食管癌临床标本的荧光原位杂交分析
作者：肖枫 王秀琴 王明荣 郑杰 吴旻
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：
荧光原位杂交
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是新近发展起来的使用荧光标记及相应的检测系统的NISH技术[1]。使用这一技术不仅可确定常规技术无法发现或判定的染色体改变，而且可在间期核中发现某些染色体改变，因而在肿瘤细胞遗传学研究方面具有特殊的重要意义。
我们采用癌组织、手术切端组织，原代培养、冰冻切片和细胞滴片，对35例食管癌临床标本作了FISH检测分析。
, 百拇医药 一、材料与方法
1.标本：均取自本院食管癌手术患者，术后2～4小时由病理科医生取材。患者诊断均以病理切片证实。取材前均未接受放射治疗和化学治疗。
2.10例细胞染色体标本制备：按常规方法制备标本。-20℃保存。
3.6例细胞滴片：置含胶原酶、15%小牛血清、青、链霉素的M199培养液中37℃消化培养18小时左右，常规方法低渗、固定制片，-20℃保存。
4.19例冰冻切片：切片厚6μm，丙酮固定15分钟，-20℃冻存。
5.FISH按[2]的方法。着丝粒探针FISH、探针：D8Z2、D17Z1，染色体涂染探针，2p、2q、3p(美国国立卫生研究院关新元博士惠赠)。
, 百拇医药 二、结果
1.35例食管癌原代培养、细胞滴片、冰冻切片的染色体数目改变：FISH分析每例计数150～300个间期核，结果癌组织中8号三体有6例，四体有2例；手术切端组织中三体有4例，四体有1例。癌组织中7号单体有2例，三体有3例；手术切端组织中三体有1例。
2.10例原代培养细胞的染色体结构畸变：染色体涂染显示，染色体2p缺失和染色体3p易位各3例和2例。
三、讨论
细胞遗传学分析对象是中期分裂相染色体，而人体组织的大部分细胞并不进行分裂，实体瘤细胞也是如此，要获得实体瘤中期染色体需经细胞培养及相应处理，不但费时费力，且很难得到足够的中期分裂相。间期核FISH检测，省去了制备肿瘤中期分裂相的麻烦。在检测染色体数目方面也较G带方法准确。因无染色体识别的困难。用冰冻切片作间期核FISH时，由于细胞被切为几个层面分配到几张切片上，造成细胞染色质人为丢失，误认是染色体数目减少，切片越薄，产生这种误差的可能性就越大。切片过厚，又会减低探针与靶DNA的可及性，影响杂交效果。我们采用6μm，杂交效果较好，大都能出现杂交信号。但无法避免细胞染 色质不全的可能。染色体以数目增多为主。8号染色体增加在癌组织中占22.8%(8/35)，手术切端组织中占14.7%(5/34)。主要表现为三体型和四体型。17号染色体增多在癌组织和手术切端组织中分别是3/33和1/33，17号染色体减少在癌组织中占2/33。
, 百拇医药
Rabbitts[3]认为，肿瘤细胞遗传学的主要改变是：缺失、易位和倒位。Nowell[4]则认为，虽然染色体易位在实体瘤中存在，但基因扩增和缺失较易位更常见。我们检出的食管癌各种畸变中，以缺失、扩增和易位为主。肿瘤染色体的扩增片段中有扩增的癌基因，而缺失片 段中有丢失的抑癌基因。染色体易位结果至少有两种情况，一种是激活原癌基因如c-myc的激活方式，一种是产生融合基因，可产生肿瘤特异融合蛋白。这两种情况常干扰正常转录调节，影响下游靶基因的活性[3]
参考文献
1Pinkel, D. Straume, T. Gray, J W. Cytogenetic anlysis using quantitive, high-sensitivity, fluorenscence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83：2934-2938.
, 百拇医药
2Trask B J. DNA sequence in metaphase and interphase cells by fluorescence in situ hybridization. Chapter 1. Methods in Cell Biology. Academic Press Inc. 1991-35：3-35.
3Rabbitts T H. Chromosomal translocation in human cancer. Nature, 1994, 372：143-149.
4Nawell, P C. Biologic of disease, cancer, chromosomes, and genes. Laboratory
Investigation, 1992, 66：407-417.
