单纯疱疹病毒Ⅱ型和人乳头瘤病毒的感染与人工流产术后不孕症的关系
作者：李冬梅 黄涛 张卓然 朱建良
单位：250100 济南 山东大学生命科学学院(李冬梅)；山东省防疫站病毒科(黄涛)；山东省荣军医院(朱建良)；大连医科大学微生物教研室(张卓然)
关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型；人乳头瘤病毒；人工流产术；不孕症
中华实验和临床病毒学杂志980223 【摘要】 目的 探讨性传播病毒和不孕症的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)对60例人工流产术后不孕症妇女和39例正常妇女进行了生殖道单纯疱疹病毒II型(HSV2)和人乳头瘤病毒(HPV)的检测。结果 不孕组和对照组HSV2的阳性检出率分别是80.0%和25.5%，两组间有极显著性差异(P<0.01)；HPV的阳性率分别是53.3%和33.3%，两组间无显著性差异(P<0.05)；HSV和HPV在两组中的混合感染的阳性率分别是43.3%(26/60)和23.1%(9/39)，两者有显著性差异(P<0.05)。表明HSV2或HSV2和HPV的混合感染与人工流产术后不孕症有显著的相关性，很可能是不孕的原因之一。两组99份标志中，HSV2和HPV混合感染的阳性率为35.35%，统计学分析表明，HSV2和HPV感染与不孕有极显著的相关性χ=12.5,P<0.01。结论 HSV2和HPV的感染和不孕症相关。
, 百拇医药
The relationship between herpes simplex virus Ⅱ,human papillomavirus infection and infertility after artificial abortion Li Dongmei,Huang Tao,Zhang Zhuoran,et al.Department of Microbiology,Shandong University,Jinan 250100
Abstract In order to study the relationship between infection of sexually transmitted virus Herpes simplex virus II (HSV2),Human papillomavirus (HPV)and female infertility after artificial abortion,we collected 60 genital samples from infertile women who had accepted artificial abortions and 39 genital samples from normal women.Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect HSV2 and HPV.The results were compared by x2.The positive rate of HSV2 in infertile and normal women were 80.0% and 25.6% respectively, there was a significant difference (P<0.01);but that of HPV were 53.5% and 33.3%,which slowed no significant difference (P>0.05).Mixed infection rates of HSV2 and HPV were 43.3% and 23.1% in infertile and normal women,a significant difference(P<0.05) was statistically calculated.The results showed that there was a relationship between infertility after artificial abortion and genital infection of HSV2 and HPV or mited infection of HSV2 and HPV. Taking total 99 genilal samples into calculation,the mired infection rate of HSV2 was35.35%,a significant relatedness of HSV2 and HPV infection to infertility was proved by χ2,χ2=12.5,P<0.01.
, 百拇医药
Key words: Herpes simplex viurs Human papillomavirus Infertility Artificial abortion
单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex vrusⅡ,HSV2)和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是重要的性传播病毒，可引起人类生殖器疱疹和尖锐湿疣[1]，这两种病毒均极易感染人泌尿生殖系统，常形成潜伏感染[2]。近年来我国人群中HSV2和HPV的感染率在日益增多[3，4]。根据我国国情，人工流产术是有效的、被孕妇普遍接受的计划生育补救措施，人工流产术后由于各种原因可导致继发性不孕症[5]，它与正常妇女相比其不孕的相对危险性为3.4[6]。因此我们应用PCR对人工流产术后不孕妇女和正常妇女进行了生殖道HSV2和HPV的检测，初步探讨这两种性传播病毒与不孕症的关系。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 研究对象 不孕组60例，选自大连市计划生育研究所不孕门诊1994年12月～1995年2月的不孕患者，人工流产术后“原因不明”不孕2～7年(平均52±25.7月，不孕期间曾做多种检查，如输卵管通液，子宫输卵管造影，基础体温检测，配偶精液检查等，未查出明确的不孕原因)，年龄24～41岁(平均28.9±3.7岁)，全都经妇科检查，详细记录月经、人工流产次数、分泌物性状等，近四周未接受阴道灌洗治疗，配偶精液检查正常。对照组39例，随机选自1995年2月在大连市计划生育研究所门诊集体体检者，年龄25～39岁(平均29.2±3.5岁)，全都有孕产史，无泌尿生殖感染症状与体征，宫颈光滑，无炎症，外观正常。
