体外扩增恒河猴自体内皮细胞人工血管移植研究
作者：何红兵 潘明新 潘玉先 马素珍 杨继震
单位：510282 广州，第一军医大学附属珠江医院普外科血管外科研究室
关键词：内皮；细胞，培养的；人工血管；移植
New Page 1 【摘要】 目的 为自体内皮细胞移植的临床应用奠定理论基础。方法 将恒河猴表浅静脉内皮细胞在体外培养13.9±1.4天；扩增培养的自体细胞衬里于用纤维蛋白胶预衬的膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管，继续培养9天。15只恒河猴随机分为两组。实验组(10只)用衬有自体静脉内皮细胞的人工血管置换骼总动脉；对照组(5只)用未衬里内皮细胞的人工血管置换。结果 细胞数增加148±89倍。所培养的细胞为二倍体细胞，纯度99%。原代及传代细胞培养上清液中6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)和Von Willebrand因子(vWF)含量差异无显著意义。细胞种植后2小时和9天，人工血管腔面见一层均匀的基质，基质表面有一层连续的内皮细胞单层。内皮细胞紧密排列。呈梭状，形态饱满。实验组除1只于术后12小时因近端吻合口破裂腹腔内出血死亡，1只人工血管于术后4周阻塞外，其余8只恒河猴人工血管术后4周均保持通畅，内膜下组织厚度为80±12 μm；对照组5条人工血管全部阻塞。结论 自体内皮细胞移植可有效地提高人工血管的通畅率。
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Autologous endothelial cell transplantation in meacacos He Hongbing, Pan Mingxin, Pan Yuxian, et al. Vessel Unit, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
【Abstract】 Objective To lay a theoretical foundation for the clinical application of autologous endothelial cell transplantation. Methods Macaco endothelial cells derived from superficial veins were cultivated in vitro for 13.89±1.36 days. The multiplied cells were lined in vitro onto the luminal surface of expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) grafts precoated with fibrin glue and fibronectin, then cultivated further for 9 days. 15 macacos were divided randomly into two groups. The common iliac arteries of the exper mental animals (n=10) were replaced with endothelialized grafts, those of control (n=5) with untreated ones. Results The amount of endothelial cells increased for 147.93±88.68 folds. All the cells were diploid cells with a purity of 99%. The content of both 6-keto-PGF1a and vWF in the supernatant of primary and subcultured passages didn′t have significant difference. Two hours and 9 days after cell seeding, the luminal surface of grafts were covered completely by a prominent, spindle-like endothelial monolayer underneath an even fibrin glue matrix could be seen. Nine days after seeding, the dense condensation of cytoskeleton on the luminal and basal side of cells increased apparently. Four weeks after grafts implantation 8/10 of experimental grafts, with a thickness of intima 80±12 μm, were patent; while the 5 control grafts were occluded. Conclusion The endothelial cell transplantation could effectively increase the patency rate of synthetic blood vessel prosthesis.
