子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力的影响
作者：乔杰 杨树标 姚元庆 何柏松
单位：100083 北京医科大学第三医院妇产科(乔杰)；香港大学玛丽医院妇产科(杨树标、姚元庆、何柏松)
关键词：子宫内膜异位症；卵泡液；精子；透明带
中华医学杂志/980207 【摘要】 目的 探讨子宫内膜异位症及非子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力的影响。方法 卵泡液取自20例进行体外授精胚胎移殖的不孕症患者，其中10例为子宫内膜异位症，10例为单纯炎症性输卵管不通。应用半透明带配对研究、培养液EBSS/BSA做为对照，观察子宫内膜异位症及非子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力的影响。结果 经子宫内膜异位症患者卵泡液与非子宫内膜异位症患者卵泡液处理后的精子与透明带结合的数目均明显低于经培养液处理后的精子与透明带结合的数目(91±21与239±35，P<0.001；109±22与
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211±42，P<0.005)，经子宫内膜异位症患者卵泡液处理的精子结合半透明带指数明显低于经非子宫内膜异位症患者卵泡液处理后的精子结合半透明带指数(36±4与54±4，P<0.005)。结论 子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力具有较强的抑制作用，子宫内膜异位症患者卵泡液对配子相互作用的影响可能是其不孕的原因之一。
Follicular fluid from patients with endometriosis decreases the binding of human sperm to zona pellucida in hemizona assay. Qiao Jie, Yang Shubiao, Yao Yuanqing, et al. Beijing Department of Obstetrics and Gynecology, 3rd Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of follicular fluid (FF) from women with endometriosis and tubal factor on sperm binding to zona pellucida under hemizona assay(HZA). Methods
Follicular fluid was collected at IVF from patients with endometriosis and without endometriosis (tubal factor infertility). The HZA was used to study the effect of FF from patients with endometriosis and tubal factor on sperm binding to zona pellucida using media (EBSS/BSA) as control. Results The mean number of sperm binding to zona in endometriosis specimens and tubal factor infertility was significantly fewer than the number treated by culture medium (91±21 vs 239±35, P<0.001; 109±22vs 211±42, P<0.005). The hemizona index was lower when the incubation was performed with FF from endometriosis patients compared with sperm incubated in FF from tubal factor patients (36±4vs 54±4, P<0.005). Conclusions The inhibiting effect of FF from endometriosis patients is stronger than those without endometriosis. The follicular fluid of patients with endometriosis could contribute to infertility through impairment of gamete interaction.
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【Key words】 Endometriosis Follicular fluid Zona pellucida Spermatoza
(Natl Med J China, 1998, 78：98-100)
近年来子宫内膜异位症(简称内膜异位症)与不孕的关系引起广泛的重视，机械性因素被认为是严重内膜异位症引起不孕的原因，轻度内膜异位症引起不孕的病理生理仍不清楚。有些学者提出腹腔液中的某些物质干扰了生殖过程，Asby等[1]及Coddington等[2]报告内膜异位症患者的腹腔液能损害精子的功能并减少紧密结合于透明带上的精子数目，前列腺素、白介素1、肿瘤坏死因子β和转移生长因子可能起了一定的作用。
