血吸虫病兔直肠壁一氧化氮合成酶的免疫组化分析
作者：李中明 陈茂平 胡仁崇 刘金斗 张雅芳 杨镇
单位：4300033 武汉，军工总医院(李中明、陈茂平、胡仁崇、刘金斗、张雅芳)；同济医科大学同济医院(杨镇)
关键词：一氧化氮；直肠；血吸虫病兔
中华传染病杂980206 【摘要】 目的 研究一氧化氮(NO)在血吸虫直肠肉芽肿发病机制中的作用。方法 采用腹部敷贴法建立血吸虫病兔模型，SP免疫组化法分析结构型和诱导型一氧化氮合成酶(cNOS和iNOS)在正常兔和血吸虫病兔直肠壁的表达与分布。结果 正常兔直肠壁cNOS和iNOS呈阴性反应，血吸虫病兔直肠壁为强阳性，cNOS主要分布在粘膜毛细血管和粘膜下血管壁；iNOS不仅见于上述血管壁，而且见于虫卵、虫卵肉芽肿周围、纤维结缔组织中、炎性细胞之间。结论 NO在血吸虫直肠肉芽肿发病机制中具有重要作用。
Immunohistochemical observation of nitric oxide synthetase in rectum of rabbits infected with S. japonicum Li Zhongming, Cheng Maoping, Hu Renchong, et al. Wuhan General Hospital of PLA Factories, Wuhan 430033
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective The objective of the study was to investigate the role of nitric oxide (NO) in the pathogenesis of rectum granuloma formation. Methods Rabbits were infected with cercaria of S. japonicum percutaneously. The SP immunohistochemical technique was used to analyse the expression and localization of cNOS and iNOS in the rectums of normal and schistosoma rabbits. Results Immunostaining of cNOS and iNOS were negative in the rectums of normal rabbits, whereas the results in the of rabbits infected with S. japonicum were strong positive. The positive immunostaining of cNOS was observed in mucosal capillaries and submucosal vessels. Besides in capillaries and submucosal vessels the positive immunostaining of iNOS was seen in schistosoma ova, ova granuloma, fibroconnective tissue and suppuratie cells. Conclusion The NO may play an important role in the pathogenesis of rectum ova granuloma.
, 百拇医药
【Key words】 Nitric oxide Rectum Schistosomasis rabbits
晚期血吸虫病主要分为巨脾型、腹水型、侏儒型和结肠增厚型四种。直肠增殖主要由直肠肉芽肿形成，可以导致下消化道出血、狭窄、梗阻、甚至恶变。一氧化氮(NO)是一种细胞信使分子，它的生物学作用涉及机体的各个系统[1]。NO是否能参与形成直肠肉芽肿，作者迄今尚未见报道。本实验采用免疫组化技术，观察血吸虫病兔直肠壁结构型和诱导型一氧化氮合成酶(cNOS和iNOS)的分布与表达。旨在探讨NO在血吸虫病直肠肉芽肿形成中的意义。
材料与方法
一、动物模型
雄性大耳白兔40只，体重2～3kg。采用腹部敷贴法感染采自湖北钉螺(Oncomelania hupensis)的尾蚴，兔腹部剪毛，滴以含蚴液(尾蚴数200±5条/只)，玻片覆盖15分钟，形成急性感染，感染后3、4、5个月各取3只动物供实验。以正常兔作对照。
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二、取材方法
动物麻醉后剖腹取肝组织和一段直肠，10%福尔马林固定24小时，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。浸蜡和包埋温度控制在65℃以下，以防破坏组织的抗原性。连续切片，厚4μm，分别作H.E、Masson三色染色和免疫组织化学染色，光学显微镜下观察。
三、免疫组织化学观察
