促红细胞生成素与一氧化氮合酶抑制剂对肝硬化大鼠高动力循环状态的影响
作者：黄颖秋 萧树东 张德中 莫剑忠
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院消化疾病研究所[黄颖秋现在辽宁省本溪市本溪钢铁公司总医院(邮政编码117000)消化科工作]
关键词：一氧化氮；促红素；肝硬化；血红蛋白
中华医学杂志/980219 【摘要】 目的 观察促红细胞生成素(简称促红素)或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对肝硬化大鼠高动力循环状态的影响。方法 制造肝硬化大鼠模型，用L-NAME(0.5 mg*kg-1*d-1)胃管内注入或促红素(100 U/kg)皮下注射治疗2周；用57Co标记微球技术，观察大鼠血流动力学指标；用荧光比色法测血清一氧化氮(NO)含量。结果 肝硬化大鼠全部出现高动力循环状态，血清NO含量显著高于正常对照组。促红素和L-NAME治疗组高动力循环状态明显改善，血清NO含量均显著低于肝硬化未治疗组。结论 小剂量L-NAME可逆转肝硬化大鼠的高动力循环状态；促红素致Hb增高，进而加速NO灭活，对肝硬化高动力循环可能具有潜在治疗作用。
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Effects of erythropoietin or nitric oxide synthesis inhibitor on hyperdynamic circulatory state in cirrhotic rats. Huang Yingqiu, Xiao Shudong, Zhang Dezhong, et al. Shanghai Institute of Digestive Disease, Ren Ji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To observe the effects of erythropoietin or nitric oxide synthesis (NOS) inhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) on hyperdynamic circulatory state in rats with cirrhosis.Methods Cirrhotic rat model was made. Cirrhotic rats were treated with NOS inhibitor L-NAME (0.5 mg*kg-1*d-1) by gavage or with erythropoietin (100U/kg) injected subcutaneously for two weeks. The hemodynamic parameters in cirrhotic rats treated with L-NAME or with erythropoietin were determined by using 57Co-labled microsphere technique. Serum nitric oxide (NO) levels were also measured by using a fluorometric assay.Results Hyperdynamic circulatory state was observed in all rats with cirrhosis. Serum NO levels in cirrhotic rats were significantly higher than that in normal controls. Hyperdynamic circulation status in cirrhotic rats treated with erythropoietin or with L-NAME was markedly attenuated. As compared with untreated-cirrhotic rats, serum NO concentration in erythropoietin-treated and L-NAME-treated cirrhotic rats were significantly lower. Conclusion L-NAME treatment could reverse the hyperdynamic circulatory state in cirrhotic rats which might be ameliorated by inactivation of overproduced NO by increasing hemoglobin with erythropoietin.
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【Key words】 Nitric oxide Erythropoietin Hepatocirrhosis Hemoglobin
(Natl Med J China, 1998, 78：139-142)
