应用煮沸法-半套式-聚合酶链反应快速检测汉坦病毒感染
作者：张斌 白雪帆 刘安 杨为松
单位：710028 西安，第四军医大学唐都医院(张斌、白雪帆、杨为松)；西安市儿童医院(刘安)
关键词：
中华传染病杂980218 汉坦病毒的早期诊断是肾综合征出血热(HFRS)有效防治的关键。在聚合酶链反应(PCR)应用于汉坦病毒RNA的检测中，抽提RNA是十分重要的一步，而传统采用胍酚法抽提RNA，需经过酚氯仿抽提、酒精沉淀等冗长的过程，为此，我们尝试用煮沸法抽提汉坦病毒RNA，并结合半套式-PCR进行HFRS的临床检测，现报告如下。
材料和方法
一、血清样本
收集HFRS患者血清45份(经临床确诊和IFA证实阳性)，发病时间：23例<1周，15例1～2周，7例>2周。收集入院后怀疑HFRS但IFA(-)的患者血清及正常人血清(均经血清学证实)各10份。
, http://www.100md.com
二、病毒及病毒的细胞培养
取汉坦病毒76-118株接种于长成单层的Vero-E6细胞上，待IFA阳性时留取上清，空斑滴定其病毒含量(PFU/ml)。
三、引物的设计及合成
参照文献[1，2]在汉坦病毒S基因片段的保守区设计3条引物，即S15′-AGCATGAAGGCAGAAGAG-3′上游引物、S2 5′-ACAAGCATGTTGGTGGACC-3′下游引物和S3 5′-TGTATCCCCATTGATTGTG-3′下游引物。其中S1和S3构成外引物，S1和S2构成内引物，扩增片段长度为403bp，以上引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。
四、RNA提取
采用两种方法：1.经典法。参照文献[3]进行；2.煮沸法。取血清或病毒上清50μl与20μl裂解液(10mmol/L Tris HCl pH8.0,1mmol/L EDTA,0.9mol/L NaCl,0.2mol/L盐酸胍，1%NP-40)在室温下充分混匀后，煮8分钟，14 000r/min离心5分钟，取4μl上清用于逆转录。
, 百拇医药
五、逆转录-PCR
将4μl RNA提取上清加入16μl RT-PCR混合液中(逆转录缓冲液中含2mmol/L dNTPs,1μmol/L S1和S3引物，8U RNasin,2U AMV,0.5U Tag酶)，42°C保温30分钟，再按94°C30秒，55℃35秒，72℃40秒，循环30次。
六、半套式-PCR
取上述扩增产物1μl加入19μl半套式PCR混合液中(PCR缓冲液中含2mmol/L dNTPs,1μmol/L S1和S2引物，0.5U Tag酶)，按上述循环参数再循环30次。取10μl扩增产物在含0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖电泳15分钟，紫外观察结果并照相。整个实验从RNA提取开始设阳性及阴性对照。
结 果
一、敏感性及特异性分析
, 百拇医药
取76-118株病毒上清(0.5×106PFU/ml)进行10倍系列稀释后平行扩增并重复试验，结果经典法可检测到10-4稀释后的病毒上清，而煮沸法可检测到10-5稀释后的病毒上清。其扩增产物经HindⅢ酶切得到与预计大小一致的酶切片段(即225bp,175bp)。
二、临床检测
在45份IFA阳性的HFRS患者血清检测中，1周以内检出23例(23/23)，1～2周9例(9/15)，2周后1例(1/7)。在10份IFA阴性但怀疑HFRS的患者血清检测中，3例为阳性，经进一步临床跟踪观察，2例于1周后IFA转变成阳性。
讨 论
在汉坦病毒RNA的抽提中，目前常用的胍酚法至少需2小时才能完成，不仅流程繁琐，而且需与酚氯仿等有毒化学品接触。煮沸法不仅可行，而且有较好的敏感性和特异性，抽提RNA可在半小时内完成。本研究所建立的PCR检测方法还具有下列特点：(1) 将逆转录与第一次PCR在单管中完成，不仅快速方便，而且可减少污染；(2) 采用半套式引物及将反应体系控制在20μl，不仅经济，而且实用。
, 百拇医药
在临床检测中，1周以内的HFRS患者血清检出率达100%，而2周后低于20%，表明获取早期标本对于提高检出率具有十分重要的意义，这与汉坦病毒感染为一过性病毒血症及临床早期提倡抗病毒治疗的观点相吻合。另外在10份IFA阴性但怀疑HFRS的初入院患者血清检测中，阳检率达30%，经进一步跟踪观察，与临床基本吻合，表明RT-PCR可弥补IFA检测的不足。本研究采用煮沸法抽提RNA，并结合半套式PCR进行汉坦病毒的检测，是一种特异、敏感、快速的基因诊断方法，为肾综合征出血热的临床诊断和进一步的分子生物学的研究奠定了基础。
(感谢全军基因诊断中心郭晏海硕士的帮助)
参考文献
1 Arikawa J,Lapenotieve HF,Iacono-connors L,et al.Coding properties of the S and the M segments of Sapporoa rat virus:comparison to other causa-tive agents of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome. Virology,1990,176:114-125.
2 Kim EC,Kim IS,Choi Y,et al.Rapid differentiation between Hantaan and seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis.J Med Virol,1994,43:245-248.