1.2 标本的采集和DNA模板的制备 在月经周期第9～14天进行，暴露宫颈，用无菌刮匙自宫颈口处刮取少量分泌物，立即将其放入盛有2ml生理盐水的大试管内，-20℃存放。将含有子宫颈脱落细胞的Eppendorf管(1.5ml)以15?000r/min离心10分钟，弃上清，留沉淀加裂解液(含吐温20，蛋白酶K的pH7.6,66mmol/L PBS)100μl在震荡器上充分混匀5分钟，55℃水浴1小时，100℃沸水浴10分钟，12?000r/min离心5分钟，取5μl上清液放入另一Eppendorf管内(O.5ml)做为DNA模板。
, 百拇医药
1.3 总引物介导的人乳头瘤病毒聚合酶链反应 试剂购自中国科学院北京科海医疗生物工程公司，共同引物含有20个碱基，能检测包括HPV6，11，16，18型在内的40余型HPV，扩增DNA片段长度为450bp，引物序列为：5’-CGACCAAGAGGAAACTGATC-3’，5’?GCACAGGGACATAATAATGG?3’。50μl的反应体积中包含：10×缓冲液5μl(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl,pH8.3;1.5mmol/L MgCl2),10mmol/L的dATP,dCTP,dTTP,dGTP各1μl，20μmol/L的引物各1μl,Taq DNA聚合酶1μl(含1.0U)，用无菌去离子水补至50μl，加灭菌石蜡油40μl，同时设不加模板的阴性对照和加模板的阳性对照，在DNA扩增仪上(Perkin Elmer Cetus产品)进行94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共35个循环。最后一个循环延伸至5分钟。取PCR产物10μl电泳，紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.4 单纯疱疹病毒II型聚合酶链反应 试剂购自上海复生生物工程研究所，扩增DNA片段长为372bp，引物序列选自DNA多聚酶编码区，序列为：5’-AAGGAG-GCGCCCAAGCG-3’，5’，-GGTACAGGCTG-GCAAAGT-3’，PCR方法与人乳头瘤病毒检测法相同。
2 结果
2.1 不孕组HSV2和HPV的阳性检出结果实验组60例，DNA阳性者48例，阳性率为80.0%，对照组39例，HSV2 DNA阳性者10例，阳性率为25.6%，两组比较，具有极显著性差异，χ2 =28.7，P<0.01。实验组HPV DNA的阳性检出率为53.3%(32/60)，而对照组的阳性检出率为33.3%(13/39)，两组经统计学处理，无显著性差异(χ2=2.78，P>0.05)。HSV2和HPV DNA的PCR扩增结果见图1。
, http://www.100md.com
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果
1∶阳性对照；2∶阴性对照；3～7∶为部分标本
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products
1∶Positive control.2∶Negative control.3-7∶Some of the specimens
2.2 实验组与对照组HSV2和HPV混合阳性检出结果 见表1。
表 1 不孕组与正常组HSV2和HPV双阳性率的比较
Tab.1 Comparison of HSV2 and HPV mixed infection rate in infertile women and the control
, http://www.100md.com
HSV2/HPV
混合感染
组别
总例数
双阳性
阳性率(%)
Group
No.tested
HSV/HPV
Mixed infec
both positive
tion rate
, http://www.100md.com
实验组
60
26
43.3
Experimental
对照组
39
9
23.1
Control
合计
99
35
, http://www.100md.com
35.35
Total
实验组与对照组HSV2和HPV混合阳性分布有显著性差异(χ2 =4.24,P<0.05)。
A Rignificant difference in positivity of HSV2+HPV mixed infection rate was shown between experimental group and the controls,(χ2=4.24,P<0.05)
2.3 HSV2和HPV混合阳性的相关性分析99例标本中，HSV2和HPV混合阳性者35例，占35.4%，表明HSV2和HPV的感染之间有极显著的相关性(χ2 =12.5,P<0.01)。
, 百拇医药 3 讨论
有人报道，我国正常人群中HSV2和HPV的感染率分别为20%和31.76%[4,7]，与我们的研究结果相近。这两种性传播病毒与宫颈癌的关系已有报道[8]，但对于它们与不孕症的关系国内外尚未见有报道。我们的结果，从HSV2和HPV在不孕组和对照组的单独感染看，HSV2分别是80.0%和25.6%，有极显著性差异(P<0.01)，HPV是53.3%和33.3%，无显著性差异(P>0.05)。从两病毒的双重感染看，不孕组HSV2和HPV的混合阳性率为43.3%，而对照组只为9%，有极显著性差异(P<0.01)。说明这两种病毒的协同作用在不孕症中起着重要作用。在两组共99例病人中，无一例临床诊断为生殖器疱疹或尖税湿疣，说明他们的感染大多呈隐性或潜伏感染。
我们认为人工流产术在一定时间内一定程度上改变了生殖道的生理条件，削弱了局部的防御功能，若术前或术后有HSV2和HPV的隐性感染尤其是两种病毒的混合感染，即可能加速局部的病理损伤，阻碍正常的受孕过程，成为人工流产术后不孕的原因。这两种病毒在生殖道中的相互作用机理仍有待于进一步探讨。值得注意的是，在99份病例中，HSV2和HPV的混合感染阳性率占35.35%，两者的感染有极显著的相关性(χ2 =12.5,P<0.01)。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Mints L,Drew W L.Sexually transmitted viral infections in homosexual men.Med Clin North Am,1983,67:1093.