肝硬化患者或动物模型几乎不可避免地出现高心输出量、高内脏血流灌注及低外周血管阻力的高动力循环状态[1]。研究发现，静注一氧化氮合酶(NOS)抑制剂可迅速逆转肝硬化大鼠的血压降低，并使已升高的心输出量及内脏血流量下降[2]，但其长期治疗效果却罕见报道。此外，离体研究证实，血红蛋白与一氧化氮(NO)结合形成正铁血红蛋白或亚硝基血红蛋白而致NO失活[3]。而有关这方面的体内研究亦知之甚少。为此，我们应用57Co同位素标记微球技术，连续观察2周促红细胞生成素(简称促红素)治疗致Hb增高或NOS抑制剂L-NAME胃管内注入对肝硬化大鼠血流动力学的影响，旨在探讨NO在肝硬化高动力循环状态中的致病作用，并为临床治疗提供理论依据。
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材料与方法
一、动物模型制备
雄性SD大鼠(中国科学院上海实验动物中心提供)，体重200±25 g。皮下注射60%CCl4油性溶液(60%CCl4、40%精制茶油)，0.3 ml/100 g(首次剂量加倍)，每4天注射1次，共注射24次，同时以10%乙醇代替饮水。
二、动物分组
模型建立后，随机分为促红素治疗组、L-NAME治疗组和肝硬化未治疗组三组。每组8只。前两组分别于皮下注射促红素(epoetin beta, 德国Boehringer Mannheim公司)，100 U/kg，隔日1次及胃管内注入L-NAME(Sigma产品，美国)，0.5 mg/kg，每日1次，二组均治疗2周；第三组不予处理，观察2周。此外，另随机取同批正常SD大鼠8只作为对照组。
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三、血流动力学研究方法[4]
实验动物禁食18小时，以盐酸氯氨酮100 mg/kg肌肉内注射麻醉，将大鼠固定于恒温手术台上，直肠温度保持在37±0.5℃，室温控制在22～24℃。在手术显微镜引导下，从右股动脉插入一根PE50导管至腹主动脉，导管经换能器连于生理监护仪(Lifescope 6)；从右股静脉插入一根PE50导管至下腔静脉；从右颈总动脉插入一根PE50导管至左心室；左上腹部纵行切口1.5～2.0 cm，轻拉脾脏至切口外。以上操作结束10分钟后，记录平均动脉压(MAP)；用4号头皮针(经换能器连于监护仪)刺入脾实质内间接测量门静脉压力(PP)[5]；从右颈总动脉导管注入大约5万个57Co同位素标记微球(直径15±0.6 μm, DuPont公司，美国)，注入前10分钟开始从右股动脉导管抽取参考血样，以1 ml/min的速度抽血70 s(WZ-50微量注射机，浙江医科大学)；从右股静脉导管采血3 ml，其中1 ml送检测Hb，余2 ml分离血清，置-70℃储存备检；上述操作结束15分钟后，处死动物，取小块肝组织置10%甲醛液中固定，备形态学检查，然后取出胃、脾、胰、肾、肠和肠系膜分别称重，切成小块分置于γ-计数管内，用γ计数仪(GP-1，上海电子仪器厂)测定放射活性(cpm/min)。
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四、血流动力学指标计算方法
心输出量(CO)(ml/min)=注入57Co(cpm)×参考血样(ml/min)/参考血样57Co(cpm)
心脏指数(CI)(ml*min-1*100 g-1)=CO(ml/min)/体重%
内脏器官血流量(ml/min)=脏器57Co(cpm)×参考血样(ml/min)/参考血样57Co(cpm)
门静脉血流量(PVI)=胃+脾+肠+肠系膜+胰腺血流量
内脏血管阻力(SVR)和门静脉阻力(PVR)计算公式为：
, 百拇医药 SVR(kPa*ml-1*min-1)=MAP-PP(kPa)/PVI(ml/min)
PVR(kPa*ml-1*min-1)=PP(kPa)/PVI(ml/min)
五、血清NO测定
参见文献[6，7]。简言之，取血清加20%磺基水杨酸钠去蛋白，离心后取上清加入0.01 mol/L EDTA，再加入2.3-二氨基萘(DAN)(Fluka产品，瑞士)盐酸溶液混匀，20℃反应10分钟，加入2.8 mol/L NaOH溶液终止反应，在F-4 000荧光分光光度计(Hitachi公司，日本)上以激发波长365 nm，发射波长420 nm，狭缝3 nm测相对荧光强度(F值)，以亚硝酸钠(NaNO2)溶液作标准曲线，计算血清中NO-2/NO-3浓度，以此代表NO含量。
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六、血样Hb测定
除L-NAME治疗组外，其余3组以氰化血红蛋白比色法(hemacomp 10全血细胞计数仪，意大利)测定血Hb含量。
七、肝脏组织学检查
常规10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏形态学改变。
八、统计学处理
结果以
±s表示，行方差分析。
结果
一、肝硬化大鼠模型
模型大鼠肝脾肿大明显增加，肝脏质地变硬，边缘变钝，表面凹凸不平呈结节状；光镜示肝细胞再生、脂肪变性、纤维组织增生及假小叶形成。8只未治疗鼠，有6只出现腹水，其中2只并发胸水。
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二、血流动力学检测结果
与对照组比较，未治疗鼠MAP和SVR显著降低，CO、CI及PP显著升高；促红素治疗组和L-NAME治疗组高动力循环状态均明显改善，血流动力学指标几乎接近正常水平(与对照组比较，P>0.05)(表1)。
三、内脏器官血流量