研究发现卵泡液存在于输卵管并在受精过程中起作用，可能影响顶体反应及精子的活动力[3]。半透明带研究是一种评估精子与透明带紧密结合能力的方法，而精子与透明带结合是受精的关键一步。本研究目的在于评估内膜异位症患者卵泡液与非子宫内膜异位症患者卵泡液对透明带与精子结合能力的不同影响。
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对象与方法
一、对象
对象为香港大学玛丽医院妇产科作体外授精胚胎移植的患者，经腹腔镜检查诊断为内膜异位症10例(所有患者的卵巢表面及后腹膜均有内膜异位病灶，合并或不合并输卵管卵巢轻度粘连，均符合美国不孕症协会一期内膜异位症诊断标准)，单纯炎症性输卵管不通10例。20例患者的年龄25～35岁。
二、卵泡液的收集
应用促性腺激素释放激素类似物、人绝经期促性腺激素及人绒毛膜促性腺激素超促排卵，阴道超声取的卵泡液为含有直径18～29 mm的成熟卵子并且无血液污染的卵泡内液，将1 ml卵泡液600 g离心10分钟，0.2 μm过滤器过滤上清，储存于-20℃，实验时待卵泡液融化后用厄尔氏平衡盐溶液/BSA稀释。
三、精液收集及精子准备
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精液取自不孕症常规检查者，禁欲3～7天后手淫法取出，根据世界卫生组织诊断标准各参数均正常者作为试验标本。精液完全液化后，两步PERCOLL密度梯度离心法分离精子，精液经过PERCOLL密度梯度300g离心20分钟，产生的精子团块用培养液冲洗后再悬浮待用。
四、卵子处理及透明带切开
体外授精工作中显微操作(ICSI)后未受精的卵子储存在生理盐水中备用。应用装配有BEAVER显微利切刀(美国Becton Dickinson Acutecare，Frankin lakes产品)的显微操作仪(日本Nikon公司产)将卵子切成相同的两半，用直径150 μm的微吸管吸净卵浆，得到2个完全相同的半透明带准备作配对研究[4，5]。
五、半透明带分析
每份卵泡液用培养液EBSS/BSA稀释为25%的卵泡液，用25%的卵泡液(试验组)及培养液(对照组)分别处理精子，将2个完全相同的半透明带分别放入试验组及对照组的含有2.5×105个活精子液滴中，表面覆盖100 μl矿物油。精子与透明带在5% CO2 37℃共同孵育3小时后，用直径200 μm的微吸管吸取透明带在EBSS/BSA中冲洗5次以去掉松散结合的精子，在倒置显微镜下观察与精子紧密结合的半透明带，将一透明胶片放在与显微镜相连的显屏上，标记紧密结合的精子并计数。
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精子结合半透明带指数=(试验组精子结合数)/(对照组精子结合数)×100
结果用
±
表示，用配对t检验来比较卵泡液对精子与透明带结合能力的影响，用非配对t检验来比较卵泡液对精子结合半透明带指数的影响。
结果
一、两种不孕症患者卵泡液对精子结合能力影响
内膜异位症患者的卵泡液紧密结合的精子数为91±21，对照组为239±35，两者比较
P<0.001；输卵管炎患者的卵泡液紧密结合的精子数为109±22，对照组为 211±42，两者比较
, 百拇医药
P<0.005。
二、两种不孕症患者卵泡液对精子半透明带指数的影响
经内膜异位症患者卵泡液处理的精子半透明带指数为36±4，经输卵管炎患者卵泡液处理的精子半透明带指数为54±4，两者比较P<0.005。
讨论
内膜异位症是对不孕妇女评估中的常见诊断，目前对该病的多个方面都进行了研究，但是轻度内膜异位症的不孕原因仍不清楚。已有一些研究把注意力放在了内膜异位症对精子的功能及精子与卵子的相互作用的影响上。Coddington等[2]发现，内膜异位症患者的腹腔液对受精的第一步精子与透明带的紧密结合有抑制作用。Aeby等[1]也发现，内膜异位症患者的腹腔液通过影响精子的功能造成不孕。这些抑制作用可能是由于内膜异位症患者的腹腔液含有某些抑制因子，如腹腔液中的一种32 000的蛋白影响精卵融合[6]。另外，也有学者认为内膜异位症直接影响卵巢功能，如Pellicer等[7]应用赠卵模型发现内膜异位症可以引起卵子内部改变从而影响胚胎质量。
, 百拇医药
尽管人类卵泡液抑制精子与透明带结合能力的机制还不清楚，已有研究表明，这种抑制能力可以防止多精子受精并受孕激素调节。孕激素是卵泡液中的主要成份，它可以增强精子与透明带的结合[4]，在动物实验中增加多精子受精[8]。而卵泡液对精子结合透明带能力的抑制在孕激素存在的情况下仍然存在[4]。在IVF培养液中加入猪的卵泡液可以减少精子在透明带上的结合数目，减少多精子受精[9]。本研究结果显示，两组患者的卵泡液均有抑制精子与透明带结合作用，该结果再次肯定了Yao的研究结果，并强调内膜异位症患者的卵泡液较无内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带的结合有更强的抑制作用，过强的抑制作用将影响精子与透明带的结合，从而影响受精过程。这种抑制作用的增强是由于相同抑制因子的增加还是内膜异位症患者的卵泡液含有其它的抑制因子尚不清楚。是否内膜异位症患者的卵泡液与腹腔液含有同一抑制因子尚有待进一步的研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1Asby TC, Huang T，Nakayama RT. The effect of peritoneal fluid from patients with endometriosis on human sperm function in vitro. Am J Obstet Gynecol, 1996, 174:1779-1785.