2 Nathalie J,Schimisdt B,Richard W,et al.Diagnostic procedures for viral ,rickettsial and chlamydial infections.Washing ton DC:APHA,1989:218,850.
3 权力敏，王存苗，张南平，等.青岛不同地区不同职业人群中生殖道HSV感染情况的流行病学调查.中华流行病学杂志，1993，14(5)：263.
4 郑鹏生，宁杰，李守柔.应用PCR测定正常子宫颈组织HPV DNA的研究，中华妇产科杂志，1994，26(6)：343.
, http://www.100md.com
5 张觉生.人工流产对今后生育的影响.国外医学.计划生育学分册，1987，(41)：706.
6 Trichopouples D.Reason for infertility.Br J Obstet Gynecol,1976,83:645.
7 唐家琪，陶开华，李越希，等.已婚妇女HSV感染的分子流行病学调查.中华流行病学杂志，1993，14(4)：223.
8 Das B C,Sharma J K,Gopalkrishna V,et al.DNA sequences in cervical blot hybridization and PCR.J Med Vivol,1992,36(4):239.
1997年1月9日收稿 6月26日修回, 百拇医药
单位：250100 济南 山东大学生命科学学院(李冬梅)；山东省防疫站病毒科(黄涛)；山东省荣军医院(朱建良)；大连医科大学微生物教研室(张卓然)
关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型；人乳头瘤病毒；人工流产术；不孕症
中华实验和临床病毒学杂志980223 【摘要】 目的 探讨性传播病毒和不孕症的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)对60例人工流产术后不孕症妇女和39例正常妇女进行了生殖道单纯疱疹病毒II型(HSV2)和人乳头瘤病毒(HPV)的检测。结果 不孕组和对照组HSV2的阳性检出率分别是80.0%和25.5%，两组间有极显著性差异(P<0.01)；HPV的阳性率分别是53.3%和33.3%，两组间无显著性差异(P<0.05)；HSV和HPV在两组中的混合感染的阳性率分别是43.3%(26/60)和23.1%(9/39)，两者有显著性差异(P<0.05)。表明HSV2或HSV2和HPV的混合感染与人工流产术后不孕症有显著的相关性，很可能是不孕的原因之一。两组99份标志中，HSV2和HPV混合感染的阳性率为35.35%，统计学分析表明，HSV2和HPV感染与不孕有极显著的相关性χ=12.5,P<0.01。结论 HSV2和HPV的感染和不孕症相关。
, 百拇医药
The relationship between herpes simplex virus Ⅱ,human papillomavirus infection and infertility after artificial abortion Li Dongmei,Huang Tao,Zhang Zhuoran,et al.Department of Microbiology,Shandong University,Jinan 250100
Abstract In order to study the relationship between infection of sexually transmitted virus Herpes simplex virus II (HSV2),Human papillomavirus (HPV)and female infertility after artificial abortion,we collected 60 genital samples from infertile women who had accepted artificial abortions and 39 genital samples from normal women.Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect HSV2 and HPV.The results were compared by x2.The positive rate of HSV2 in infertile and normal women were 80.0% and 25.6% respectively, there was a significant difference (P<0.01);but that of HPV were 53.5% and 33.3%,which slowed no significant difference (P>0.05).Mixed infection rates of HSV2 and HPV were 43.3% and 23.1% in infertile and normal women,a significant difference(P<0.05) was statistically calculated.The results showed that there was a relationship between infertility after artificial abortion and genital infection of HSV2 and HPV or mited infection of HSV2 and HPV. Taking total 99 genilal samples into calculation,the mired infection rate of HSV2 was35.35%,a significant relatedness of HSV2 and HPV infection to infertility was proved by χ2,χ2=12.5,P<0.01.