(收稿：1997-03-19 修回：1997-09-23), 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室
关键词：
荧光原位杂交
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是新近发展起来的使用荧光标记及相应的检测系统的NISH技术[1]。使用这一技术不仅可确定常规技术无法发现或判定的染色体改变，而且可在间期核中发现某些染色体改变，因而在肿瘤细胞遗传学研究方面具有特殊的重要意义。
我们采用癌组织、手术切端组织，原代培养、冰冻切片和细胞滴片，对35例食管癌临床标本作了FISH检测分析。
, 百拇医药 一、材料与方法
1.标本：均取自本院食管癌手术患者，术后2～4小时由病理科医生取材。患者诊断均以病理切片证实。取材前均未接受放射治疗和化学治疗。
2.10例细胞染色体标本制备：按常规方法制备标本。-20℃保存。
3.6例细胞滴片：置含胶原酶、15%小牛血清、青、链霉素的M199培养液中37℃消化培养18小时左右，常规方法低渗、固定制片，-20℃保存。
4.19例冰冻切片：切片厚6μm，丙酮固定15分钟，-20℃冻存。
5.FISH按[2]的方法。着丝粒探针FISH、探针：D8Z2、D17Z1，染色体涂染探针，2p、2q、3p(美国国立卫生研究院关新元博士惠赠)。
, 百拇医药 二、结果
1.35例食管癌原代培养、细胞滴片、冰冻切片的染色体数目改变：FISH分析每例计数150～300个间期核，结果癌组织中8号三体有6例，四体有2例；手术切端组织中三体有4例，四体有1例。癌组织中7号单体有2例，三体有3例；手术切端组织中三体有1例。
2.10例原代培养细胞的染色体结构畸变：染色体涂染显示，染色体2p缺失和染色体3p易位各3例和2例。
三、讨论
细胞遗传学分析对象是中期分裂相染色体，而人体组织的大部分细胞并不进行分裂，实体瘤细胞也是如此，要获得实体瘤中期染色体需经细胞培养及相应处理，不但费时费力，且很难得到足够的中期分裂相。间期核FISH检测，省去了制备肿瘤中期分裂相的麻烦。在检测染色体数目方面也较G带方法准确。因无染色体识别的困难。用冰冻切片作间期核FISH时，由于细胞被切为几个层面分配到几张切片上，造成细胞染色质人为丢失，误认是染色体数目减少，切片越薄，产生这种误差的可能性就越大。切片过厚，又会减低探针与靶DNA的可及性，影响杂交效果。我们采用6μm，杂交效果较好，大都能出现杂交信号。但无法避免细胞染 色质不全的可能。染色体以数目增多为主。8号染色体增加在癌组织中占22.8%(8/35)，手术切端组织中占14.7%(5/34)。主要表现为三体型和四体型。17号染色体增多在癌组织和手术切端组织中分别是3/33和1/33，17号染色体减少在癌组织中占2/33。
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Rabbitts[3]认为，肿瘤细胞遗传学的主要改变是：缺失、易位和倒位。Nowell[4]则认为，虽然染色体易位在实体瘤中存在，但基因扩增和缺失较易位更常见。我们检出的食管癌各种畸变中，以缺失、扩增和易位为主。肿瘤染色体的扩增片段中有扩增的癌基因，而缺失片 段中有丢失的抑癌基因。染色体易位结果至少有两种情况，一种是激活原癌基因如c-myc的激活方式，一种是产生融合基因，可产生肿瘤特异融合蛋白。这两种情况常干扰正常转录调节，影响下游靶基因的活性[3]
参考文献
1Pinkel, D. Straume, T. Gray, J W. Cytogenetic anlysis using quantitive, high-sensitivity, fluorenscence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83：2934-2938.
, 百拇医药
2Trask B J. DNA sequence in metaphase and interphase cells by fluorescence in situ hybridization. Chapter 1. Methods in Cell Biology. Academic Press Inc. 1991-35：3-35.
3Rabbitts T H. Chromosomal translocation in human cancer. Nature, 1994, 372：143-149.
4Nawell, P C. Biologic of disease, cancer, chromosomes, and genes. Laboratory
Investigation, 1992, 66：407-417.
(收稿：1997-03-19 修回：1997-09-23), 百拇医药