Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析
作者：吴朝栋 陶其敏
单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；克隆，分子 序列分析
New Page 1 【摘要】 目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转录套式PCR扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒(HCV)E2/NS1基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体pcDNA3上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株HCV(HC-J6)的同源性为88.37%，Ⅱ型中国株HCV(HC-C2)的同源性为70.69%，其推定的氨基酸同源性分别为89.29%和75.55%。结论 基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间E2/NS1基因一级结构的研究将有助于HCV疫苗的研制。
, 百拇医药
Cloning and sequencing of E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus Wu Chaodong, Tao Qimin. Institute of Hepatology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044.
【Abstract】 Objective To clone E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus into mammalian expression vector and analyze its primary nucleotide structure.Methods Reverse transcription nested-PCR methods were employed for amplification E2/NS1 gene which was cloned into mammalian expression vector pcDNA3 by directed clone. Sequence of inserted gene was analyzed by Sanger′s method.Results E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus was cloned into eukaroytic expression vector effectively. Sequence of E2/NS1 showed 88.37% identity in nucleotide and 89.29% in putative amino acid to that of a Japanese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus. Nevertheless it showed 70.69% and 75.55% identity to that of a Chinese genotype Ⅱ isolate of hepatitis C virus.Conclusion E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus was successfully cloned into mammalian expression vector by technique of DNA recombination. Sequence analysis showed that E2/NS1 gene has good homology intra-genotype and poor homology intergenotype of hepatitis C virus. Research of primary nucleotide structure of different genotype hepatitis C virus might be helpful for the development of vaccine against the virus.
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【Key words】 Hepatitis C virus Clone, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78:115-117)
根据丙型肝炎病毒(HCV)基因序列的同源性，以现已建立的HCV基因分型方法研究发现在我国主要的HCV流行株属于基因Ⅱ型和基因Ⅲ型[1]，目前尚未见到有关Ⅲ型中国株HCV的研究。由于HCV E2/NS1基因的编码产物极有望成为疫苗[2]，因而本研究首次构建出插入Ⅲ型中国株HCV
E2/NS1基因片段的真核表达载体，并对其核苷酸的一级结构进行分析。
材料与方法
一、材料
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1.试剂：dNTP，AMV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，Klenow聚合酶，EcoRⅠ，XbaⅠ及T4连接酶均为Promega产品。
2.引物：引物设计参照HC-J6及HC-C2序列[1，3]，(美国Cybersyn公司)，外引物为，1A：5′1390-GGCTCAYTGGGGMGTC，1B：5′2607-GACGACCARSTTCTCT，内引物为，2A：5′1460-ATAGAATTCATGGCCGCCGGSGTKGAC，2B：5′2574-GGTCTAGATTACATCCAYAAGCAGGC(下划线示酶切位点，斜体示起始密码子或终止密码子)。
3.质粒和菌种：哺乳动物细胞表达载体pcDNA3为Invitrogen公司产品，JM109宿主菌为本所保存菌种。
, http://www.100md.com
图1 Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因的核苷酸一级 结构
4.T7、SP6序列分析引物：为Pharmacia产品。
5.HCV感染血清：来自门诊及住院病人。
二、方法
