第七届欧洲组织修复学术会议论文综述
作者：傅小兵*
单位：* 解放军第304医院创伤外科中心(北京，100037)
关键词：
中国修复重建外科杂志980216 第七届欧洲组织修复学术会议于1997年8月23日～26日在德国科隆举行，这是世界上两大组织修复(愈合)学术组织之一的欧洲组织修复学会的学术年会。会议共收到论文186篇，分别来自德国、美国和中国的约300名代表参加了会议。应大会主席Thomas Krieg教授邀请，并得到K. C. Werner博士赞助，我出席了本届会议并与国外同行进行了交流。根据这次会议提交的论文，择其主要方面，介绍近年来创伤修复(愈合)与组织再生领域研究的新进展。
1 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的分子和细胞生物学以及与组织修复的关系
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作为一个多功能生长因子，TGF-β在组织修复与再生中所表现出来的多功能性是近来研究的热点。利用转基因鼠创伤模型，人们观察到当TGF-β在肝等组织过度表达时，肝脏以及一些远隔器官可以同时发生纤维化并出现高水平的循环TGF-β。而当用TGF-β抗体阻断其生物学活性后，修复创面上皮细胞的生长便受到抑制。在下肢静脉性溃疡，免疫组化研究发现TGF-β及其受体的mRNA并不缺乏，但为什么这些创面的组织修复会受到阻碍呢?结果发现，来自创面白细胞分泌的一种弹性蛋白酶能使创面渗出液中的TGF-β失活，从而显著降低其促修复作用。在TGF-β的信号传递与促修复机制研究中已发现，除以往普遍公认的酪氨酸激酶活性通路外，其信号传递实际上还涉及丝氨酸、苏氨酸激酶活性通路。所有TGF-β的超家族成员，包括骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等，其发挥作用均需要与TGF-β的Ⅰ、Ⅱ两种类型的受体复合物结合， 而这两类受体中每一种均包含有一个内在的丝氨酸、苏氨酸激酶。最近的研究还表明，一种与丝氨酸、苏氨酸激酶具有高度同源性而被称之为Smad的蛋白质在将TGF-β的信息从受体传递到细胞核中起重要作用。研究证实，如果细胞发生转化出现无活性的Smad增多或细胞表面缺乏Smad，则TGF-β的信息传递便会受阻。
, 百拇医药
在临床上，TGF-β3用于胃溃疡治疗，能显著促进修复细胞的核分裂，诱导炎性细胞浸润与再血管化，进而使创面明显缩小。一组门诊用TGF-β1治疗30例慢性溃疡患者的资料表明，TGF-β1能较安慰剂治疗组与生理盐水对照组明显促进创面修复，且无局部疼痛、发痒等不良反应。
2 基质酶类与组织修复
各种基质蛋白酶对组织修复过程中的细胞迁移、血管生发以及组织再塑形等都具有很强的作用。在不同种类组织以及不同创面的不同病理生理状态下，基质酶类[主要是一些基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)]及其抑制剂组织抑制金属蛋白酶(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)作用有显著差别。用原位杂交与免疫组化方法研究Balb/c鼠皮肤和普通大鼠皮肤的几种MMPs的结果表明，在正常的Balb/c鼠皮肤，MMP2、TIMP2以及TIMP3可以同时表达，但在皮肤损伤后，其创面肉芽组织中则只有MMP2 mRNA的表达。相反，在普通大鼠正常皮肤，鼠的胶原酶、MMP9、基质溶解素和TIMP等酶类的mRNA表达却不能观察到，表明不同种类动物之间的不同病理生理状态直接影响基质酶的分布及其组织修复过程。
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即使在同一动物的不同病理生理状态下，上皮细胞产生基质酶的类型以及功能也存在明显差异。如胶原酶1(collagenase 1)在角质细胞中的表达可以恒定不变，但在损伤的肺和肠上皮却并不表达MMP1，而是产生另一种MMP，即基质溶解素，并且呈上行调节作用。虽然基质溶解素能降解肺、肠上皮下间质中的基质成分，但基质本身也能释放基质溶解素。在基质溶解素缺乏的大鼠，修复创面的上皮细胞移行受到影响，使再上皮化发生困难。另外，创面细菌的存在可使基质溶解素表达量增加50倍～200倍，表明基质溶解素在增强宿主抗菌以及促修复中可能较MMP1更重要。
此外，MMPs家族中的重要成员胶原酶B在正常皮肤也不表达，但在创伤后修复的皮肤、角膜以及新生的血管处则能表达。由于它具有降解基底膜的功能，因而其过度表达常导致组织修复受阻，是否是导致修复创面长期不愈的原因之一值得考虑。因此，一般认为在组织修复中，创面愈合的速度与质量常不取决于某种基质酶的变化，而是取决于整个基质酶本身和其抑制剂在创面产生之间的平衡。
