取样方法的比较及其对龈沟液酶水平的影响
作者：和璐 沙月琴 曹采方
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：碱性磷酸酶；取样方法
中华口腔医学杂志980212 【摘要】 目的 观察重复取样后两次样本的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平的变化，比较袋口和袋内两种取样方法。方法 分别用袋口和袋内法间隔20min重复取龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)样本， 并测定其中的ALP水平。 结果 两种方法取样示，20min后的ALP水平与第1次相比差异无显著性(P>0.05); 袋内法获得的ALP水平明显高于袋口法(P<0.001); 重复取样后，多数位点ALP水平不能完全恢复，但袋内法略优于袋口法，用酶总量表达略优于用浓度表达。 结论 重复取样的间隔期宜超过20min; 建议用袋内法取样测定ALP水平并以酶总量表示为佳。
, 百拇医药
Comparison of sampling methods and their effects on alkaline phosphatase levels in gingival crevicular fluid He Lu， Sha Yueqin， Cao Caifang . School of Stomatology ,Beijing Medical University ,Beijing 100081
【Abstract】 Objective To observe the change of alkaline phosphatase (ALP) after repeat sampling and compare the two sampling methods (orifice method and intra-pocket method). Methods Gingival crevicular fluid (GCF) was sampled repeatedly by the interval of 20 minutes, with orifice and intra-pocket method respectively， and the levels of ALP in GCF were determined. Results Mean levels of ALP per site and concentration of ALP are not statistically different between two samples after repeat sampling with orifice method as well as intra-pocket method (P>0.05). ALP levels (per site and per μl) are much higher for intra-pocket method than orifice method (P<0.001).From the viewpoint of the numbers of recovery sites after repeat sampling , though ALP levels at most sites can't entirly recover to their original levels with both method, intra-pocket method is still a little better than orifice method, and ALP levels per site is better than ALP concentration. Conclusion The interval of repeat sampling should be prolonged more than 20 minutes. It is better to determine the GCF-ALP with intra-pocket method and also the recommended pattern that express enzyme levels is total activity per site but not concentration.
, 百拇医药
【Key words】 Alkaline phosphatase Sampling method
近年来用不同方法对龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中细菌产物、宿主来源的酶及抗体、细胞因子等多种成分的研究，揭示了宿主反应在牙周组织局部的表现，对牙周疾病病因机制的阐述及监测牙周炎的发生、发展、指导临床治疗均有重要意义。一般常用滤纸条在袋口或袋内取GCF，但均满足不了多项生化指标综合评价的需要，从而影响对牙周炎活动期的判断和预测。重复取样则可将多次重复采取的样本混合形成一个牙位的一份GCF储池，或者各重复采取的样本进行多成分或一种成分的多方法分析,既扩大了样本量，避免了牙位特异性的影响，又便于研究各成分的交互作用。GCF中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)与牙周组织的活动性破坏密切相关，用袋内法重复取样后有能恢复到取样前水平的趋势，但样本量太小[1]。用袋口法对ALP重复取样尚未见报道。我们分别用袋口法、袋内法间隔20min重复取样，比较两次样本的GCF-ALP水平的变化，以期找到重复取样的较短间隔期，并对两种取样方法进行比较。