采用SP[过氧化酶标记的链霉卵白素染色法(Streptavidin/Peroxidase)]法，cNOS和iNOS单克隆抗体和SP试剂盒均为北京中山试剂公司提供。染色步骤按SP试剂盒说明书进行。DAB显色，棕褐色为阳性染色，所有切片用苏木素复染。用PBS代替一抗作空白对照，相同浓度的牛血清代替一抗作替代对照，均为阴性。免疫组化半定量显色标准：按显色深度和阳性颗粒的粗细、数量分为3级，即显色略高于背景、阳性颗粒细而少为弱阳性(+)；显色明显，阳性颗粒粗而多为强阳性(+++)；介于二者之间为中度阳性(++)。
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结果
一、标本病理结果
感染血吸虫尾蚴后3周，实验动物开始出现明显的病态，表现为厌食、萎靡、便血。随着病程延长，病兔死亡数逐渐增加。感染尾蚴后5个月，共死亡7只(7/40)。病理检查发现病兔肝肿大，表面密布灰白色粟粒状结节，质地变硬，有的成为突起的结节。直肠增粗，壁增厚，管壁僵硬，浆膜面有粗大的结节。剖开肠腔，见粘膜增厚并向腔内突起，造成肠腔狭窄。肠粘膜散在许多出血点、伴粘膜糜烂、溃疡形成。
二、H.E和Masson三色染色
肝门管区形成虫卵肉芽肿，有大量胶原纤维沉积。直肠壁粘膜层和粘膜下层有成簇虫卵沉积，并形成虫卵肉芽肿，部分粘膜脱落。直肠壁有大量炎性细胞聚积，并有纤维结缔组织聚积。
三、免疫组化观察
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正常家兔直肠壁cNOS和iNOS均为阴性反应，偶见少量弱阳性反应物。血吸虫病兔直肠壁cNOS和iNOS均呈强阳性反应。cNOS主要位于粘膜毛细血管壁和粘膜下的血管壁。iNOS不仅见于上述血管壁，而且位于血吸虫虫卵肉芽肿周围、纤维结缔组织中、炎性细胞之间(附图)。
附图 感染血吸虫尾蚴5个月兔直肠壁iNOS免疫组化染色×300直肠壁有大量血吸虫卵沉积，虫卵周围、炎性细胞之间粘膜下血管壁(箭头所示)有iNOS强阳性反应物
讨论
血吸虫病不仅可引起肝纤维化和门静脉高压症，而且可引起肠道病变，其中危害最大的是形成直肠肉芽肿，它可并发直肠狭窄、梗阻、出血、甚至恶性变而导致直肠癌。关于直肠肉芽肿的发病机制迄今尚无定论，一般认为与血吸虫卵沉积在直肠壁有关。一氧化氮(NO)是一种活性很强的自由基气体，在感染时有保护和损伤宿主的双重作用[2]。
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NO的测定方法很多。NO的半衰期仅6秒左右[3]，故直接从直肠组织匀浆中测定NO在技术上存在一定的困难，要求有很高的实验条件。本实验采用单抗的SP免疫组化法，结合组织病理学研究，使cNOS和iNOS在直肠壁的细胞水平上定位的半定量分析。从而证实直肠壁有cNOS和iNOS存在，并间接证实有NO产生。这比单纯测定血浆和组织匀浆中的NO含量更能反映NO对直肠壁的生物学作用，以及NO和直肠肉芽肿形成的关系。
本实验发现，正常兔直肠壁cNOS和iNOS均为阴性，偶见少量弱阳性反应物。感染血吸虫病后直肠壁cNOS和iNOS呈强阳性反应，同时直肠壁有明显的病理改变，cNOS主要分布于血管壁。iNOS不仅见于血管壁，还见于虫卵周围、纤维结缔组织中和炎性细胞附近。从而证实，血吸虫卵沉积在直肠壁，激活了cNOS和iNOS，在cNOS和iNOS的催化下直肠壁有大量NO生成。NO能使平滑肌松弛、血管扩张，可形成直肠静脉曲张。文献报道[4]，门静脉高压症时直肠静脉曲张发生率可达22%，并偶可引起下消化道大出血。
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iNOS主要由细菌毒素、白细胞、细胞因子和巨噬细胞诱导合成。我们发现，血吸虫病兔直肠壁聚积有大量炎性细胞，这些细胞间见有大量iNOS阳性反应物，表明直肠壁的炎性细胞可诱导合成iNOS，在iNOS催化下又可产生大量的NO。iNOS合成的NO与免疫及细胞毒性有关，一方面NO可杀伤血吸虫卵，属于宿主的一种非特异性防御反应；另一方面NO又可损伤直肠壁，造成直肠壁的损伤，因而可引起粘膜坏死脱落和下消化道大出血。损伤后继发组织增生，可引起肠腔狭窄和梗阻，表明NO在血吸虫病性直肠肉芽肿发病机制中具有重要作用。
参考文献
1 Koshland DE. Nitric oxide: the molecule of the year. Science,1992,258:1861.
2 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev,1991,43:109-142.
3 Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, et al. A fluorometric assay for the measurement of nitric in biological samples. Analytical Biochem,1993,214:11-16.