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【Key words】 Endothelium Cell, cultured Blood vessel prosthesis transplantation
(Natl Med J China, 1998, 78:135-138)
为了解决人工血管置换病变静脉和小口径动脉后，腔面难以自发性形成内皮细胞衬里，远期通畅率较自体大隐静脉明显低下这一难题。许多作者进行了内皮细胞移植的动物(如狗、猪等)实验，结果令人振奋[1，2]。但是，在此基础上所进行的临床应用研究却令人失望[3]。其主要原因与可供移植的细胞数量稀少或混杂有较多杂细胞有很大关系。本研究将扩增培养的恒河猴自体静脉内皮细胞体衬里于纤维蛋白胶预衬的直径3mm ePTFE人工血管，并进行体内实验。现将结果报道如下。
材料与方法
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一、内皮细胞的获取及培养
行浅表静脉切开，原位插管，冲洗及灌注胶原酶以获取内皮细胞[4]。接种于20 μg/cm2人纤维连接蛋白预衬的3.5 mm培养孔，每周换50%的培养液两次。完全内皮细胞培养液：M199+30%胎牛血清(华美公司)+最适浓度内皮细胞生长补充物[ECGS(由本实验室制备)]；采用微格法技术[5]进行内皮细胞的定量随访。当细胞融合后，分别以1∶6和1∶2的比例进行原代及继代细胞的传代。
用带照相机的Olympus倒置显微镜对培养组织进行形态学研究和监测。
二、内皮细胞的鉴定[5]
1.培养上清液中6-keto-PGF1a和vWF含量测定：当原代、第一代细胞传代前及第二代细胞收获前24小时，更换全部培养液。24小时后，收集条件培养液。计总量。置-20℃冰箱内保存，备用。利用放射免疫法和双抗体夹心固相酶免疫法，分别检测上述条件培养液中6-keto-PGF1a(单位：pg/ml)和vWF的含量。
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2.内皮细胞DNA含量的测定：分别取1×105个原代及第二代细胞。70%酒精固定过夜，加入含有RNA酶的溴化吡啶溶液染色30分钟后，流式细胞仪检测DNA含量。
三、人工血管的基质预衬及细胞种植
取直径0.3cm，长10cm的ePTFE人工血管，用纤维蛋白胶(广州倍特生物技术有限公司)和纤维连接蛋白(上海生物制品研究所)进行基质预衬和细胞种植。纤维蛋白胶组份含16 mg/ml纤维蛋白原，0.1 mg/ml纤维连接蛋白，0.05 U/ml Ⅷ因子，10 000 U/ml抑肽酶；凝血酶组份含50 U/ml凝血酶，40 mmol/ml氯化钙。预衬过程简解如下：
人工血管两开口各插一塑料开关。将2/3 ml纤维蛋白胶溶液灌入人工血管腔内。一端塑料开关关紧，另一开口继续加压灌注剩余纤维蛋白胶溶液。使溶液从人工血管外壁似“汗珠”状渗出。将纤维蛋白胶溶液倒出。取凝血酶组份溶液按上述方法再灌入人工血管内。倒出催化剂溶液。室温静置5分钟。分别用6750 U/100 ml肝素溶液和纯水冲洗人工血管管腔3次。按此法重复2～3次，直至注入催化剂溶液并加压后，人工血管壁停止“出汗”。分别用6750 U/100 ml肝素溶液和超纯水冲洗人工血管管腔3次。Fogarty导管抽拉3次。在上述人工血管内灌入1 m10.5%纤维连接蛋白溶液，室温下静置1小时。
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内皮细胞预衬：倒出人工血管内的纤维连接蛋白溶液，灌入内皮细胞悬液2×106/ml，1 ml。为使内皮细胞分布均匀，特制一玻璃恒温旋转装置。人工血管放入旋转装置内，37℃下以6rph的转速旋转培养2小时。收集人工血管内的溶液，结晶紫法计数溶液中细胞总数，得未贴附细胞数。取上述人工血管两端各0.5 cm，置固定液保存。余下的人工血管置特制的，带滤过装置的培养器内，4 ml/cm2(人工血管面积)完全内皮细胞培养基中继续培养9天。细胞种植结束及体外培养9天末，将人工血管两端各剪下1 cm，以供光镜、扫描电镜和透射电镜检查。
四、手术过程
将15只雄性恒河猴均进行腹主动脉和骼动脉人工血管间搭桥术。其中10只为实验组，使用6 cm长的内皮化人工血管。5只则为对照。于术后当日、第一周及第四周行静脉法数字减影动脉造影。术后第四周行彩色多普勒检查，以了解人工血管及对侧髂总动脉的直径和血流速度。于术后第四周末，在距两吻合口约1 cm处，离断腹主动脉和髂总动脉，将人工血管连同两吻合口一起取出。用D-Hank′s 液冲洗管腔3次。纵行剖开人工血管，切成5 等份样本，供进一步形态学检查。