未治疗组除脾脏血流量降低外，余内脏器官血流量均显著高于对照组(P<0.01)，而促红素治疗组和L-NAME治疗组除脾脏血流量无显著变化外，余内脏器官血流量均显著低于未治疗组，且几乎接近正常水平(与对照组比较，P>0.05)(表2)。
四、血液Hb和NO含量
未治疗组普遍存在Hb含量降低和血清NO含量增高；而与之比较，促红素治疗组则Hb显著增高，两个治疗组血清NO含量均明显降低(表3)。
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表1 各组大鼠血流动力学指标(±s) 组别鼠数
鼠数
MAP
PP
CO
CI
PVI
SVR
PVR
正常对
照组
8
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17.5±0.3
1.12±0.10
136±4
39.7±1.6
3.76±0.09
4.23±0.12
0.299±0.026
未治疗组
8
14.4±0.5*
1.67±0.07*
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55.9±1.8*
4.30±0.16*
2.97±0.19*
0.388±0.011*
L-NAME
治疗组
8
16.3±0.3△
1.28±0.10△
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147±9△
43.0±3.0△
3.66±0.03△
4.08±0.07△
0.323±0.029△
促红素
治疗组
8
16.3±0.4
1.48±0.04
145±7
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42.1±1.7△
3.67±0.20
4.63±0.22
0.404±0.024
与对照组比较：* P<0.01，与未治疗组比较：△ P<0.01；血流动力学指标单位：MAP、PP单位为kPa，CO：ml/min，CI：ml*min-1*100g-1, PVI: ml*min-1*100g-1, SVR:kPa*ml-1*min-1*100g-1, PVR:kPa*ml-1*min-1*100g-1，1 kPa=7.5 mmHg表2 各组动物内脏器官血流量(ml*min-1*g-1，±s) 组 别
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鼠数
胃
脾
胰
肠和肠系膜
肾
正常对照组
8
0.544±0.045
0.946±0.060
0.819±0.031
1.451±0.037
0.465±0.038
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未治疗组
8
0.881±0.065*
0.725±0.057*
0.998±0.055*
1.686±0.057*
0.686±0.046*
L-NAME治疗组
8
0.593±0.015△
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0.744±0.055△
0.837±0.088△
1.481±0.082△
0.468±0.079△
促红素治疗组
8
0.582±0.027△
0.737±0.061*
0.855±0.042△
1.495±0.087△
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0.447±0.041△
与对照组比较：* P<0.01，与未治疗组比较：△ P<0.01表3 各组血Hb和NO含量(±s) 组别
鼠数
Hb(g/L)
NO-12/NO-13/(μmol/L)
正常对照组
8
181±11
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0.53±0.26
未治疗组
8
120±15*
4.20±1.25*
促红素治疗组
8
166±13△
1.14±0.62*△
L-NAME治疗组
8
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1.47±0.91*△
与对照组比较：* P<0.01；与未治疗组比较：△ P<0.01讨论
本实验中8只未治疗肝硬化大鼠全部出现高动力循环状态，其中6只出现腹水，2只同时并发胸水。业已证实，导致这种血流动力学异常的主要原因为动脉血管扩张。而内皮源性NO通过直接舒张血管和/或降低内皮对缩血管物质的反应性可能在此血流动力学异常中起重要作用。NO由NOS介导产生，并通过其第二信使cGMP发挥作用。因此，竞争性抑制NOS，使NO合成和释出减少，可能成为逆转高动力循环状态的一种手段。NOS抑制剂的这种短期治疗效果已得到证实[2]，倘若使其疗效长期得以维持，无疑对临床应用更有裨益。
NO半衰期甚短，常以其代谢产物NO-2/NO-3表示。而常用的Griess法因灵敏度低使检测受到限制。根据2,3-二氨基萘(DAN)在酸性条件下与NO反应生成荧光物质1-(H)-萘三唑原理，我们应用荧光分光光度法测定血清中的NO含量，使检测灵敏度明显提高。