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3 慢性难愈合创面发生的分子生物学机制研究
一般认为，慢性难愈合创面形成的主要机制包括：长期的炎性细胞(中性细胞、巨噬细胞)浸润，使创面炎性反应延长；氧自由基产生增加；生长因子缺乏；基质蛋白酶产生和活性增加而其相应的抑制剂活性下降等。就生长因子而言，近来的一些报道表明，慢性难愈合创面组织和创面分泌液中某些生长因子及其受体，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)、肿瘤坏死因子α受体(tumor necrosis factor α receptor, TNFαR)、白细胞介素-1α(interleukin-1α, IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、血小板生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)以及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growh factor, VEGF)等含量并不缺乏，有的甚至比正常或急性创面含量更多，由此人们认为，创面生长因子的活性可能比其含量在促修复中起更重要作用，这一点从慢性难愈合创面组织中免疫活性的TNFα含量增加而生物活性的TNFα含量下降可以获得证实。另外，在慢性创面采用丝氨酸蛋白酶抑制剂则可以有效地解除创面渗出液中某些蛋白酶对血小板生长因子-Aβ(platelet-derived grwith factor-Aβ, PDGF-AB)促分裂效应的抑制作用，从而增强其促修复效应。
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有关基质蛋白酶类在慢性难愈合创面发生中作用的研究近来有些进展。研究表明，慢性难愈合创面纤维粘连蛋白含量的减少一方面来自于破坏增加，同时其mRNA表达也明显减少，进而导致其产生减少。MMPs的变化则表现出一定的时空性，如在慢性难愈合创面均可检测出MMP1、MMP8和MMP13的mRNA表达，但从时间顺序上来讲MMP1与MMP8出现早，而MMP13出现晚。从量上来讲，MMP8的mRNA表达量可比MMP1高10倍～100倍。这种MMPs表达时空的变化正好与它们在组织修复中所起的作用相一致，即MMP1对细胞迁移重要，而MMP13则主要参与组织修复后期的再塑形过程。
此外，创面超氧化状态和凋亡现象在慢性难愈合创面发生中的作用，本届会议中也有研究报道。
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4 生物材料与组织替代物在创伤修复中的作用
采用生物工程技术促进骨、软骨、肌肉、皮肤以及肌腱等组织修复与再生是近年来研究的重点。一般来讲，用于细胞培养或作为载体的新型生物材料必须具备能使细胞贴附、生长、胞外基质合成以及再塑形等功能。以前一些合成的多聚体，如多聚乳酸、多聚羟基乙酸和天然分子，如胶原/葡萄糖胺聚糖复合物等目前已得到广泛应用，对重建皮肤、骨与软骨起了一定作用。近来，一种微孔、无织状的新型透明质酸释放系统被用于培养角质细胞、成纤维细胞、软骨细胞以及内皮细胞等，效果良好。有报告表明，采用这种可吸收纤维作为载体进行三维立体培养的软骨细胞贴附良好，增殖活跃，生物活性高，能表达胶原，且细胞贴壁时不需要粘附分子的作用，长期培养不影响细胞的再分化。
在骨骼肌再生研究中，有学者发明一种新技术，能从动物与人骨髓中分离并培养胚胎样的多能祖细胞(也称间质干细胞)，在此基础上将其扩增100万倍而不失去生物学特性。通过特殊装置将这种MSCs释放入骨、软骨以及肌腱后对这些受损组织的再生起促进作用。
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过去，有两个主要因素限制了培养的角质细胞应用于创伤修复，一是时间长，二是培养皮片的脆性。最近，一种激光打孔的透明质酸膜释放系统(称激光皮肤)的应用，能使移植的培养细胞更易生长与再上皮化。有人将这种技术用于治疗116例糖尿病溃疡创面和因纹身切除后的急性创面取得明显效果，具有成本低，使用方便以及皮片易成活等特点。
此外，采用特殊的间充质与上皮细胞作用，在原位诱导产生新的组织与器官，如男性性腺、非腺泡状的输尿管以及前列腺样组织的研究也有报告。
5 其它新技术、新方法在创伤修复中的应用
利用转基因技术促进创伤修复研究，采用脂质体技术与基因枪技术等，将生长因子质粒转导入培养的人角质细胞，使其分泌生长因子；利用逆转录mRNA的差异显示法，寻找在不同方式愈合创面基因表达的差异等技术方法在近来也有报告，但总的来讲还处在初试阶段，尚需进一步研究。
(收稿：1997-09-27), http://www.100md.com
单位：* 解放军第304医院创伤外科中心(北京，100037)