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五、形态学检查
将标本石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后，行光镜检查。内膜及内膜下组织厚度用微测量尺测定。按照Schuotter等报道的方法准备扫描电镜样本，在S-520扫描电镜下进行观察。透射电镜样本先用0.1%戊二醛和0.16 mmol/L的二甲砷酸钠缓冲液预固定30分钟，而后2%戊二醛固定2小时。经标准的硪化处理和包埋后，用HUE-12A型透射电镜进行观察。
结果
一、恒河猴浅静脉内皮细胞的体外扩增培养
原代细胞接种于塑料培养皿后，细胞贴壁时间在12小时以内，镜下见贴壁细胞呈鹅卵石形，与培养面粘附紧密。接种后3～4天，处于缓慢生长期，细胞增殖缓慢；4天后，细胞生长迅速，进入对数生长期。当细胞数量增加到接种数的7.4±1.8倍时，即可以1∶6的比例进行第一次传代。传代细胞的贴壁时间为2小时。1～2天为静止期，3天后进入对数生长期，在细胞接触抑制形成，开始进入平台期时，以1∶2的比例进行第二次传代培养。整个细胞体外扩增时间为13.89±1.36天，最后收获的细胞总数达(11.46±2.69)×106。较从静脉获取的细胞数增加148±89倍。经免疫荧光检测第Ⅷ因子阳性，透射电镜检查胞浆中有特征性Weible-Palade小体而证实为内皮细胞。流式细胞仪证实为二倍体细胞。
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原代及各次传代内皮细胞培养上清液中6-keto-PGF1a、vWF的含量无显著性差异。
二、内皮细胞的种植
10根人工血管的种入细胞数为(1.76±0.35)×106，未贴附细胞数为(0.10±0.06)×106，实际贴附细胞数(1.66±0.32)×106，贴附率(94.6±3.0)%，实际种植密度(1.98±0.39)×105/cm2。内皮细胞体外衬里于纤维蛋白胶预衬的人工血管经苏木精和伊红染色，光镜下检查：细胞种植后2小时及9天，人工血管腔表面被覆一层均匀的基质，血管壁网眼结构中也有大量基质渗入。基质表面可见内皮细胞内膜。扫描电镜：预衬的基质将人工血管完全覆盖。种植后2小时的人工血管，表面可见内皮细胞呈梭形，形态饱满平行排列呈亚融合状态的细胞单层。内皮细胞单层上可见较多园形皱缩的内皮细胞。孵育9天后，内皮细胞单层完全融合，表面圆缩细胞数量明显减少。透射电镜显示大多数内皮细胞边缘呈绞链状，细胞浆内可见典型的Weible-Palade小体。经9天培养后，细胞边缘绞链状进一步扩展，重叠。并出现典型的紧密连接。在细胞顶部和腔面可见紧密聚集的微丝网。
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图1 内皮化人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，DSA示人工血管通畅(eABVP：内皮化人工血管)
四、内皮化人工血管置换恒河猴动脉
手术后，实验组和对照人工血管数字减影动脉造影显示在术后2小时均通畅，手术后2周实验组有9例通畅(1例于术后12小时死于吻合口破裂出血)，实验组有2例不通畅，3例通畅，术后4周实验组8例通畅(图1)；1例不通畅。对照组则5例全不通畅(图2)。
实验组8例通畅之人工血管与其对应的正常髂总动脉的内径、血流速度和血流量无明显差异。实验组术后4周，实验组人工血管管腔未见血栓形成，两端吻合口无狭窄，人工血管内膜与正常动脉内膜愈合面完整的光滑面。对照5例人工血管全部都有血栓形成可见腔面粗糙，偶见岛状、不规则之内膜样结构。
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图2 ePTFE人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，DSA示人工血管阻塞，侧支形成(CB：侧支血管)
图3 内皮化人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，扫描电镜示人工血管内膜完整 ×700
光镜检查：实验组人工血管腔面有一层连续的内膜。内膜下可见光整均匀的基质。内皮细胞与内膜下组织结合紧密，内膜下组织厚度为80±12 μm；对照组人工血管腔面未见内皮细胞。扫描电镜下可见实验组人工血管腔面内皮细胞紧密镶嵌，细胞呈梭形，胞体突出，排列极性与血流方向一致。未见预衬基质暴露。内膜表面偶见少许红细胞、血小板及白细胞沉积(图3)。对照组5条人工血管腔面均未见内皮细胞；大量纤维蛋白、红细胞、血小板和白细胞沉积(图4)。