4 Ganguly S, Sarin SK, Bhatia V, et al. The prevalence and spectrum of colonic lesions in patients with cirrhotic and noncirrhotic hypertension. Hepatology,1995,21:1226-1231., http://www.100md.com
单位：4300033 武汉，军工总医院(李中明、陈茂平、胡仁崇、刘金斗、张雅芳)；同济医科大学同济医院(杨镇)
关键词：一氧化氮；直肠；血吸虫病兔
中华传染病杂980206 【摘要】 目的 研究一氧化氮(NO)在血吸虫直肠肉芽肿发病机制中的作用。方法 采用腹部敷贴法建立血吸虫病兔模型，SP免疫组化法分析结构型和诱导型一氧化氮合成酶(cNOS和iNOS)在正常兔和血吸虫病兔直肠壁的表达与分布。结果 正常兔直肠壁cNOS和iNOS呈阴性反应，血吸虫病兔直肠壁为强阳性，cNOS主要分布在粘膜毛细血管和粘膜下血管壁；iNOS不仅见于上述血管壁，而且见于虫卵、虫卵肉芽肿周围、纤维结缔组织中、炎性细胞之间。结论 NO在血吸虫直肠肉芽肿发病机制中具有重要作用。
Immunohistochemical observation of nitric oxide synthetase in rectum of rabbits infected with S. japonicum Li Zhongming, Cheng Maoping, Hu Renchong, et al. Wuhan General Hospital of PLA Factories, Wuhan 430033
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【Abstract】 Objective The objective of the study was to investigate the role of nitric oxide (NO) in the pathogenesis of rectum granuloma formation. Methods Rabbits were infected with cercaria of S. japonicum percutaneously. The SP immunohistochemical technique was used to analyse the expression and localization of cNOS and iNOS in the rectums of normal and schistosoma rabbits. Results Immunostaining of cNOS and iNOS were negative in the rectums of normal rabbits, whereas the results in the of rabbits infected with S. japonicum were strong positive. The positive immunostaining of cNOS was observed in mucosal capillaries and submucosal vessels. Besides in capillaries and submucosal vessels the positive immunostaining of iNOS was seen in schistosoma ova, ova granuloma, fibroconnective tissue and suppuratie cells. Conclusion The NO may play an important role in the pathogenesis of rectum ova granuloma.
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【Key words】 Nitric oxide Rectum Schistosomasis rabbits
晚期血吸虫病主要分为巨脾型、腹水型、侏儒型和结肠增厚型四种。直肠增殖主要由直肠肉芽肿形成，可以导致下消化道出血、狭窄、梗阻、甚至恶变。一氧化氮(NO)是一种细胞信使分子，它的生物学作用涉及机体的各个系统[1]。NO是否能参与形成直肠肉芽肿，作者迄今尚未见报道。本实验采用免疫组化技术，观察血吸虫病兔直肠壁结构型和诱导型一氧化氮合成酶(cNOS和iNOS)的分布与表达。旨在探讨NO在血吸虫病直肠肉芽肿形成中的意义。
材料与方法
一、动物模型
雄性大耳白兔40只，体重2～3kg。采用腹部敷贴法感染采自湖北钉螺(Oncomelania hupensis)的尾蚴，兔腹部剪毛，滴以含蚴液(尾蚴数200±5条/只)，玻片覆盖15分钟，形成急性感染，感染后3、4、5个月各取3只动物供实验。以正常兔作对照。
, 百拇医药
二、取材方法
动物麻醉后剖腹取肝组织和一段直肠，10%福尔马林固定24小时，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。浸蜡和包埋温度控制在65℃以下，以防破坏组织的抗原性。连续切片，厚4μm，分别作H.E、Masson三色染色和免疫组织化学染色，光学显微镜下观察。