3 白雪帆，黄长形，孙永涛，等.聚合酶链反应技术用于汉坦病毒的基因分型.第四军医大学学报，1996，17：112-115., 百拇医药
单位：710028 西安，第四军医大学唐都医院(张斌、白雪帆、杨为松)；西安市儿童医院(刘安)
关键词：
中华传染病杂980218 汉坦病毒的早期诊断是肾综合征出血热(HFRS)有效防治的关键。在聚合酶链反应(PCR)应用于汉坦病毒RNA的检测中，抽提RNA是十分重要的一步，而传统采用胍酚法抽提RNA，需经过酚氯仿抽提、酒精沉淀等冗长的过程，为此，我们尝试用煮沸法抽提汉坦病毒RNA，并结合半套式-PCR进行HFRS的临床检测，现报告如下。
材料和方法
一、血清样本
收集HFRS患者血清45份(经临床确诊和IFA证实阳性)，发病时间：23例<1周，15例1～2周，7例>2周。收集入院后怀疑HFRS但IFA(-)的患者血清及正常人血清(均经血清学证实)各10份。
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二、病毒及病毒的细胞培养
取汉坦病毒76-118株接种于长成单层的Vero-E6细胞上，待IFA阳性时留取上清，空斑滴定其病毒含量(PFU/ml)。
三、引物的设计及合成
参照文献[1，2]在汉坦病毒S基因片段的保守区设计3条引物，即S15′-AGCATGAAGGCAGAAGAG-3′上游引物、S2 5′-ACAAGCATGTTGGTGGACC-3′下游引物和S3 5′-TGTATCCCCATTGATTGTG-3′下游引物。其中S1和S3构成外引物，S1和S2构成内引物，扩增片段长度为403bp，以上引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。
四、RNA提取
采用两种方法：1.经典法。参照文献[3]进行；2.煮沸法。取血清或病毒上清50μl与20μl裂解液(10mmol/L Tris HCl pH8.0,1mmol/L EDTA,0.9mol/L NaCl,0.2mol/L盐酸胍，1%NP-40)在室温下充分混匀后，煮8分钟，14 000r/min离心5分钟，取4μl上清用于逆转录。
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五、逆转录-PCR
将4μl RNA提取上清加入16μl RT-PCR混合液中(逆转录缓冲液中含2mmol/L dNTPs,1μmol/L S1和S3引物，8U RNasin,2U AMV,0.5U Tag酶)，42°C保温30分钟，再按94°C30秒，55℃35秒，72℃40秒，循环30次。
六、半套式-PCR
取上述扩增产物1μl加入19μl半套式PCR混合液中(PCR缓冲液中含2mmol/L dNTPs,1μmol/L S1和S2引物，0.5U Tag酶)，按上述循环参数再循环30次。取10μl扩增产物在含0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖电泳15分钟，紫外观察结果并照相。整个实验从RNA提取开始设阳性及阴性对照。
结 果
一、敏感性及特异性分析
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取76-118株病毒上清(0.5×106PFU/ml)进行10倍系列稀释后平行扩增并重复试验，结果经典法可检测到10-4稀释后的病毒上清，而煮沸法可检测到10-5稀释后的病毒上清。其扩增产物经HindⅢ酶切得到与预计大小一致的酶切片段(即225bp,175bp)。
二、临床检测
在45份IFA阳性的HFRS患者血清检测中，1周以内检出23例(23/23)，1～2周9例(9/15)，2周后1例(1/7)。在10份IFA阴性但怀疑HFRS的患者血清检测中，3例为阳性，经进一步临床跟踪观察，2例于1周后IFA转变成阳性。
讨 论
在汉坦病毒RNA的抽提中，目前常用的胍酚法至少需2小时才能完成，不仅流程繁琐，而且需与酚氯仿等有毒化学品接触。煮沸法不仅可行，而且有较好的敏感性和特异性，抽提RNA可在半小时内完成。本研究所建立的PCR检测方法还具有下列特点：(1) 将逆转录与第一次PCR在单管中完成，不仅快速方便，而且可减少污染；(2) 采用半套式引物及将反应体系控制在20μl，不仅经济，而且实用。
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在临床检测中，1周以内的HFRS患者血清检出率达100%，而2周后低于20%，表明获取早期标本对于提高检出率具有十分重要的意义，这与汉坦病毒感染为一过性病毒血症及临床早期提倡抗病毒治疗的观点相吻合。另外在10份IFA阴性但怀疑HFRS的初入院患者血清检测中，阳检率达30%，经进一步跟踪观察，与临床基本吻合，表明RT-PCR可弥补IFA检测的不足。本研究采用煮沸法抽提RNA，并结合半套式PCR进行汉坦病毒的检测，是一种特异、敏感、快速的基因诊断方法，为肾综合征出血热的临床诊断和进一步的分子生物学的研究奠定了基础。
(感谢全军基因诊断中心郭晏海硕士的帮助)
参考文献
1 Arikawa J,Lapenotieve HF,Iacono-connors L,et al.Coding properties of the S and the M segments of Sapporoa rat virus:comparison to other causa-tive agents of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome. Virology,1990,176:114-125.
2 Kim EC,Kim IS,Choi Y,et al.Rapid differentiation between Hantaan and seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis.J Med Virol,1994,43:245-248.
3 白雪帆，黄长形，孙永涛，等.聚合酶链反应技术用于汉坦病毒的基因分型.第四军医大学学报，1996，17：112-115., 百拇医药