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图4 ePTFE人工血管置换恒河猴髂总动脉后4周，扫描电镜示人工血管腔表面未见内皮细胞，大量纤维蛋白，红细胞、血小板等沉积讨论
内皮细胞人工血管的移植成功，关键在于(1)如何得到足够的、高纯度且具有正常生理功能的细胞材料；(2)如何将这些细胞牢固地衬里于人工血管腔面，使其能有效地对抗动脉血流的冲击。
我们将浅表静脉内皮细胞经两周左右的体外扩增培养，细胞数量增加148±89倍，达(11.5±2.7)×106个细胞；纯度99%；能够正常分泌前列环素和vWF；为正常二倍体细胞。以正常血管内皮细胞密度1.2×105个细胞/cm2计，所收获的细胞足以高密度种植83 cm2的人工血管腔面。需要指出的是，种植细胞的纯度对人工血管通畅率的影响很大。相当数量的成纤维细胞和平滑肌细胞污染，会导致严重的血液凝固和假内膜增生，从而引起移植物狭窄以至闭塞。
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Kadletz等[6]发现用胶原和纤维连接蛋白预衬ePTFE人工血管，并种植内皮细胞，置层流液体中一小时，便有一定数量的内皮细胞脱落。将成人大隐静脉内皮细胞种植于纤维连接蛋白预衬ePTFE人工血管，在剪应力作用下16小时，大量细胞丢失。这一现象的原因是细胞骨骼尚未成熟。内皮细胞浆内含有微丝体，称为紧密边缘带，与内皮细胞的粘附有很大关系。内皮细胞单层融合后8天左右即可分化成熟。我们的实验结果表明，继续体外培养9天，内皮细胞顶端和腔面，即 见大量的细胞骨骼，这为内皮细胞衬里于人工血管内表面后，抵抗动脉血流的剪应奠定了坚实的基础。
吻合口狭窄是导致人工血管移植早期失败的主要原因之一。本实验术后当日数字减影动脉造影检查表明对照组和实验组吻合口光滑。因此，对照组术后四周的人工血管闭塞主要与人工血管壁血栓形成较高有很大关系。实验组术后四周人工血管不仅内膜完整，同时内膜组织厚度仅只
80±12 μm。与所衬里的细胞纯度有很大关系。因此，作者认为，使用高纯度的内皮细胞体外衬里的人工血管特别适合置换小口径动脉如股动脉和动脉，这是因为其血栓形成能力低下，内膜组织不易过度增生，从而保证人工血管通畅率提高。
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本课题为国家自然科学基金和广东省自然科学基金资助项
参考文献
1Herring MB, Dilley R, Hersild RA. et al. Seeding artrial prostheses with vasscular endothelium. Ann Surg, 1979, 190:84-94.
2Graham LM. Vinter DW, Ford JW, et al. Endothelial cell seeding on prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Arch Surg, 1980, 115:929-942.
3Herring MB, Leide S, Linbland B, et al: Endothelial seeding PTFE femoral popliteal bypass: The failure of low-density seeding to improve patency. J Vasc Surg, 1994, 11:650-662.
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4潘明新，潘玉先，何红兵，等.恒河猴血管内皮细胞原位获取的实验研究.
第一军医大学学报，1996，16：317-318.
5何红兵，潘玉先，杨继震，等.成人大隐静脉内皮细胞的单次传代、大规模培养.第一军医大学学报，1995，15：187-201.
6Kadletz M, Moser R, Zilla P, et al: In vitro lining of fibronectin coated PTFE grafts with crypreserved saphenous vein endothelial cells. Thorac Cardiovasc Surg, 1987, 35:143-150.