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中国修复重建外科杂志980216 第七届欧洲组织修复学术会议于1997年8月23日～26日在德国科隆举行，这是世界上两大组织修复(愈合)学术组织之一的欧洲组织修复学会的学术年会。会议共收到论文186篇，分别来自德国、美国和中国的约300名代表参加了会议。应大会主席Thomas Krieg教授邀请，并得到K. C. Werner博士赞助，我出席了本届会议并与国外同行进行了交流。根据这次会议提交的论文，择其主要方面，介绍近年来创伤修复(愈合)与组织再生领域研究的新进展。
1 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的分子和细胞生物学以及与组织修复的关系
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作为一个多功能生长因子，TGF-β在组织修复与再生中所表现出来的多功能性是近来研究的热点。利用转基因鼠创伤模型，人们观察到当TGF-β在肝等组织过度表达时，肝脏以及一些远隔器官可以同时发生纤维化并出现高水平的循环TGF-β。而当用TGF-β抗体阻断其生物学活性后，修复创面上皮细胞的生长便受到抑制。在下肢静脉性溃疡，免疫组化研究发现TGF-β及其受体的mRNA并不缺乏，但为什么这些创面的组织修复会受到阻碍呢?结果发现，来自创面白细胞分泌的一种弹性蛋白酶能使创面渗出液中的TGF-β失活，从而显著降低其促修复作用。在TGF-β的信号传递与促修复机制研究中已发现，除以往普遍公认的酪氨酸激酶活性通路外，其信号传递实际上还涉及丝氨酸、苏氨酸激酶活性通路。所有TGF-β的超家族成员，包括骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等，其发挥作用均需要与TGF-β的Ⅰ、Ⅱ两种类型的受体复合物结合， 而这两类受体中每一种均包含有一个内在的丝氨酸、苏氨酸激酶。最近的研究还表明，一种与丝氨酸、苏氨酸激酶具有高度同源性而被称之为Smad的蛋白质在将TGF-β的信息从受体传递到细胞核中起重要作用。研究证实，如果细胞发生转化出现无活性的Smad增多或细胞表面缺乏Smad，则TGF-β的信息传递便会受阻。
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在临床上，TGF-β3用于胃溃疡治疗，能显著促进修复细胞的核分裂，诱导炎性细胞浸润与再血管化，进而使创面明显缩小。一组门诊用TGF-β1治疗30例慢性溃疡患者的资料表明，TGF-β1能较安慰剂治疗组与生理盐水对照组明显促进创面修复，且无局部疼痛、发痒等不良反应。
2 基质酶类与组织修复
各种基质蛋白酶对组织修复过程中的细胞迁移、血管生发以及组织再塑形等都具有很强的作用。在不同种类组织以及不同创面的不同病理生理状态下，基质酶类[主要是一些基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)]及其抑制剂组织抑制金属蛋白酶(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)作用有显著差别。用原位杂交与免疫组化方法研究Balb/c鼠皮肤和普通大鼠皮肤的几种MMPs的结果表明，在正常的Balb/c鼠皮肤，MMP2、TIMP2以及TIMP3可以同时表达，但在皮肤损伤后，其创面肉芽组织中则只有MMP2 mRNA的表达。相反，在普通大鼠正常皮肤，鼠的胶原酶、MMP9、基质溶解素和TIMP等酶类的mRNA表达却不能观察到，表明不同种类动物之间的不同病理生理状态直接影响基质酶的分布及其组织修复过程。
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即使在同一动物的不同病理生理状态下，上皮细胞产生基质酶的类型以及功能也存在明显差异。如胶原酶1(collagenase 1)在角质细胞中的表达可以恒定不变，但在损伤的肺和肠上皮却并不表达MMP1，而是产生另一种MMP，即基质溶解素，并且呈上行调节作用。虽然基质溶解素能降解肺、肠上皮下间质中的基质成分，但基质本身也能释放基质溶解素。在基质溶解素缺乏的大鼠，修复创面的上皮细胞移行受到影响，使再上皮化发生困难。另外，创面细菌的存在可使基质溶解素表达量增加50倍～200倍，表明基质溶解素在增强宿主抗菌以及促修复中可能较MMP1更重要。
此外，MMPs家族中的重要成员胶原酶B在正常皮肤也不表达，但在创伤后修复的皮肤、角膜以及新生的血管处则能表达。由于它具有降解基底膜的功能，因而其过度表达常导致组织修复受阻，是否是导致修复创面长期不愈的原因之一值得考虑。因此，一般认为在组织修复中，创面愈合的速度与质量常不取决于某种基质酶的变化，而是取决于整个基质酶本身和其抑制剂在创面产生之间的平衡。