2Coddington CC, Hansen K, Ohninger S, et al. Peritoneal fluid from patients with endometriosis decreases sperm binding to the zona pellucida in the hemizona assay: a preliminary report. Fertil Steril，1992，57：783-786.
3Edwards RG. Follicular fluid. J Reprod Fertil，1974，37:189-219.
, http://www.100md.com
4Yao YQ, Yeung WSB，Ho PC. Human follicular fluid inhibits the binding of human spermatozoa to zona pellucida in vitro. Human Reprod，1996，11: 2674-2680.
5Yeung WSB, Ng VK, Lau EY, et al. Human oviductal cells and their conditioned medium maintain the motility and hyperactivation of human spermatozoa in vitro. Human Reprod，1994，9:656-660.
6Northnick WB, Curry TE, Muse KN, et al. Detection of a unique 32-kd protein in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril，1988，44：112-119.
, 百拇医药
7Pellicer A, Oliveira N, Ruiz A, et al. Exploring the mechanism of endometriosis-related infertility: an analysis of embryo development and implantation in assisted reproductive. Human Reprod，1995，10(Suppl 2): 91-97.
8Huntr, RHF. Local action of progesterone leading to polyspermic fertilization in pigs. J Reprod Fertil，1972，31:433-444.
9Funahashi H，Day BN. Effects of follicular fluid at fertilization in vitro on sperm penetration in pig oocytes. J Reprod Fertil，1993，99：97-103. (收稿：1997-07-15 修回：1997-11-26), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三医院妇产科(乔杰)；香港大学玛丽医院妇产科(杨树标、姚元庆、何柏松)
关键词：子宫内膜异位症；卵泡液；精子；透明带
中华医学杂志/980207 【摘要】 目的 探讨子宫内膜异位症及非子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力的影响。方法 卵泡液取自20例进行体外授精胚胎移殖的不孕症患者，其中10例为子宫内膜异位症，10例为单纯炎症性输卵管不通。应用半透明带配对研究、培养液EBSS/BSA做为对照，观察子宫内膜异位症及非子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力的影响。结果 经子宫内膜异位症患者卵泡液与非子宫内膜异位症患者卵泡液处理后的精子与透明带结合的数目均明显低于经培养液处理后的精子与透明带结合的数目(91±21与239±35，P<0.001；109±22与
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211±42，P<0.005)，经子宫内膜异位症患者卵泡液处理的精子结合半透明带指数明显低于经非子宫内膜异位症患者卵泡液处理后的精子结合半透明带指数(36±4与54±4，P<0.005)。结论 子宫内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带结合能力具有较强的抑制作用，子宫内膜异位症患者卵泡液对配子相互作用的影响可能是其不孕的原因之一。
Follicular fluid from patients with endometriosis decreases the binding of human sperm to zona pellucida in hemizona assay. Qiao Jie, Yang Shubiao, Yao Yuanqing, et al. Beijing Department of Obstetrics and Gynecology, 3rd Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083
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【Abstract】 Objective To evaluate the effects of follicular fluid (FF) from women with endometriosis and tubal factor on sperm binding to zona pellucida under hemizona assay(HZA). Methods
Follicular fluid was collected at IVF from patients with endometriosis and without endometriosis (tubal factor infertility). The HZA was used to study the effect of FF from patients with endometriosis and tubal factor on sperm binding to zona pellucida using media (EBSS/BSA) as control. Results The mean number of sperm binding to zona in endometriosis specimens and tubal factor infertility was significantly fewer than the number treated by culture medium (91±21 vs 239±35, P<0.001; 109±22vs 211±42, P<0.005). The hemizona index was lower when the incubation was performed with FF from endometriosis patients compared with sperm incubated in FF from tubal factor patients (36±4vs 54±4, P<0.005). Conclusions The inhibiting effect of FF from endometriosis patients is stronger than those without endometriosis. The follicular fluid of patients with endometriosis could contribute to infertility through impairment of gamete interaction.