(收稿：1996-11-25 修回：1997-08-13), 百拇医药
单位：510282 广州，第一军医大学附属珠江医院普外科血管外科研究室
关键词：内皮；细胞，培养的；人工血管；移植
New Page 1 【摘要】 目的 为自体内皮细胞移植的临床应用奠定理论基础。方法 将恒河猴表浅静脉内皮细胞在体外培养13.9±1.4天；扩增培养的自体细胞衬里于用纤维蛋白胶预衬的膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管，继续培养9天。15只恒河猴随机分为两组。实验组(10只)用衬有自体静脉内皮细胞的人工血管置换骼总动脉；对照组(5只)用未衬里内皮细胞的人工血管置换。结果 细胞数增加148±89倍。所培养的细胞为二倍体细胞，纯度99%。原代及传代细胞培养上清液中6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)和Von Willebrand因子(vWF)含量差异无显著意义。细胞种植后2小时和9天，人工血管腔面见一层均匀的基质，基质表面有一层连续的内皮细胞单层。内皮细胞紧密排列。呈梭状，形态饱满。实验组除1只于术后12小时因近端吻合口破裂腹腔内出血死亡，1只人工血管于术后4周阻塞外，其余8只恒河猴人工血管术后4周均保持通畅，内膜下组织厚度为80±12 μm；对照组5条人工血管全部阻塞。结论 自体内皮细胞移植可有效地提高人工血管的通畅率。
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Autologous endothelial cell transplantation in meacacos He Hongbing, Pan Mingxin, Pan Yuxian, et al. Vessel Unit, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510282
【Abstract】 Objective To lay a theoretical foundation for the clinical application of autologous endothelial cell transplantation. Methods Macaco endothelial cells derived from superficial veins were cultivated in vitro for 13.89±1.36 days. The multiplied cells were lined in vitro onto the luminal surface of expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) grafts precoated with fibrin glue and fibronectin, then cultivated further for 9 days. 15 macacos were divided randomly into two groups. The common iliac arteries of the exper mental animals (n=10) were replaced with endothelialized grafts, those of control (n=5) with untreated ones. Results The amount of endothelial cells increased for 147.93±88.68 folds. All the cells were diploid cells with a purity of 99%. The content of both 6-keto-PGF1a and vWF in the supernatant of primary and subcultured passages didn′t have significant difference. Two hours and 9 days after cell seeding, the luminal surface of grafts were covered completely by a prominent, spindle-like endothelial monolayer underneath an even fibrin glue matrix could be seen. Nine days after seeding, the dense condensation of cytoskeleton on the luminal and basal side of cells increased apparently. Four weeks after grafts implantation 8/10 of experimental grafts, with a thickness of intima 80±12 μm, were patent; while the 5 control grafts were occluded. Conclusion The endothelial cell transplantation could effectively increase the patency rate of synthetic blood vessel prosthesis.