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本实验结果显示，肝硬化未治疗组血清NO含量显著高于正常对照组(P<0.01)，而两组治疗鼠随着高动力循环状态的明显改善，血清NO含量亦显著下降，这至少说明NO在此种血流动力学改变中具有重要作用。我们应用57Co同位素标记微球技术观察发现，小剂量L-NAME连续2周胃管内注入治疗，不仅使血清NO含量下降，而且使肝硬化大鼠血流动力学指标明显改善，几乎接近于正常水平。这与Niederberger等[8]报道的结果一致。他们应用热稀释法检测大鼠血流动力学指标，并以动脉壁中cGMP含量间接反应NO浓度，结果发现，L-NAME不仅使肝硬化大鼠高动力循环状态明显改善，并使动脉匀浆中cGMP含量降至正常。
体外研究证实，NO能迅速与脱氧血红蛋白(Hb[Fe2+])结合，形成相对稳态的Hb[Fe2+]NO复合物，并将氧合血红蛋白转化成正铁血红蛋白，而致NO灭活[9]。这一发现无疑对应用Hb逆转高动力循环状态提供一条新思路。我们的实验结果显示，肝硬化大鼠普遍存在Hb降低，这可能与脾功能亢进致红细胞破坏增加有关。我们还发现，促红素治疗组随着Hb含量的回升，不仅血清NO含量明显低于肝硬化未治疗组(P<0.01)，而且血流动力学参数亦显著改善，说明NO在高动力循环状态中具有致病作用，同时亦提示，增加血红蛋白确可清除NO。尽管我们采用的动物模型和检测方法与Casadevall等[10]人不同，但结果基本一致。他们用氢气清除法仅对门脉高压鼠的胃粘膜血流量进行评估。结果发现，促红素可明显减少门脉高压鼠增加的胃粘膜血流量，并显著升高其降低的动脉压和血管阻力。
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值得一提的是，本实验中除脾脏血流量较对照组降低外，未治疗组其它脏器血流量均显著增高。这或许与肝硬化导致脾脏明显肿大而使每单位重量脾组织血流量相对下降有关。
总之，内源性NO在肝硬化血流动力学改变中起重要作用。小剂量NOS抑制剂长期治疗可明显逆转肝硬化大鼠的高动力循环状态。促红素致Hb增高，从而加速NO灭活对肝硬化高动力循环可能具有潜在治疗作用。
志谢 本课题承外科陈治平教授、吴志勇教授提供手术器械
参考文献
1黄颖秋，莫剑忠，张德中.血管活性物质与肝硬化血液动力学改变.
国外医学内科学分册，1997，24：55-58.
2Lee FY, Colombato LA, Albillos A, et al. NW-Nitro-L-arginine administration corrects peripheral vasodilatation and systemic capillary hypotension and ameliorates plasm volume expansion and sodium retention in portal hypertensive rats. Hepatology, 1993,17：84-90.
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3Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991,43：109-142.
4Nagasawa M, Kawasaki T, Yoshimi T. Effects of calcium antagonists on hapatic and systemic hemodynamics in awake portal hypertensive rats. J Gastroenterol, 1996,31：366-372.
5Benoit JN, Womack WA, Hernandez L, et al. "Forward" and "backward" flow mechanisms of portal hypertension relative contributions in the rat model of portal vein stenosis. Gastroenterology, 1985,89：1092-1096.
, 百拇医药
6Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, et al. A fluorometric assay for the measurement of nitrite in biological samples. Anal Biochem, 1993,214：11-16.
7Damiani P, Burini G. Fluorometric determination of nitrite. Talanta, 1986,33：649-652.
8Niederberger M, Martin PY, Gines P, et al. Normalization of nitric oxide production corrects arterial vasodilation and hyperdynamic circulation in cirrhotic rats. Gastroenterology, 1995,109：1624-1630.
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9Scharfstein JS, Keaney JF, Slivka JA, et al. In vivo transfer of nitric oxide between a plasma protein-bound reservoir and low molecular weight thiols. J Clin Invest, 1994,94：1432-1439.