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【Key words】 Endometriosis Follicular fluid Zona pellucida Spermatoza
(Natl Med J China, 1998, 78：98-100)
近年来子宫内膜异位症(简称内膜异位症)与不孕的关系引起广泛的重视，机械性因素被认为是严重内膜异位症引起不孕的原因，轻度内膜异位症引起不孕的病理生理仍不清楚。有些学者提出腹腔液中的某些物质干扰了生殖过程，Asby等[1]及Coddington等[2]报告内膜异位症患者的腹腔液能损害精子的功能并减少紧密结合于透明带上的精子数目，前列腺素、白介素1、肿瘤坏死因子β和转移生长因子可能起了一定的作用。
研究发现卵泡液存在于输卵管并在受精过程中起作用，可能影响顶体反应及精子的活动力[3]。半透明带研究是一种评估精子与透明带紧密结合能力的方法，而精子与透明带结合是受精的关键一步。本研究目的在于评估内膜异位症患者卵泡液与非子宫内膜异位症患者卵泡液对透明带与精子结合能力的不同影响。
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对象与方法
一、对象
对象为香港大学玛丽医院妇产科作体外授精胚胎移植的患者，经腹腔镜检查诊断为内膜异位症10例(所有患者的卵巢表面及后腹膜均有内膜异位病灶，合并或不合并输卵管卵巢轻度粘连，均符合美国不孕症协会一期内膜异位症诊断标准)，单纯炎症性输卵管不通10例。20例患者的年龄25～35岁。
二、卵泡液的收集
应用促性腺激素释放激素类似物、人绝经期促性腺激素及人绒毛膜促性腺激素超促排卵，阴道超声取的卵泡液为含有直径18～29 mm的成熟卵子并且无血液污染的卵泡内液，将1 ml卵泡液600 g离心10分钟，0.2 μm过滤器过滤上清，储存于-20℃，实验时待卵泡液融化后用厄尔氏平衡盐溶液/BSA稀释。
三、精液收集及精子准备
, http://www.100md.com
精液取自不孕症常规检查者，禁欲3～7天后手淫法取出，根据世界卫生组织诊断标准各参数均正常者作为试验标本。精液完全液化后，两步PERCOLL密度梯度离心法分离精子，精液经过PERCOLL密度梯度300g离心20分钟，产生的精子团块用培养液冲洗后再悬浮待用。
四、卵子处理及透明带切开
体外授精工作中显微操作(ICSI)后未受精的卵子储存在生理盐水中备用。应用装配有BEAVER显微利切刀(美国Becton Dickinson Acutecare，Frankin lakes产品)的显微操作仪(日本Nikon公司产)将卵子切成相同的两半，用直径150 μm的微吸管吸净卵浆，得到2个完全相同的半透明带准备作配对研究[4，5]。
五、半透明带分析
每份卵泡液用培养液EBSS/BSA稀释为25%的卵泡液，用25%的卵泡液(试验组)及培养液(对照组)分别处理精子，将2个完全相同的半透明带分别放入试验组及对照组的含有2.5×105个活精子液滴中，表面覆盖100 μl矿物油。精子与透明带在5% CO2 37℃共同孵育3小时后，用直径200 μm的微吸管吸取透明带在EBSS/BSA中冲洗5次以去掉松散结合的精子，在倒置显微镜下观察与精子紧密结合的半透明带，将一透明胶片放在与显微镜相连的显屏上，标记紧密结合的精子并计数。
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精子结合半透明带指数=(试验组精子结合数)/(对照组精子结合数)×100
结果用
±表示，用配对t检验来比较卵泡液对精子与透明带结合能力的影响，用非配对t检验来比较卵泡液对精子结合半透明带指数的影响。结果
一、两种不孕症患者卵泡液对精子结合能力影响
内膜异位症患者的卵泡液紧密结合的精子数为91±21，对照组为239±35，两者比较
P<0.001；输卵管炎患者的卵泡液紧密结合的精子数为109±22，对照组为 211±42，两者比较
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P<0.005。
二、两种不孕症患者卵泡液对精子半透明带指数的影响
经内膜异位症患者卵泡液处理的精子半透明带指数为36±4，经输卵管炎患者卵泡液处理的精子半透明带指数为54±4，两者比较P<0.005。
讨论
内膜异位症是对不孕妇女评估中的常见诊断，目前对该病的多个方面都进行了研究，但是轻度内膜异位症的不孕原因仍不清楚。已有一些研究把注意力放在了内膜异位症对精子的功能及精子与卵子的相互作用的影响上。Coddington等[2]发现，内膜异位症患者的腹腔液对受精的第一步精子与透明带的紧密结合有抑制作用。Aeby等[1]也发现，内膜异位症患者的腹腔液通过影响精子的功能造成不孕。这些抑制作用可能是由于内膜异位症患者的腹腔液含有某些抑制因子，如腹腔液中的一种32 000的蛋白影响精卵融合[6]。另外，也有学者认为内膜异位症直接影响卵巢功能，如Pellicer等[7]应用赠卵模型发现内膜异位症可以引起卵子内部改变从而影响胚胎质量。