, 百拇医药
Key words: Herpes simplex viurs Human papillomavirus Infertility Artificial abortion
单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex vrusⅡ,HSV2)和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是重要的性传播病毒，可引起人类生殖器疱疹和尖锐湿疣[1]，这两种病毒均极易感染人泌尿生殖系统，常形成潜伏感染[2]。近年来我国人群中HSV2和HPV的感染率在日益增多[3，4]。根据我国国情，人工流产术是有效的、被孕妇普遍接受的计划生育补救措施，人工流产术后由于各种原因可导致继发性不孕症[5]，它与正常妇女相比其不孕的相对危险性为3.4[6]。因此我们应用PCR对人工流产术后不孕妇女和正常妇女进行了生殖道HSV2和HPV的检测，初步探讨这两种性传播病毒与不孕症的关系。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 研究对象 不孕组60例，选自大连市计划生育研究所不孕门诊1994年12月～1995年2月的不孕患者，人工流产术后“原因不明”不孕2～7年(平均52±25.7月，不孕期间曾做多种检查，如输卵管通液，子宫输卵管造影，基础体温检测，配偶精液检查等，未查出明确的不孕原因)，年龄24～41岁(平均28.9±3.7岁)，全都经妇科检查，详细记录月经、人工流产次数、分泌物性状等，近四周未接受阴道灌洗治疗，配偶精液检查正常。对照组39例，随机选自1995年2月在大连市计划生育研究所门诊集体体检者，年龄25～39岁(平均29.2±3.5岁)，全都有孕产史，无泌尿生殖感染症状与体征，宫颈光滑，无炎症，外观正常。
1.2 标本的采集和DNA模板的制备 在月经周期第9～14天进行，暴露宫颈，用无菌刮匙自宫颈口处刮取少量分泌物，立即将其放入盛有2ml生理盐水的大试管内，-20℃存放。将含有子宫颈脱落细胞的Eppendorf管(1.5ml)以15?000r/min离心10分钟，弃上清，留沉淀加裂解液(含吐温20，蛋白酶K的pH7.6,66mmol/L PBS)100μl在震荡器上充分混匀5分钟，55℃水浴1小时，100℃沸水浴10分钟，12?000r/min离心5分钟，取5μl上清液放入另一Eppendorf管内(O.5ml)做为DNA模板。
, 百拇医药
1.3 总引物介导的人乳头瘤病毒聚合酶链反应 试剂购自中国科学院北京科海医疗生物工程公司，共同引物含有20个碱基，能检测包括HPV6，11，16，18型在内的40余型HPV，扩增DNA片段长度为450bp，引物序列为：5’-CGACCAAGAGGAAACTGATC-3’，5’?GCACAGGGACATAATAATGG?3’。50μl的反应体积中包含：10×缓冲液5μl(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl,pH8.3;1.5mmol/L MgCl2),10mmol/L的dATP,dCTP,dTTP,dGTP各1μl，20μmol/L的引物各1μl,Taq DNA聚合酶1μl(含1.0U)，用无菌去离子水补至50μl，加灭菌石蜡油40μl，同时设不加模板的阴性对照和加模板的阳性对照，在DNA扩增仪上(Perkin Elmer Cetus产品)进行94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共35个循环。最后一个循环延伸至5分钟。取PCR产物10μl电泳，紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.4 单纯疱疹病毒II型聚合酶链反应 试剂购自上海复生生物工程研究所，扩增DNA片段长为372bp，引物序列选自DNA多聚酶编码区，序列为：5’-AAGGAG-GCGCCCAAGCG-3’，5’，-GGTACAGGCTG-GCAAAGT-3’，PCR方法与人乳头瘤病毒检测法相同。
2 结果
2.1 不孕组HSV2和HPV的阳性检出结果实验组60例，DNA阳性者48例，阳性率为80.0%，对照组39例，HSV2 DNA阳性者10例，阳性率为25.6%，两组比较，具有极显著性差异，χ2 =28.7，P<0.01。实验组HPV DNA的阳性检出率为53.3%(32/60)，而对照组的阳性检出率为33.3%(13/39)，两组经统计学处理，无显著性差异(χ2=2.78，P>0.05)。HSV2和HPV DNA的PCR扩增结果见图1。
, http://www.100md.com
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果
1∶阳性对照；2∶阴性对照；3～7∶为部分标本
