欣等报告[11]应用光敏生物素标记DNA探针监测疟疾的结果显示该探针有良好的特异性和敏感性,与镜检的符合率为95.4%(123/129)。国内DNA探针研究多数与恶性疟有关,间日疟有关研究相对缓慢,近年来国内学者进行不少探索,张龙兴等报告[12]用DNA探针检测间日疟原虫,阳性符合率为89.5%(34/38),特异性为90.0%(18/20),并可检出现场诊断为恶性疟的患者中存在的间日疟感染,对明确混合感染有所裨益;翁屹等也有类似报道[13]
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    多聚酶链反应(PCR)作为一种体外无细胞基因扩增技术已广泛应用于生命科学的各个领域,将PCR应用于疟疾诊断,国内外已有不少报道。PCR技术通过反复拷贝(放大或扩增)核酸的靶序列来增强分析的信号,从而为解决单独应用核酸探针诊断所存在的问题找到了可靠的解决办法。两者联合应用可以确保检测的特异性,提高检测的敏感性。单独应用恶性疟原虫特异DNA片段作标记探针来检测血中原虫DNA,其灵敏度在50~5000个原虫/μl之间,而采用PCR来扩增培养原虫DNA,其灵敏度可检测出每20μl血中仅含10原虫,若用此法结合相应的DNA探针作Southern-blotting可检测出少至每20μl血中只含1个原虫;在现场应用也取得满意效果,检测云南恶性疟病人血样53份,结果均阳性,与镜检符合率达100%,表明PCR具有高度灵敏性和特异性[14,15]。近年高世同等报道[16]间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增用于诊断间日疟感染获得成功,可检测出间日疟感染血样中2.8个原虫/μl血的水平,用于现场间日疟患者血样的检测,与镜检符合率达98%,而20份正常人血样均为阴性,表明该法灵敏、特异且稳定性好。应用PCR检测技术还能鉴别不同虫株,确定有无混合感染存在等[17,18]。为了提高检测的敏感性,简化操作过程,降低在操作过程中原虫DNA的丢失和降解,减少样品污染等,对PCR诊断技术进行了改进,如套式PCR就是利用外、内两对特异性引物,进行2次PCR扩增,从而提高检测的敏感性和特异性。万磊等报道[18]套式PCR扩增特定片段诊断恶性疟的研究情况,结果显示其检测的灵敏度提高10~1000倍。为了便于现场应用,孙明林等报道[19]在上述基础上采用套式PCR检测滤纸干血滴中恶性疟原虫获得成功,创出一套简便、快速、敏感性高、特异性强和适用于现场的检测方法。目前PCR技术用于诊断疟原虫已在许多地区进行现场试用,可望成为一种敏感、特异的大面积筛选方法;同时该方法还被用于疟疾流行病学调查、化疗效果的判定和疫苗效果评价等。
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    4 应用Parasight-F试验检测疟原虫感染

    Parasight-F试验是一种检测恶性疟原虫滋养体的富组氨酸蛋白-Ⅱ(pfHRP-Ⅱ)双抗体免疫试验。pfHRP-Ⅱ为恶性疟原虫感染后的一种特异性物质,在病人的血浆、尿及全血中都能被检测出来。韩广东等报道[20]用试纸法检测血液中富组氨酸蛋白-Ⅱ快速诊断恶性疟获得满意效果,对镜检确诊的恶性疟病人进行检测,阳性率为95%,检测全过程需5~7min,应用改良法检测全血或血浆仅需2~3min;同时对间日疟病人血样和非疟疾病人血样进行检测,结果全部阴性,特异性为100%;作者认为,应用试纸法诊断疟疾无须任何仪器,诊断快速、方便,对临床早期确诊病人并给予及时治疗、减少传播和病死率有重要意义。目前墨西哥已生产出Parasight TM F诊断试剂盒,便于现场应用,然而,由于试剂昂贵,使现场应用受到限制。

    5 乳酸脱氢酶活性测定用于疟疾诊断
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    恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)在催化乳酸生成丙酮酸的反应中利用乙酰比啶NAD(APAD)作为辅酶,而人红细胞的LDH在APAD存在时参与这反应的速度很慢,因此可通过测定寄生虫LDH活性来反映恶性疟原虫的存在,这方面国内外报道较多,认为培养疟原虫密度为0.4%时应用LDH活性测定即可检出,目前此法主要用于疟疾流行病学大面积筛选,提供了一种在短期内筛选大量标本的简便方法,其检测原虫密度在50~1000个/μl,敏感性达76%,特异性达97%[21]。国内王福勇等报道[22]应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法检测恶性疟和间日疟病人血样各40份,正常对照血样20份中恶性疟原虫特异性乳酸脱氢酶(LDH-P)。结果表明,两种方法检测恶性疟病人血样的阳性率分别为90%和95%;而间日疟和正常人血样中均未检出LDH-P的活性。作者认为,应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法,在蛋白酶抑制剂存在的条件下,检测新鲜血样中LDH-P是诊断恶性疟的理想方法。