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尽管人类卵泡液抑制精子与透明带结合能力的机制还不清楚，已有研究表明，这种抑制能力可以防止多精子受精并受孕激素调节。孕激素是卵泡液中的主要成份，它可以增强精子与透明带的结合[4]，在动物实验中增加多精子受精[8]。而卵泡液对精子结合透明带能力的抑制在孕激素存在的情况下仍然存在[4]。在IVF培养液中加入猪的卵泡液可以减少精子在透明带上的结合数目，减少多精子受精[9]。本研究结果显示，两组患者的卵泡液均有抑制精子与透明带结合作用，该结果再次肯定了Yao的研究结果，并强调内膜异位症患者的卵泡液较无内膜异位症患者卵泡液对精子与透明带的结合有更强的抑制作用，过强的抑制作用将影响精子与透明带的结合，从而影响受精过程。这种抑制作用的增强是由于相同抑制因子的增加还是内膜异位症患者的卵泡液含有其它的抑制因子尚不清楚。是否内膜异位症患者的卵泡液与腹腔液含有同一抑制因子尚有待进一步的研究。
参考文献
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1Asby TC, Huang T，Nakayama RT. The effect of peritoneal fluid from patients with endometriosis on human sperm function in vitro. Am J Obstet Gynecol, 1996, 174:1779-1785.
2Coddington CC, Hansen K, Ohninger S, et al. Peritoneal fluid from patients with endometriosis decreases sperm binding to the zona pellucida in the hemizona assay: a preliminary report. Fertil Steril，1992，57：783-786.
3Edwards RG. Follicular fluid. J Reprod Fertil，1974，37:189-219.
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4Yao YQ, Yeung WSB，Ho PC. Human follicular fluid inhibits the binding of human spermatozoa to zona pellucida in vitro. Human Reprod，1996，11: 2674-2680.
5Yeung WSB, Ng VK, Lau EY, et al. Human oviductal cells and their conditioned medium maintain the motility and hyperactivation of human spermatozoa in vitro. Human Reprod，1994，9:656-660.
6Northnick WB, Curry TE, Muse KN, et al. Detection of a unique 32-kd protein in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril，1988，44：112-119.
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7Pellicer A, Oliveira N, Ruiz A, et al. Exploring the mechanism of endometriosis-related infertility: an analysis of embryo development and implantation in assisted reproductive. Human Reprod，1995，10(Suppl 2): 91-97.
8Huntr, RHF. Local action of progesterone leading to polyspermic fertilization in pigs. J Reprod Fertil，1972，31:433-444.
9Funahashi H，Day BN. Effects of follicular fluid at fertilization in vitro on sperm penetration in pig oocytes. J Reprod Fertil，1993，99：97-103. (收稿：1997-07-15 修回：1997-11-26), 百拇医药