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products
1∶Positive control.2∶Negative control.3-7∶Some of the specimens
2.2 实验组与对照组HSV2和HPV混合阳性检出结果 见表1。
表 1 不孕组与正常组HSV2和HPV双阳性率的比较
Tab.1 Comparison of HSV2 and HPV mixed infection rate in infertile women and the control
, http://www.100md.com
HSV2/HPV
混合感染
组别
总例数
双阳性
阳性率(%)
Group
No.tested
HSV/HPV
Mixed infec
both positive
tion rate
, http://www.100md.com
实验组
60
26
43.3
Experimental
对照组
39
9
23.1
Control
合计
99
35
, http://www.100md.com
35.35
Total
实验组与对照组HSV2和HPV混合阳性分布有显著性差异(χ2 =4.24,P<0.05)。
A Rignificant difference in positivity of HSV2+HPV mixed infection rate was shown between experimental group and the controls,(χ2=4.24,P<0.05)
2.3 HSV2和HPV混合阳性的相关性分析99例标本中，HSV2和HPV混合阳性者35例，占35.4%，表明HSV2和HPV的感染之间有极显著的相关性(χ2 =12.5,P<0.01)。
, 百拇医药 3 讨论
有人报道，我国正常人群中HSV2和HPV的感染率分别为20%和31.76%[4,7]，与我们的研究结果相近。这两种性传播病毒与宫颈癌的关系已有报道[8]，但对于它们与不孕症的关系国内外尚未见有报道。我们的结果，从HSV2和HPV在不孕组和对照组的单独感染看，HSV2分别是80.0%和25.6%，有极显著性差异(P<0.01)，HPV是53.3%和33.3%，无显著性差异(P>0.05)。从两病毒的双重感染看，不孕组HSV2和HPV的混合阳性率为43.3%，而对照组只为9%，有极显著性差异(P<0.01)。说明这两种病毒的协同作用在不孕症中起着重要作用。在两组共99例病人中，无一例临床诊断为生殖器疱疹或尖税湿疣，说明他们的感染大多呈隐性或潜伏感染。
我们认为人工流产术在一定时间内一定程度上改变了生殖道的生理条件，削弱了局部的防御功能，若术前或术后有HSV2和HPV的隐性感染尤其是两种病毒的混合感染，即可能加速局部的病理损伤，阻碍正常的受孕过程，成为人工流产术后不孕的原因。这两种病毒在生殖道中的相互作用机理仍有待于进一步探讨。值得注意的是，在99份病例中，HSV2和HPV的混合感染阳性率占35.35%，两者的感染有极显著的相关性(χ2 =12.5,P<0.01)。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Mints L,Drew W L.Sexually transmitted viral infections in homosexual men.Med Clin North Am,1983,67:1093.
2 Nathalie J,Schimisdt B,Richard W,et al.Diagnostic procedures for viral ,rickettsial and chlamydial infections.Washing ton DC:APHA,1989:218,850.
3 权力敏，王存苗，张南平，等.青岛不同地区不同职业人群中生殖道HSV感染情况的流行病学调查.中华流行病学杂志，1993，14(5)：263.
4 郑鹏生，宁杰，李守柔.应用PCR测定正常子宫颈组织HPV DNA的研究，中华妇产科杂志，1994，26(6)：343.
, http://www.100md.com
5 张觉生.人工流产对今后生育的影响.国外医学.计划生育学分册，1987，(41)：706.
6 Trichopouples D.Reason for infertility.Br J Obstet Gynecol,1976,83:645.
7 唐家琪，陶开华，李越希，等.已婚妇女HSV感染的分子流行病学调查.中华流行病学杂志，1993，14(4)：223.
8 Das B C,Sharma J K,Gopalkrishna V,et al.DNA sequences in cervical blot hybridization and PCR.J Med Vivol,1992,36(4):239.
1997年1月9日收稿 6月26日修回, 百拇医药