10Casadevall M, Pique JM, Cirera I, et al. Increased blood hemoglobin attenuates splanchnic vasodilation in portal-hypertensive rats by nitric oxide inactivation. Gastroenterology, 1996,110：1156-1165.(收稿：1997-01-22 修回：1997-10-10), 百拇医药
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院消化疾病研究所[黄颖秋现在辽宁省本溪市本溪钢铁公司总医院(邮政编码117000)消化科工作]
关键词：一氧化氮；促红素；肝硬化；血红蛋白
中华医学杂志/980219 【摘要】 目的 观察促红细胞生成素(简称促红素)或一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对肝硬化大鼠高动力循环状态的影响。方法 制造肝硬化大鼠模型，用L-NAME(0.5 mg*kg-1*d-1)胃管内注入或促红素(100 U/kg)皮下注射治疗2周；用57Co标记微球技术，观察大鼠血流动力学指标；用荧光比色法测血清一氧化氮(NO)含量。结果 肝硬化大鼠全部出现高动力循环状态，血清NO含量显著高于正常对照组。促红素和L-NAME治疗组高动力循环状态明显改善，血清NO含量均显著低于肝硬化未治疗组。结论 小剂量L-NAME可逆转肝硬化大鼠的高动力循环状态；促红素致Hb增高，进而加速NO灭活，对肝硬化高动力循环可能具有潜在治疗作用。
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Effects of erythropoietin or nitric oxide synthesis inhibitor on hyperdynamic circulatory state in cirrhotic rats. Huang Yingqiu, Xiao Shudong, Zhang Dezhong, et al. Shanghai Institute of Digestive Disease, Ren Ji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To observe the effects of erythropoietin or nitric oxide synthesis (NOS) inhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) on hyperdynamic circulatory state in rats with cirrhosis.Methods Cirrhotic rat model was made. Cirrhotic rats were treated with NOS inhibitor L-NAME (0.5 mg*kg-1*d-1) by gavage or with erythropoietin (100U/kg) injected subcutaneously for two weeks. The hemodynamic parameters in cirrhotic rats treated with L-NAME or with erythropoietin were determined by using 57Co-labled microsphere technique. Serum nitric oxide (NO) levels were also measured by using a fluorometric assay.Results Hyperdynamic circulatory state was observed in all rats with cirrhosis. Serum NO levels in cirrhotic rats were significantly higher than that in normal controls. Hyperdynamic circulation status in cirrhotic rats treated with erythropoietin or with L-NAME was markedly attenuated. As compared with untreated-cirrhotic rats, serum NO concentration in erythropoietin-treated and L-NAME-treated cirrhotic rats were significantly lower. Conclusion L-NAME treatment could reverse the hyperdynamic circulatory state in cirrhotic rats which might be ameliorated by inactivation of overproduced NO by increasing hemoglobin with erythropoietin.
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【Key words】 Nitric oxide Erythropoietin Hepatocirrhosis Hemoglobin