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【Key words】 Endothelium Cell, cultured Blood vessel prosthesis transplantation
(Natl Med J China, 1998, 78:135-138)
为了解决人工血管置换病变静脉和小口径动脉后，腔面难以自发性形成内皮细胞衬里，远期通畅率较自体大隐静脉明显低下这一难题。许多作者进行了内皮细胞移植的动物(如狗、猪等)实验，结果令人振奋[1，2]。但是，在此基础上所进行的临床应用研究却令人失望[3]。其主要原因与可供移植的细胞数量稀少或混杂有较多杂细胞有很大关系。本研究将扩增培养的恒河猴自体静脉内皮细胞体衬里于纤维蛋白胶预衬的直径3mm ePTFE人工血管，并进行体内实验。现将结果报道如下。
材料与方法
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一、内皮细胞的获取及培养
行浅表静脉切开，原位插管，冲洗及灌注胶原酶以获取内皮细胞[4]。接种于20 μg/cm2人纤维连接蛋白预衬的3.5 mm培养孔，每周换50%的培养液两次。完全内皮细胞培养液：M199+30%胎牛血清(华美公司)+最适浓度内皮细胞生长补充物[ECGS(由本实验室制备)]；采用微格法技术[5]进行内皮细胞的定量随访。当细胞融合后，分别以1∶6和1∶2的比例进行原代及继代细胞的传代。
用带照相机的Olympus倒置显微镜对培养组织进行形态学研究和监测。
二、内皮细胞的鉴定[5]
1.培养上清液中6-keto-PGF1a和vWF含量测定：当原代、第一代细胞传代前及第二代细胞收获前24小时，更换全部培养液。24小时后，收集条件培养液。计总量。置-20℃冰箱内保存，备用。利用放射免疫法和双抗体夹心固相酶免疫法，分别检测上述条件培养液中6-keto-PGF1a(单位：pg/ml)和vWF的含量。
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2.内皮细胞DNA含量的测定：分别取1×105个原代及第二代细胞。70%酒精固定过夜，加入含有RNA酶的溴化吡啶溶液染色30分钟后，流式细胞仪检测DNA含量。
三、人工血管的基质预衬及细胞种植
取直径0.3cm，长10cm的ePTFE人工血管，用纤维蛋白胶(广州倍特生物技术有限公司)和纤维连接蛋白(上海生物制品研究所)进行基质预衬和细胞种植。纤维蛋白胶组份含16 mg/ml纤维蛋白原，0.1 mg/ml纤维连接蛋白，0.05 U/ml Ⅷ因子，10 000 U/ml抑肽酶；凝血酶组份含50 U/ml凝血酶，40 mmol/ml氯化钙。预衬过程简解如下：
人工血管两开口各插一塑料开关。将2/3 ml纤维蛋白胶溶液灌入人工血管腔内。一端塑料开关关紧，另一开口继续加压灌注剩余纤维蛋白胶溶液。使溶液从人工血管外壁似“汗珠”状渗出。将纤维蛋白胶溶液倒出。取凝血酶组份溶液按上述方法再灌入人工血管内。倒出催化剂溶液。室温静置5分钟。分别用6750 U/100 ml肝素溶液和纯水冲洗人工血管管腔3次。按此法重复2～3次，直至注入催化剂溶液并加压后，人工血管壁停止“出汗”。分别用6750 U/100 ml肝素溶液和超纯水冲洗人工血管管腔3次。Fogarty导管抽拉3次。在上述人工血管内灌入1 m10.5%纤维连接蛋白溶液，室温下静置1小时。
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内皮细胞预衬：倒出人工血管内的纤维连接蛋白溶液，灌入内皮细胞悬液2×106/ml，1 ml。为使内皮细胞分布均匀，特制一玻璃恒温旋转装置。人工血管放入旋转装置内，37℃下以6rph的转速旋转培养2小时。收集人工血管内的溶液，结晶紫法计数溶液中细胞总数，得未贴附细胞数。取上述人工血管两端各0.5 cm，置固定液保存。余下的人工血管置特制的，带滤过装置的培养器内，4 ml/cm2(人工血管面积)完全内皮细胞培养基中继续培养9天。细胞种植结束及体外培养9天末，将人工血管两端各剪下1 cm，以供光镜、扫描电镜和透射电镜检查。
四、手术过程
将15只雄性恒河猴均进行腹主动脉和骼动脉人工血管间搭桥术。其中10只为实验组，使用6 cm长的内皮化人工血管。5只则为对照。于术后当日、第一周及第四周行静脉法数字减影动脉造影。术后第四周行彩色多普勒检查，以了解人工血管及对侧髂总动脉的直径和血流速度。于术后第四周末，在距两吻合口约1 cm处，离断腹主动脉和髂总动脉，将人工血管连同两吻合口一起取出。用D-Hank′s 液冲洗管腔3次。纵行剖开人工血管，切成5 等份样本，供进一步形态学检查。