三、免疫组织化学观察
采用SP[过氧化酶标记的链霉卵白素染色法(Streptavidin/Peroxidase)]法，cNOS和iNOS单克隆抗体和SP试剂盒均为北京中山试剂公司提供。染色步骤按SP试剂盒说明书进行。DAB显色，棕褐色为阳性染色，所有切片用苏木素复染。用PBS代替一抗作空白对照，相同浓度的牛血清代替一抗作替代对照，均为阴性。免疫组化半定量显色标准：按显色深度和阳性颗粒的粗细、数量分为3级，即显色略高于背景、阳性颗粒细而少为弱阳性(+)；显色明显，阳性颗粒粗而多为强阳性(+++)；介于二者之间为中度阳性(++)。
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结果
一、标本病理结果
感染血吸虫尾蚴后3周，实验动物开始出现明显的病态，表现为厌食、萎靡、便血。随着病程延长，病兔死亡数逐渐增加。感染尾蚴后5个月，共死亡7只(7/40)。病理检查发现病兔肝肿大，表面密布灰白色粟粒状结节，质地变硬，有的成为突起的结节。直肠增粗，壁增厚，管壁僵硬，浆膜面有粗大的结节。剖开肠腔，见粘膜增厚并向腔内突起，造成肠腔狭窄。肠粘膜散在许多出血点、伴粘膜糜烂、溃疡形成。
二、H.E和Masson三色染色
肝门管区形成虫卵肉芽肿，有大量胶原纤维沉积。直肠壁粘膜层和粘膜下层有成簇虫卵沉积，并形成虫卵肉芽肿，部分粘膜脱落。直肠壁有大量炎性细胞聚积，并有纤维结缔组织聚积。
三、免疫组化观察
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正常家兔直肠壁cNOS和iNOS均为阴性反应，偶见少量弱阳性反应物。血吸虫病兔直肠壁cNOS和iNOS均呈强阳性反应。cNOS主要位于粘膜毛细血管壁和粘膜下的血管壁。iNOS不仅见于上述血管壁，而且位于血吸虫虫卵肉芽肿周围、纤维结缔组织中、炎性细胞之间(附图)。
附图 感染血吸虫尾蚴5个月兔直肠壁iNOS免疫组化染色×300直肠壁有大量血吸虫卵沉积，虫卵周围、炎性细胞之间粘膜下血管壁(箭头所示)有iNOS强阳性反应物
讨论
血吸虫病不仅可引起肝纤维化和门静脉高压症，而且可引起肠道病变，其中危害最大的是形成直肠肉芽肿，它可并发直肠狭窄、梗阻、出血、甚至恶性变而导致直肠癌。关于直肠肉芽肿的发病机制迄今尚无定论，一般认为与血吸虫卵沉积在直肠壁有关。一氧化氮(NO)是一种活性很强的自由基气体，在感染时有保护和损伤宿主的双重作用[2]。
, 百拇医药
NO的测定方法很多。NO的半衰期仅6秒左右[3]，故直接从直肠组织匀浆中测定NO在技术上存在一定的困难，要求有很高的实验条件。本实验采用单抗的SP免疫组化法，结合组织病理学研究，使cNOS和iNOS在直肠壁的细胞水平上定位的半定量分析。从而证实直肠壁有cNOS和iNOS存在，并间接证实有NO产生。这比单纯测定血浆和组织匀浆中的NO含量更能反映NO对直肠壁的生物学作用，以及NO和直肠肉芽肿形成的关系。
本实验发现，正常兔直肠壁cNOS和iNOS均为阴性，偶见少量弱阳性反应物。感染血吸虫病后直肠壁cNOS和iNOS呈强阳性反应，同时直肠壁有明显的病理改变，cNOS主要分布于血管壁。iNOS不仅见于血管壁，还见于虫卵周围、纤维结缔组织中和炎性细胞附近。从而证实，血吸虫卵沉积在直肠壁，激活了cNOS和iNOS，在cNOS和iNOS的催化下直肠壁有大量NO生成。NO能使平滑肌松弛、血管扩张，可形成直肠静脉曲张。文献报道[4]，门静脉高压症时直肠静脉曲张发生率可达22%，并偶可引起下消化道大出血。
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iNOS主要由细菌毒素、白细胞、细胞因子和巨噬细胞诱导合成。我们发现，血吸虫病兔直肠壁聚积有大量炎性细胞，这些细胞间见有大量iNOS阳性反应物，表明直肠壁的炎性细胞可诱导合成iNOS，在iNOS催化下又可产生大量的NO。iNOS合成的NO与免疫及细胞毒性有关，一方面NO可杀伤血吸虫卵，属于宿主的一种非特异性防御反应；另一方面NO又可损伤直肠壁，造成直肠壁的损伤，因而可引起粘膜坏死脱落和下消化道大出血。损伤后继发组织增生，可引起肠腔狭窄和梗阻，表明NO在血吸虫病性直肠肉芽肿发病机制中具有重要作用。
参考文献
1 Koshland DE. Nitric oxide: the molecule of the year. Science,1992,258:1861.
2 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev,1991,43:109-142.
3 Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, et al. A fluorometric assay for the measurement of nitric in biological samples. Analytical Biochem,1993,214:11-16.
4 Ganguly S, Sarin SK, Bhatia V, et al. The prevalence and spectrum of colonic lesions in patients with cirrhotic and noncirrhotic hypertension. Hepatology,1995,21:1226-1231., http://www.100md.com