(Natl Med J China, 1998, 78：139-142)
肝硬化患者或动物模型几乎不可避免地出现高心输出量、高内脏血流灌注及低外周血管阻力的高动力循环状态[1]。研究发现，静注一氧化氮合酶(NOS)抑制剂可迅速逆转肝硬化大鼠的血压降低，并使已升高的心输出量及内脏血流量下降[2]，但其长期治疗效果却罕见报道。此外，离体研究证实，血红蛋白与一氧化氮(NO)结合形成正铁血红蛋白或亚硝基血红蛋白而致NO失活[3]。而有关这方面的体内研究亦知之甚少。为此，我们应用57Co同位素标记微球技术，连续观察2周促红细胞生成素(简称促红素)治疗致Hb增高或NOS抑制剂L-NAME胃管内注入对肝硬化大鼠血流动力学的影响，旨在探讨NO在肝硬化高动力循环状态中的致病作用，并为临床治疗提供理论依据。
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材料与方法
一、动物模型制备
雄性SD大鼠(中国科学院上海实验动物中心提供)，体重200±25 g。皮下注射60%CCl4油性溶液(60%CCl4、40%精制茶油)，0.3 ml/100 g(首次剂量加倍)，每4天注射1次，共注射24次，同时以10%乙醇代替饮水。
二、动物分组
模型建立后，随机分为促红素治疗组、L-NAME治疗组和肝硬化未治疗组三组。每组8只。前两组分别于皮下注射促红素(epoetin beta, 德国Boehringer Mannheim公司)，100 U/kg，隔日1次及胃管内注入L-NAME(Sigma产品，美国)，0.5 mg/kg，每日1次，二组均治疗2周；第三组不予处理，观察2周。此外，另随机取同批正常SD大鼠8只作为对照组。
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三、血流动力学研究方法[4]
实验动物禁食18小时，以盐酸氯氨酮100 mg/kg肌肉内注射麻醉，将大鼠固定于恒温手术台上，直肠温度保持在37±0.5℃，室温控制在22～24℃。在手术显微镜引导下，从右股动脉插入一根PE50导管至腹主动脉，导管经换能器连于生理监护仪(Lifescope 6)；从右股静脉插入一根PE50导管至下腔静脉；从右颈总动脉插入一根PE50导管至左心室；左上腹部纵行切口1.5～2.0 cm，轻拉脾脏至切口外。以上操作结束10分钟后，记录平均动脉压(MAP)；用4号头皮针(经换能器连于监护仪)刺入脾实质内间接测量门静脉压力(PP)[5]；从右颈总动脉导管注入大约5万个57Co同位素标记微球(直径15±0.6 μm, DuPont公司，美国)，注入前10分钟开始从右股动脉导管抽取参考血样，以1 ml/min的速度抽血70 s(WZ-50微量注射机，浙江医科大学)；从右股静脉导管采血3 ml，其中1 ml送检测Hb，余2 ml分离血清，置-70℃储存备检；上述操作结束15分钟后，处死动物，取小块肝组织置10%甲醛液中固定，备形态学检查，然后取出胃、脾、胰、肾、肠和肠系膜分别称重，切成小块分置于γ-计数管内，用γ计数仪(GP-1，上海电子仪器厂)测定放射活性(cpm/min)。
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四、血流动力学指标计算方法
心输出量(CO)(ml/min)=注入57Co(cpm)×参考血样(ml/min)/参考血样57Co(cpm)
心脏指数(CI)(ml*min-1*100 g-1)=CO(ml/min)/体重%
内脏器官血流量(ml/min)=脏器57Co(cpm)×参考血样(ml/min)/参考血样57Co(cpm)
门静脉血流量(PVI)=胃+脾+肠+肠系膜+胰腺血流量
内脏血管阻力(SVR)和门静脉阻力(PVR)计算公式为：
, 百拇医药 SVR(kPa*ml-1*min-1)=MAP-PP(kPa)/PVI(ml/min)
PVR(kPa*ml-1*min-1)=PP(kPa)/PVI(ml/min)
五、血清NO测定
参见文献[6，7]。简言之，取血清加20%磺基水杨酸钠去蛋白，离心后取上清加入0.01 mol/L EDTA，再加入2.3-二氨基萘(DAN)(Fluka产品，瑞士)盐酸溶液混匀，20℃反应10分钟，加入2.8 mol/L NaOH溶液终止反应，在F-4 000荧光分光光度计(Hitachi公司，日本)上以激发波长365 nm，发射波长420 nm，狭缝3 nm测相对荧光强度(F值)，以亚硝酸钠(NaNO2)溶液作标准曲线，计算血清中NO-2/NO-3浓度，以此代表NO含量。
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六、血样Hb测定
除L-NAME治疗组外，其余3组以氰化血红蛋白比色法(hemacomp 10全血细胞计数仪，意大利)测定血Hb含量。
七、肝脏组织学检查
常规10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏形态学改变。
八、统计学处理
结果以
±s表示，行方差分析。结果
一、肝硬化大鼠模型
模型大鼠肝脾肿大明显增加，肝脏质地变硬，边缘变钝，表面凹凸不平呈结节状；光镜示肝细胞再生、脂肪变性、纤维组织增生及假小叶形成。8只未治疗鼠，有6只出现腹水，其中2只并发胸水。
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二、血流动力学检测结果