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五、形态学检查
将标本石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后，行光镜检查。内膜及内膜下组织厚度用微测量尺测定。按照Schuotter等报道的方法准备扫描电镜样本，在S-520扫描电镜下进行观察。透射电镜样本先用0.1%戊二醛和0.16 mmol/L的二甲砷酸钠缓冲液预固定30分钟，而后2%戊二醛固定2小时。经标准的硪化处理和包埋后，用HUE-12A型透射电镜进行观察。
结果
一、恒河猴浅静脉内皮细胞的体外扩增培养
原代细胞接种于塑料培养皿后，细胞贴壁时间在12小时以内，镜下见贴壁细胞呈鹅卵石形，与培养面粘附紧密。接种后3～4天，处于缓慢生长期，细胞增殖缓慢；4天后，细胞生长迅速，进入对数生长期。当细胞数量增加到接种数的7.4±1.8倍时，即可以1∶6的比例进行第一次传代。传代细胞的贴壁时间为2小时。1～2天为静止期，3天后进入对数生长期，在细胞接触抑制形成，开始进入平台期时，以1∶2的比例进行第二次传代培养。整个细胞体外扩增时间为13.89±1.36天，最后收获的细胞总数达(11.46±2.69)×106。较从静脉获取的细胞数增加148±89倍。经免疫荧光检测第Ⅷ因子阳性，透射电镜检查胞浆中有特征性Weible-Palade小体而证实为内皮细胞。流式细胞仪证实为二倍体细胞。
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原代及各次传代内皮细胞培养上清液中6-keto-PGF1a、vWF的含量无显著性差异。
二、内皮细胞的种植
10根人工血管的种入细胞数为(1.76±0.35)×106，未贴附细胞数为(0.10±0.06)×106，实际贴附细胞数(1.66±0.32)×106，贴附率(94.6±3.0)%，实际种植密度(1.98±0.39)×105/cm2。内皮细胞体外衬里于纤维蛋白胶预衬的人工血管经苏木精和伊红染色，光镜下检查：细胞种植后2小时及9天，人工血管腔表面被覆一层均匀的基质，血管壁网眼结构中也有大量基质渗入。基质表面可见内皮细胞内膜。扫描电镜：预衬的基质将人工血管完全覆盖。种植后2小时的人工血管，表面可见内皮细胞呈梭形，形态饱满平行排列呈亚融合状态的细胞单层。内皮细胞单层上可见较多园形皱缩的内皮细胞。孵育9天后，内皮细胞单层完全融合，表面圆缩细胞数量明显减少。透射电镜显示大多数内皮细胞边缘呈绞链状，细胞浆内可见典型的Weible-Palade小体。经9天培养后，细胞边缘绞链状进一步扩展，重叠。并出现典型的紧密连接。在细胞顶部和腔面可见紧密聚集的微丝网。
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图1 内皮化人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，DSA示人工血管通畅(eABVP：内皮化人工血管)
四、内皮化人工血管置换恒河猴动脉
手术后，实验组和对照人工血管数字减影动脉造影显示在术后2小时均通畅，手术后2周实验组有9例通畅(1例于术后12小时死于吻合口破裂出血)，实验组有2例不通畅，3例通畅，术后4周实验组8例通畅(图1)；1例不通畅。对照组则5例全不通畅(图2)。
实验组8例通畅之人工血管与其对应的正常髂总动脉的内径、血流速度和血流量无明显差异。实验组术后4周，实验组人工血管管腔未见血栓形成，两端吻合口无狭窄，人工血管内膜与正常动脉内膜愈合面完整的光滑面。对照5例人工血管全部都有血栓形成可见腔面粗糙，偶见岛状、不规则之内膜样结构。
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图2 ePTFE人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，DSA示人工血管阻塞，侧支形成(CB：侧支血管)
图3 内皮化人工血管置换恒河猴髂总动脉后四周，扫描电镜示人工血管内膜完整 ×700
光镜检查：实验组人工血管腔面有一层连续的内膜。内膜下可见光整均匀的基质。内皮细胞与内膜下组织结合紧密，内膜下组织厚度为80±12 μm；对照组人工血管腔面未见内皮细胞。扫描电镜下可见实验组人工血管腔面内皮细胞紧密镶嵌，细胞呈梭形，胞体突出，排列极性与血流方向一致。未见预衬基质暴露。内膜表面偶见少许红细胞、血小板及白细胞沉积(图3)。对照组5条人工血管腔面均未见内皮细胞；大量纤维蛋白、红细胞、血小板和白细胞沉积(图4)。