1.HCV RNA提取参照文献[4]。
2.HCV基因分型参照文献[1]。
3.RT-PCR：取RNA模板以引物1B进行逆转录反应。第一次PCR，以引物1A、1B进行扩增反应，条件为94℃60秒，50℃90秒，72℃180秒，30个循环；第二次PCR，以内引物2A、2B进行扩增反应，同第一次PCR反应条件扩增5个循环后，改退火温度为55℃，再扩增25个循环。
, 百拇医药
4.扩增产物的检测及回收：扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，常规法回收阳性扩增产物。
5.质粒构建：回收的E2/NS1产物经Klenow大片段补平后，与pcDNA3质粒分别以EcoRI和XbaI双酶切消化，苯酚氯仿抽提后，以无水乙醇沉淀、沉淀溶于1×TE(pH8.0)中，将目的片段和载体片段按1∶2比例混匀，T4连接酶作用下，于16℃反应20小时。同时制备感受态细胞，冻存于-70℃备用。在连接反应完成后，将连接产物转化感受态细胞，并铺制于含Amp的LB培养基上37℃过夜，次日可见菌落。挑选菌落，小量制备质粒，通过酶切反应筛选重组子。
6.序列测定：采用双脱氧链终止法双向测序。
结果
1.HCV基因5′端非编码区产物酶切分型：从HCV感染血清中，扩增出145 bp片段，属5′非编码区产物，经HaeⅢ酶切后为89 bp和56 bp两个片段，证实为Ⅲ型株HCV感染。
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图2 推定的Ⅲ型中国株HCV E2/NS1氨基酸一级结构
2.HCV E2/NS1基因片段扩增：Ⅲ型HCV株感染血清中，双退火温度PCR扩增后，检测表明扩增产物在PCR分子量标准1.5 kb与994 bp之间，为1.1 kb，与理论值相符。
3.重组质粒的鉴定：通过EcoRⅠ单酶切及EcoRI、XbaⅠ双酶切筛选出含Ⅲ型株HCV E2/NS1基因片段的阳性克隆。EcoRⅠ单酶切产物为6.5 kb片段，EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切产物为5.4 kb及1.1 kb两个片段。E2/NS1基因的克隆片段命名为HC-W14(GenBank. AF023154)。
4.HCV E2/NS1基因序列分析：E2/NS1基因核苷酸一级结构及推定的氨基酸序列见图1和图2，其核苷酸序列和Ⅲ型日本株HC-J6的同源性为88.37%，和Ⅱ型中国株HC-C2的同源性为70.69%。其推定的氨基酸序列同源性则分别为89.29%和75.55%。
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讨论
E2/NS1基因是HCV基因组中变异程度较高的区域，尤其是该区的N末端核苷酸1 156～1 233(氨基酸386～411)最为高变，被称为高变区(HVR1)[5]。针对该区的抗体或针对E2/NS1编码产物糖蛋白E2(gp70)的抗体具有中和作用或保护作用，提示E2/NS1基因编码产物可用于制备疫苗[6]。运用重组E2糖蛋白接种可显示出不同程度的保护性，然而其保护作用却呈HCV株特异性，提示要求运用多价疫苗以起到普遍性保护作用[7]。由于E2/NS1基因在HCV型间的差异，并且国内目前对Ⅲ型中国株HCV认识极少，因而有必要对我国除基因Ⅱ型HCV外的另一流行基因型即Ⅲ型HCV进行研究。表明我国Ⅲ型HCV株与Ⅱ型HCV株在E2/NS1区有一定的差异。推定的E2/NS1氨基酸序列与HC-J6及HC-C2的同源性分别为89.29%和75.55%，其中HCV基因型之间的差异是否提示HCV基因型间的免疫表位因此而有所不同，或者是否与单一基因型HCV E2/NS1编码产物免疫接种后缺乏株间保护作用有关，尚不清楚。E2/NS1基因编码产物呈糖蛋白形式，要求应该在真核表达系统进行表达工作，同时，酵母系统中的表达产物明显存在缺陷，不如哺乳动物细胞中的表达产物更近乎天然蛋白[8]，为此，我们利用上述构建的真核表达载体进行了初步表达工作，表达产物为70 000糖蛋白，能与抗HCV阳性血清反应，表明Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因编码产物有较好的抗原性。
, 百拇医药
本课题为九五攻关及CMB基金资助项目
参考文献
1杜绍财，陶其敏.丙型肝炎及肝癌病人HCV基因分型研究.北京医科大学学报，1992，24：353.
2吴朝栋，陶其敏.丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2研究进展.中华肝脏病杂志，1996，4：245-247.
3Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, et al. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparision with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen, Virol, 1991,72：2697-2704.
, 百拇医药
4杜绍财，陶其敏，孙焱，等.双PCR检测丙型肝炎病毒RNA.
北京医科大学学报，1991，23：429-431.
5Weiner AJ, Braner M, Rosenblatt J, et al.Variable and hypervarible domains are found in the region of HCV corresponding to flaviviruses envelope and NS1 proteins and the pestivirus envelope glycoproteins. Virology, 1991,80：842-848.
6Kojima M, Osuga T, Tsuda F, et al. Influence of antibodies to the slective replication of hepatitis C virus in chimpanzees. Virology, 1994,204：665-672.
, 百拇医药
7Choo QL, Kuo G, Ralaston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91：1294-1298.
8Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein-E2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93：1759-1763.