与对照组比较，未治疗鼠MAP和SVR显著降低，CO、CI及PP显著升高；促红素治疗组和L-NAME治疗组高动力循环状态均明显改善，血流动力学指标几乎接近正常水平(与对照组比较，P>0.05)(表1)。
三、内脏器官血流量
未治疗组除脾脏血流量降低外，余内脏器官血流量均显著高于对照组(P<0.01)，而促红素治疗组和L-NAME治疗组除脾脏血流量无显著变化外，余内脏器官血流量均显著低于未治疗组，且几乎接近正常水平(与对照组比较，P>0.05)(表2)。
四、血液Hb和NO含量
未治疗组普遍存在Hb含量降低和血清NO含量增高；而与之比较，促红素治疗组则Hb显著增高，两个治疗组血清NO含量均明显降低(表3)。
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表1 各组大鼠血流动力学指标(
±s) 组别鼠数鼠数
MAP
PP
CO
CI
PVI
SVR
PVR
正常对
照组
8
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17.5±0.3
1.12±0.10
136±4
39.7±1.6
3.76±0.09
4.23±0.12
0.299±0.026
未治疗组
8
14.4±0.5*
1.67±0.07*
, http://www.100md.com 190±9*
55.9±1.8*
4.30±0.16*
2.97±0.19*
0.388±0.011*
L-NAME
治疗组
8
16.3±0.3△
1.28±0.10△
, 百拇医药
147±9△
43.0±3.0△
3.66±0.03△
4.08±0.07△
0.323±0.029△
促红素
治疗组
8
16.3±0.4
1.48±0.04
145±7
, http://www.100md.com
42.1±1.7△
3.67±0.20
4.63±0.22
0.404±0.024
与对照组比较：* P<0.01，与未治疗组比较：△ P<0.01；血流动力学指标单位：MAP、PP单位为kPa，CO：ml/min，CI：ml*min-1*100g-1, PVI: ml*min-1*100g-1, SVR:kPa*ml-1*min-1*100g-1, PVR:kPa*ml-1*min-1*100g-1，1 kPa=7.5 mmHg表2 各组动物内脏器官血流量(ml*min-1*g-1，
±s) 组 别, http://www.100md.com
鼠数
胃
脾
胰
肠和肠系膜
肾
正常对照组
8
0.544±0.045
0.946±0.060
0.819±0.031
1.451±0.037
0.465±0.038
, 百拇医药
未治疗组
8
0.881±0.065*
0.725±0.057*
0.998±0.055*
1.686±0.057*
0.686±0.046*
L-NAME治疗组
8
0.593±0.015△
, 百拇医药
0.744±0.055△
0.837±0.088△
1.481±0.082△
0.468±0.079△
促红素治疗组
8
0.582±0.027△
0.737±0.061*
0.855±0.042△
1.495±0.087△
, http://www.100md.com
0.447±0.041△
与对照组比较：* P<0.01，与未治疗组比较：△ P<0.01表3 各组血Hb和NO含量(
±s) 组别鼠数
Hb(g/L)
NO-12/NO-13/(μmol/L)
正常对照组
8
181±11
, 百拇医药
0.53±0.26
未治疗组
8
120±15*
4.20±1.25*
促红素治疗组
8
166±13△
1.14±0.62*△
L-NAME治疗组
8
, 百拇医药
1.47±0.91*△
与对照组比较：* P<0.01；与未治疗组比较：△ P<0.01讨论
本实验中8只未治疗肝硬化大鼠全部出现高动力循环状态，其中6只出现腹水，2只同时并发胸水。业已证实，导致这种血流动力学异常的主要原因为动脉血管扩张。而内皮源性NO通过直接舒张血管和/或降低内皮对缩血管物质的反应性可能在此血流动力学异常中起重要作用。NO由NOS介导产生，并通过其第二信使cGMP发挥作用。因此，竞争性抑制NOS，使NO合成和释出减少，可能成为逆转高动力循环状态的一种手段。NOS抑制剂的这种短期治疗效果已得到证实[2]，倘若使其疗效长期得以维持，无疑对临床应用更有裨益。
NO半衰期甚短，常以其代谢产物NO-2/NO-3表示。而常用的Griess法因灵敏度低使检测受到限制。根据2,3-二氨基萘(DAN)在酸性条件下与NO反应生成荧光物质1-(H)-萘三唑原理，我们应用荧光分光光度法测定血清中的NO含量，使检测灵敏度明显提高。
, http://www.100md.com
本实验结果显示，肝硬化未治疗组血清NO含量显著高于正常对照组(P<0.01)，而两组治疗鼠随着高动力循环状态的明显改善，血清NO含量亦显著下降，这至少说明NO在此种血流动力学改变中具有重要作用。我们应用57Co同位素标记微球技术观察发现，小剂量L-NAME连续2周胃管内注入治疗，不仅使血清NO含量下降，而且使肝硬化大鼠血流动力学指标明显改善，几乎接近于正常水平。这与Niederberger等[8]报道的结果一致。他们应用热稀释法检测大鼠血流动力学指标，并以动脉壁中cGMP含量间接反应NO浓度，结果发现，L-NAME不仅使肝硬化大鼠高动力循环状态明显改善，并使动脉匀浆中cGMP含量降至正常。