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图4 ePTFE人工血管置换恒河猴髂总动脉后4周，扫描电镜示人工血管腔表面未见内皮细胞，大量纤维蛋白，红细胞、血小板等沉积讨论
内皮细胞人工血管的移植成功，关键在于(1)如何得到足够的、高纯度且具有正常生理功能的细胞材料；(2)如何将这些细胞牢固地衬里于人工血管腔面，使其能有效地对抗动脉血流的冲击。
我们将浅表静脉内皮细胞经两周左右的体外扩增培养，细胞数量增加148±89倍，达(11.5±2.7)×106个细胞；纯度99%；能够正常分泌前列环素和vWF；为正常二倍体细胞。以正常血管内皮细胞密度1.2×105个细胞/cm2计，所收获的细胞足以高密度种植83 cm2的人工血管腔面。需要指出的是，种植细胞的纯度对人工血管通畅率的影响很大。相当数量的成纤维细胞和平滑肌细胞污染，会导致严重的血液凝固和假内膜增生，从而引起移植物狭窄以至闭塞。
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Kadletz等[6]发现用胶原和纤维连接蛋白预衬ePTFE人工血管，并种植内皮细胞，置层流液体中一小时，便有一定数量的内皮细胞脱落。将成人大隐静脉内皮细胞种植于纤维连接蛋白预衬ePTFE人工血管，在剪应力作用下16小时，大量细胞丢失。这一现象的原因是细胞骨骼尚未成熟。内皮细胞浆内含有微丝体，称为紧密边缘带，与内皮细胞的粘附有很大关系。内皮细胞单层融合后8天左右即可分化成熟。我们的实验结果表明，继续体外培养9天，内皮细胞顶端和腔面，即 见大量的细胞骨骼，这为内皮细胞衬里于人工血管内表面后，抵抗动脉血流的剪应奠定了坚实的基础。
吻合口狭窄是导致人工血管移植早期失败的主要原因之一。本实验术后当日数字减影动脉造影检查表明对照组和实验组吻合口光滑。因此，对照组术后四周的人工血管闭塞主要与人工血管壁血栓形成较高有很大关系。实验组术后四周人工血管不仅内膜完整，同时内膜组织厚度仅只
80±12 μm。与所衬里的细胞纯度有很大关系。因此，作者认为，使用高纯度的内皮细胞体外衬里的人工血管特别适合置换小口径动脉如股动脉和动脉，这是因为其血栓形成能力低下，内膜组织不易过度增生，从而保证人工血管通畅率提高。
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本课题为国家自然科学基金和广东省自然科学基金资助项
参考文献
1Herring MB, Dilley R, Hersild RA. et al. Seeding artrial prostheses with vasscular endothelium. Ann Surg, 1979, 190:84-94.
2Graham LM. Vinter DW, Ford JW, et al. Endothelial cell seeding on prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Arch Surg, 1980, 115:929-942.
3Herring MB, Leide S, Linbland B, et al: Endothelial seeding PTFE femoral popliteal bypass: The failure of low-density seeding to improve patency. J Vasc Surg, 1994, 11:650-662.
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4潘明新，潘玉先，何红兵，等.恒河猴血管内皮细胞原位获取的实验研究.
第一军医大学学报，1996，16：317-318.
5何红兵，潘玉先，杨继震，等.成人大隐静脉内皮细胞的单次传代、大规模培养.第一军医大学学报，1995，15：187-201.
6Kadletz M, Moser R, Zilla P, et al: In vitro lining of fibronectin coated PTFE grafts with crypreserved saphenous vein endothelial cells. Thorac Cardiovasc Surg, 1987, 35:143-150.
(收稿：1996-11-25 修回：1997-08-13), 百拇医药