(收稿：1997-04-16 修回：1997-11-26), http://www.100md.com
单位：100044 北京医科大学人民医院肝病研究所
关键词：肝炎病毒，丙型；克隆，分子 序列分析
New Page 1 【摘要】 目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转录套式PCR扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒(HCV)E2/NS1基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体pcDNA3上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株HCV(HC-J6)的同源性为88.37%，Ⅱ型中国株HCV(HC-C2)的同源性为70.69%，其推定的氨基酸同源性分别为89.29%和75.55%。结论 基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间E2/NS1基因一级结构的研究将有助于HCV疫苗的研制。
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Cloning and sequencing of E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus Wu Chaodong, Tao Qimin. Institute of Hepatology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044.
【Abstract】 Objective To clone E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus into mammalian expression vector and analyze its primary nucleotide structure.Methods Reverse transcription nested-PCR methods were employed for amplification E2/NS1 gene which was cloned into mammalian expression vector pcDNA3 by directed clone. Sequence of inserted gene was analyzed by Sanger′s method.Results E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus was cloned into eukaroytic expression vector effectively. Sequence of E2/NS1 showed 88.37% identity in nucleotide and 89.29% in putative amino acid to that of a Japanese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus. Nevertheless it showed 70.69% and 75.55% identity to that of a Chinese genotype Ⅱ isolate of hepatitis C virus.Conclusion E2/NS1 gene from a Chinese genotype Ⅲ isolate of hepatitis C virus was successfully cloned into mammalian expression vector by technique of DNA recombination. Sequence analysis showed that E2/NS1 gene has good homology intra-genotype and poor homology intergenotype of hepatitis C virus. Research of primary nucleotide structure of different genotype hepatitis C virus might be helpful for the development of vaccine against the virus.
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【Key words】 Hepatitis C virus Clone, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78:115-117)
根据丙型肝炎病毒(HCV)基因序列的同源性，以现已建立的HCV基因分型方法研究发现在我国主要的HCV流行株属于基因Ⅱ型和基因Ⅲ型[1]，目前尚未见到有关Ⅲ型中国株HCV的研究。由于HCV E2/NS1基因的编码产物极有望成为疫苗[2]，因而本研究首次构建出插入Ⅲ型中国株HCV
E2/NS1基因片段的真核表达载体，并对其核苷酸的一级结构进行分析。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
1.试剂：dNTP，AMV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，Klenow聚合酶，EcoRⅠ，XbaⅠ及T4连接酶均为Promega产品。
2.引物：引物设计参照HC-J6及HC-C2序列[1，3]，(美国Cybersyn公司)，外引物为，1A：5′1390-GGCTCAYTGGGGMGTC，1B：5′2607-GACGACCARSTTCTCT，内引物为，2A：5′1460-ATAGAATTCATGGCCGCCGGSGTKGAC，2B：5′2574-GGTCTAGATTACATCCAYAAGCAGGC(下划线示酶切位点，斜体示起始密码子或终止密码子)。
3.质粒和菌种：哺乳动物细胞表达载体pcDNA3为Invitrogen公司产品，JM109宿主菌为本所保存菌种。
, http://www.100md.com
图1 Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因的核苷酸一级 结构
4.T7、SP6序列分析引物：为Pharmacia产品。
5.HCV感染血清：来自门诊及住院病人。
二、方法
1.HCV RNA提取参照文献[4]。
2.HCV基因分型参照文献[1]。
3.RT-PCR：取RNA模板以引物1B进行逆转录反应。第一次PCR，以引物1A、1B进行扩增反应，条件为94℃60秒，50℃90秒，72℃180秒，30个循环；第二次PCR，以内引物2A、2B进行扩增反应，同第一次PCR反应条件扩增5个循环后，改退火温度为55℃，再扩增25个循环。