    6 QBC技术的应用
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    QBC系血沉棕黄层定量分析法,是美国Becton-Dickinson公司近年推出的一种快速、敏感的疟疾诊断方法,用此法检测疟原虫国内外均有报道,庞学坚[23]报道QBC法与厚血膜法诊断疟疾的比较情况,检出原虫人数QBC法高于厚血膜法31%~79%;近年张炜琪等报道[24]用QBC法对142例疑为疟疾的门诊发热病人进行检查,结果QBC法检出原虫阳性31人,阳性率为21.8%;厚血膜法原虫阳性22人,阳性率为15.5%,检出人数QBC法高于厚血膜法40.7%,QBC法敏感性可达1个原虫/105RBC。QBC法的优点在于容易操作、快速、敏感,可以检出低原虫血症,但需要荧光显微镜,材料费用高,虫种鉴别困难,因此目前该法只是作为疟疾诊断的一种辅助方法,尚难以取代传统的厚、薄、血膜镜检方法[21]

    疟疾诊断技术的发展,经历了镜检原虫、免疫学方法测定原虫特异性抗体和抗原以及分子生物学技术检测原虫特定核酸分子等阶段。随着对疟原虫分子生物学、生物化学等研究的深入以及生物实验技术的提高,将会为疟疾的诊断提供更加快速、简便、敏感和特异的诊断方法,从而为疟疾的早期特异性诊断和治疗提供可能。
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    参考文献

    1 李允鹤,主编.寄生虫病免疫学及免疫诊断.南京:江苏科学技术出版社,1991:96~99

    2 王钊,主编译.疟疾学(上).青岛:海洋大学出版社,1992:437~439

    3 石裕明,刘荣珍,吴能,等.五种免疫学方法检测疟疾抗体的比较.中国寄生虫病防治杂志,1994;7(4):299

    4 周祖杰,主编.中国疟疾的防治与研究.北京:人民卫生出版社,1991:235~237

    5 钟园国,宋金铎,李东方,等.河南省疟疾发病纵向监测报告.中国寄生虫病杂志,1997;10(3):230

    6 许龙善,张山鹰,李莉莎,等.单克隆抗体—ELISA技术检测间日疟感染的现场研究.中国寄生虫病防治杂志,1995;8(3):200
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    7 刘克义,C. Kidson.融合蛋白斑点ELISA检测恶性疟抗体.中国寄生虫病防治杂志,1991;9(1):43

    8 陆惠民,荣永琪,穆荣普,等.用[a-32P]-dATP标记恶性疟原虫DNA探针诊断恶性疟的研究.中国寄生虫病防治杂志,1991;4(1):18

    9 于忠玉,陈培霞,李霖,等.质粒PFrepzo探针检测我国恶性疟原虫的初步研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1991;9(2):90

    10 陈淑贞,张兆松,林珍,等.合成酶联DNA探针对恶性疟病人的检测.中国血吸虫病防治杂志,1991;3(1):12

    11 陈锡欣,黄炳成,杨宝金,等.应用光敏生物素标记DNA探针监测疟疾的研究.实用寄生虫病杂志,1997;5(4):155
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    12 张龙兴,柴建华,詹斌,等.DNA探针诊断间日疟的进一步研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1993;11(2):86

    13 翁屹,苏成芝.重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究.中国寄生虫病防治杂志,1994;7(1):7

    14 詹斌,张龙兴,王聚居,等.聚合酶链反应(PCR)技术在恶性疟诊断中的应用.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1994;12(1):37

    15 詹斌,张龙兴,王聚居,等.聚合酶链反应检测恶性疟原虫的研究.中国寄生虫与寄生虫病杂志,1994;12(2):111

    16 高世同,吴少庭,陈观今,等.间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日疟感染的研究.中国寄生虫病防治杂志,1997;10(1):22

    17 万磊,陈培霞,薛采芳,等.我国恶性疟原虫地理株SSUr DNA特定序列的变异分析.中国寄生虫病防治杂志,1994;7(2):91
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    18 万磊,陈培霞,薛采芳,等.套式PCR扩增特定SSUr DNA片段诊断恶性疟的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1995;13(3);174

    19 孙明林,陈培霞,薛采芳,等.套式PCR检测滤纸干血滴中恶性疟原虫的研究.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1996;14(3):197

    20 韩广东,崔刚,张洪花,等.试验法检测血液中富组氨酸蛋白Ⅱ快速诊断恶性疟的初步观察.中国寄生虫病防治杂志,1996;9(3):179

    21 孙志伟.疟疾诊断研究进展简述.实用寄生虫病杂志,1997;5(3):118

    22 Wang FY, Cheng YL, Chen XX, et al. Studies on the detection of specific lactate dehydrogenase in blood of patients with malaria. Chinese Journal of Parasitic Disease Control,1996;9(1):13

    23 庞学坚,王光志,蔡贤铮,等.QBC法与厚血膜法诊断疟疾的比较.中国血吸虫病防治杂志,1990;2(4):21

    24 张炜琪,王伟明,杨仲炎.QBC法在疟疾现场诊断中的应用.中国寄生虫病防治杂志,1994;7(3):193

    (1998-05-03收稿), 百拇医药


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