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3 慢性难愈合创面发生的分子生物学机制研究
一般认为，慢性难愈合创面形成的主要机制包括：长期的炎性细胞(中性细胞、巨噬细胞)浸润，使创面炎性反应延长；氧自由基产生增加；生长因子缺乏；基质蛋白酶产生和活性增加而其相应的抑制剂活性下降等。就生长因子而言，近来的一些报道表明，慢性难愈合创面组织和创面分泌液中某些生长因子及其受体，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)、肿瘤坏死因子α受体(tumor necrosis factor α receptor, TNFαR)、白细胞介素-1α(interleukin-1α, IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、血小板生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)以及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growh factor, VEGF)等含量并不缺乏，有的甚至比正常或急性创面含量更多，由此人们认为，创面生长因子的活性可能比其含量在促修复中起更重要作用，这一点从慢性难愈合创面组织中免疫活性的TNFα含量增加而生物活性的TNFα含量下降可以获得证实。另外，在慢性创面采用丝氨酸蛋白酶抑制剂则可以有效地解除创面渗出液中某些蛋白酶对血小板生长因子-Aβ(platelet-derived grwith factor-Aβ, PDGF-AB)促分裂效应的抑制作用，从而增强其促修复效应。
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有关基质蛋白酶类在慢性难愈合创面发生中作用的研究近来有些进展。研究表明，慢性难愈合创面纤维粘连蛋白含量的减少一方面来自于破坏增加，同时其mRNA表达也明显减少，进而导致其产生减少。MMPs的变化则表现出一定的时空性，如在慢性难愈合创面均可检测出MMP1、MMP8和MMP13的mRNA表达，但从时间顺序上来讲MMP1与MMP8出现早，而MMP13出现晚。从量上来讲，MMP8的mRNA表达量可比MMP1高10倍～100倍。这种MMPs表达时空的变化正好与它们在组织修复中所起的作用相一致，即MMP1对细胞迁移重要，而MMP13则主要参与组织修复后期的再塑形过程。
此外，创面超氧化状态和凋亡现象在慢性难愈合创面发生中的作用，本届会议中也有研究报道。
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4 生物材料与组织替代物在创伤修复中的作用
采用生物工程技术促进骨、软骨、肌肉、皮肤以及肌腱等组织修复与再生是近年来研究的重点。一般来讲，用于细胞培养或作为载体的新型生物材料必须具备能使细胞贴附、生长、胞外基质合成以及再塑形等功能。以前一些合成的多聚体，如多聚乳酸、多聚羟基乙酸和天然分子，如胶原/葡萄糖胺聚糖复合物等目前已得到广泛应用，对重建皮肤、骨与软骨起了一定作用。近来，一种微孔、无织状的新型透明质酸释放系统被用于培养角质细胞、成纤维细胞、软骨细胞以及内皮细胞等，效果良好。有报告表明，采用这种可吸收纤维作为载体进行三维立体培养的软骨细胞贴附良好，增殖活跃，生物活性高，能表达胶原，且细胞贴壁时不需要粘附分子的作用，长期培养不影响细胞的再分化。
在骨骼肌再生研究中，有学者发明一种新技术，能从动物与人骨髓中分离并培养胚胎样的多能祖细胞(也称间质干细胞)，在此基础上将其扩增100万倍而不失去生物学特性。通过特殊装置将这种MSCs释放入骨、软骨以及肌腱后对这些受损组织的再生起促进作用。
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过去，有两个主要因素限制了培养的角质细胞应用于创伤修复，一是时间长，二是培养皮片的脆性。最近，一种激光打孔的透明质酸膜释放系统(称激光皮肤)的应用，能使移植的培养细胞更易生长与再上皮化。有人将这种技术用于治疗116例糖尿病溃疡创面和因纹身切除后的急性创面取得明显效果，具有成本低，使用方便以及皮片易成活等特点。
此外，采用特殊的间充质与上皮细胞作用，在原位诱导产生新的组织与器官，如男性性腺、非腺泡状的输尿管以及前列腺样组织的研究也有报告。
5 其它新技术、新方法在创伤修复中的应用
利用转基因技术促进创伤修复研究，采用脂质体技术与基因枪技术等，将生长因子质粒转导入培养的人角质细胞，使其分泌生长因子；利用逆转录mRNA的差异显示法，寻找在不同方式愈合创面基因表达的差异等技术方法在近来也有报告，但总的来讲还处在初试阶段，尚需进一步研究。
(收稿：1997-09-27), http://www.100md.com