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4.扩增产物的检测及回收：扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，常规法回收阳性扩增产物。
5.质粒构建：回收的E2/NS1产物经Klenow大片段补平后，与pcDNA3质粒分别以EcoRI和XbaI双酶切消化，苯酚氯仿抽提后，以无水乙醇沉淀、沉淀溶于1×TE(pH8.0)中，将目的片段和载体片段按1∶2比例混匀，T4连接酶作用下，于16℃反应20小时。同时制备感受态细胞，冻存于-70℃备用。在连接反应完成后，将连接产物转化感受态细胞，并铺制于含Amp的LB培养基上37℃过夜，次日可见菌落。挑选菌落，小量制备质粒，通过酶切反应筛选重组子。
6.序列测定：采用双脱氧链终止法双向测序。
结果
1.HCV基因5′端非编码区产物酶切分型：从HCV感染血清中，扩增出145 bp片段，属5′非编码区产物，经HaeⅢ酶切后为89 bp和56 bp两个片段，证实为Ⅲ型株HCV感染。
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图2 推定的Ⅲ型中国株HCV E2/NS1氨基酸一级结构
2.HCV E2/NS1基因片段扩增：Ⅲ型HCV株感染血清中，双退火温度PCR扩增后，检测表明扩增产物在PCR分子量标准1.5 kb与994 bp之间，为1.1 kb，与理论值相符。
3.重组质粒的鉴定：通过EcoRⅠ单酶切及EcoRI、XbaⅠ双酶切筛选出含Ⅲ型株HCV E2/NS1基因片段的阳性克隆。EcoRⅠ单酶切产物为6.5 kb片段，EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切产物为5.4 kb及1.1 kb两个片段。E2/NS1基因的克隆片段命名为HC-W14(GenBank. AF023154)。
4.HCV E2/NS1基因序列分析：E2/NS1基因核苷酸一级结构及推定的氨基酸序列见图1和图2，其核苷酸序列和Ⅲ型日本株HC-J6的同源性为88.37%，和Ⅱ型中国株HC-C2的同源性为70.69%。其推定的氨基酸序列同源性则分别为89.29%和75.55%。
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讨论
E2/NS1基因是HCV基因组中变异程度较高的区域，尤其是该区的N末端核苷酸1 156～1 233(氨基酸386～411)最为高变，被称为高变区(HVR1)[5]。针对该区的抗体或针对E2/NS1编码产物糖蛋白E2(gp70)的抗体具有中和作用或保护作用，提示E2/NS1基因编码产物可用于制备疫苗[6]。运用重组E2糖蛋白接种可显示出不同程度的保护性，然而其保护作用却呈HCV株特异性，提示要求运用多价疫苗以起到普遍性保护作用[7]。由于E2/NS1基因在HCV型间的差异，并且国内目前对Ⅲ型中国株HCV认识极少，因而有必要对我国除基因Ⅱ型HCV外的另一流行基因型即Ⅲ型HCV进行研究。表明我国Ⅲ型HCV株与Ⅱ型HCV株在E2/NS1区有一定的差异。推定的E2/NS1氨基酸序列与HC-J6及HC-C2的同源性分别为89.29%和75.55%，其中HCV基因型之间的差异是否提示HCV基因型间的免疫表位因此而有所不同，或者是否与单一基因型HCV E2/NS1编码产物免疫接种后缺乏株间保护作用有关，尚不清楚。E2/NS1基因编码产物呈糖蛋白形式，要求应该在真核表达系统进行表达工作，同时，酵母系统中的表达产物明显存在缺陷，不如哺乳动物细胞中的表达产物更近乎天然蛋白[8]，为此，我们利用上述构建的真核表达载体进行了初步表达工作，表达产物为70 000糖蛋白，能与抗HCV阳性血清反应，表明Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因编码产物有较好的抗原性。
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本课题为九五攻关及CMB基金资助项目
参考文献
1杜绍财，陶其敏.丙型肝炎及肝癌病人HCV基因分型研究.北京医科大学学报，1992，24：353.
2吴朝栋，陶其敏.丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2研究进展.中华肝脏病杂志，1996，4：245-247.
3Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, et al. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparision with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen, Virol, 1991,72：2697-2704.
, 百拇医药
4杜绍财，陶其敏，孙焱，等.双PCR检测丙型肝炎病毒RNA.
北京医科大学学报，1991，23：429-431.
5Weiner AJ, Braner M, Rosenblatt J, et al.Variable and hypervarible domains are found in the region of HCV corresponding to flaviviruses envelope and NS1 proteins and the pestivirus envelope glycoproteins. Virology, 1991,80：842-848.
6Kojima M, Osuga T, Tsuda F, et al. Influence of antibodies to the slective replication of hepatitis C virus in chimpanzees. Virology, 1994,204：665-672.
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7Choo QL, Kuo G, Ralaston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91：1294-1298.
8Rosa D, Campagnoli S, Moretto C, et al. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein-E2 binding to target cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93：1759-1763.
(收稿：1997-04-16 修回：1997-11-26), http://www.100md.com