体外研究证实，NO能迅速与脱氧血红蛋白(Hb[Fe2+])结合，形成相对稳态的Hb[Fe2+]NO复合物，并将氧合血红蛋白转化成正铁血红蛋白，而致NO灭活[9]。这一发现无疑对应用Hb逆转高动力循环状态提供一条新思路。我们的实验结果显示，肝硬化大鼠普遍存在Hb降低，这可能与脾功能亢进致红细胞破坏增加有关。我们还发现，促红素治疗组随着Hb含量的回升，不仅血清NO含量明显低于肝硬化未治疗组(P<0.01)，而且血流动力学参数亦显著改善，说明NO在高动力循环状态中具有致病作用，同时亦提示，增加血红蛋白确可清除NO。尽管我们采用的动物模型和检测方法与Casadevall等[10]人不同，但结果基本一致。他们用氢气清除法仅对门脉高压鼠的胃粘膜血流量进行评估。结果发现，促红素可明显减少门脉高压鼠增加的胃粘膜血流量，并显著升高其降低的动脉压和血管阻力。
, 百拇医药
值得一提的是，本实验中除脾脏血流量较对照组降低外，未治疗组其它脏器血流量均显著增高。这或许与肝硬化导致脾脏明显肿大而使每单位重量脾组织血流量相对下降有关。
总之，内源性NO在肝硬化血流动力学改变中起重要作用。小剂量NOS抑制剂长期治疗可明显逆转肝硬化大鼠的高动力循环状态。促红素致Hb增高，从而加速NO灭活对肝硬化高动力循环可能具有潜在治疗作用。
志谢 本课题承外科陈治平教授、吴志勇教授提供手术器械
参考文献
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国外医学内科学分册，1997，24：55-58.
2Lee FY, Colombato LA, Albillos A, et al. NW-Nitro-L-arginine administration corrects peripheral vasodilatation and systemic capillary hypotension and ameliorates plasm volume expansion and sodium retention in portal hypertensive rats. Hepatology, 1993,17：84-90.
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3Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev, 1991,43：109-142.
4Nagasawa M, Kawasaki T, Yoshimi T. Effects of calcium antagonists on hapatic and systemic hemodynamics in awake portal hypertensive rats. J Gastroenterol, 1996,31：366-372.
5Benoit JN, Womack WA, Hernandez L, et al. "Forward" and "backward" flow mechanisms of portal hypertension relative contributions in the rat model of portal vein stenosis. Gastroenterology, 1985,89：1092-1096.
, 百拇医药
6Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, et al. A fluorometric assay for the measurement of nitrite in biological samples. Anal Biochem, 1993,214：11-16.
7Damiani P, Burini G. Fluorometric determination of nitrite. Talanta, 1986,33：649-652.
8Niederberger M, Martin PY, Gines P, et al. Normalization of nitric oxide production corrects arterial vasodilation and hyperdynamic circulation in cirrhotic rats. Gastroenterology, 1995,109：1624-1630.
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9Scharfstein JS, Keaney JF, Slivka JA, et al. In vivo transfer of nitric oxide between a plasma protein-bound reservoir and low molecular weight thiols. J Clin Invest, 1994,94：1432-1439.
10Casadevall M, Pique JM, Cirera I, et al. Increased blood hemoglobin attenuates splanchnic vasodilation in portal-hypertensive rats by nitric oxide inactivation. Gastroenterology, 1996,110：1156-1165.(收稿：1997-01-22 修回：1997-10-10), 百拇医药