, 百拇医药
材料与方法
1. 病例选择： 从北京医科大学口腔医学院牙周科初诊患者中选择成人牙周炎(adult periodontitis, AP)和快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis， RPP)患者， 每人选择4～10个不相邻的邻面牙周炎位点(探诊深度≥4mm)。上述患者均身体健康无系统性疾患，1年内未做过牙周系统治疗，3个月内未连续服用抗生素3天以上， 妇女未妊娠。袋口法：共17例患者，男10例，女7例；其中AP14例，RPP3例，年龄19～64岁，平均43.1岁，共100颗牙，100个位点。袋内法：共17例患者，男8例，女9例；其中AP13例， RPP4例，年龄20～65岁，平均41.4岁，共102颗牙，102 个位点。
2. 临床指标：①菌斑指数(plaque index, PLI)，用Silness&L
e法；②出血指数(bleeding index, BI)， 用改良Mazza法；③探诊深度(probing depth, PD)，用Michigan O牙周探针检查。
, 百拇医药
3. GCF的收集及测量：取样部位隔湿、吹干，去除龈上菌斑并记录PLI，袋口法取样者将专用滤纸条(Periopaper, Proflow, USA)轻轻插入龈缘下方≤1mm处；袋内法则将同样的滤纸条轻轻插入牙周袋内，至有轻微阻力为止。两法均留置30s后取出，用龈沟液测量仪Periotron 6000测定GCF量，即刻放入Eppendorf管密封。20min后在同一牙位同法取样、定量，将滤纸条放入另一Eppendorf管密封。弃去带血样本。将装有GCF样本的Eppendorf管于-70℃贮存待检。
4. GCF-ALP的测定：样本于室温下解冻，每管均加入80μl 缓冲液(0.05mol/LTris-HCl，pH8.0)震荡1h，再于4℃、10 000r/min离心10min，取上清液，用Beckman 全自动生化检测仪测定ALP的浓度(IU/L)。
结果
1. 经χ2检验，袋口组与袋内组患者相比，其性别、AP和RPP的构成比均无统计学差异(P>0.05)；经t和t′检验，两组患者的年龄、临床指标亦无统计学差异(P>0.05)。
, 百拇医药
2. 经Mann-Whitney检验， 用袋内法取样时，第1次和第2次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)都比用袋口法取样时显著升高(P<0.001)。详见表1。
表1 袋口法和袋内法两组重复取样
GCF-ALP水平的比较(
±
) 指标
取样顺序
袋口法
(n=100)
袋内法
(n=102)
, 百拇医药
ALP总量
1
93.88±6.58
430.72±40.25*
(μIU)
2
89.61±5.95
375.40±31.30*
ALP浓度
1
430.41±44.54
653.32±48.48*
, 百拇医药
(IU/L)(n=98)
2
402.97±40.06
584.21±40.96*
*袋内法与袋口法比较，P <0.001
3. 配对秩和检验表明， 无论用袋口法还是袋内法，间隔20min重复取样，前后两次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
4. 多元回归分析表明， 重复取样后，用酶总量表示时，袋口法取样仅12%的位点ALP有可能恢复到取样前的水平，袋内法取样仅36%的位点有可能恢复到取样前的水平。用浓度表示时， 袋口法不存在回归关系， 而袋内法仅有31%的位点能恢复到取样前水平。经χ2检验，袋内法重复取样，ALP总量能恢复的位点数明显多于袋口法重复取样(P<0.001)，而与ALP浓度能恢复的位点数比较则无统计学差异(P>0.05)。见表2。
, 百拇医药
表2 重复取样两次样本GCF-ALP水平的多元回归 项目
常数
b
R
SE
百分比(%)
百分比的
χ2检验
袋口法
(n=98)
59.12
0.39
, 百拇医药
0.35
61.95
12
袋内法
(n=102)
141.18
0.77
0.60
326.91
36
P<0.01**
266.27*
, 百拇医药
0.66
0.56
407.74
31
P>0.05***
*ALP浓度的回归分析，**袋内法与袋口法比较，***袋内法的ALP浓度与ALP总量比较；百分比代表两次样本ALP水平可能相一致的个别位点占样本总位点的百分比。讨论
临床传统检测ALP的方法为分光光度计法， 检测GCF-ALP水平敏感度不高，Chapple等[2]所用化学发光法适于GCF-ALP检测，但成本高，不适用于临床。如重复采取的ALP能达到取样前水平，则可扩大传统检测法的临床适用性。对ALP的重复取样仅见Binder的袋内法取样， 间隔20秒后，ALP总量有升高趋势，却无统计学差异，其第1次样本ALP浓度较第2～5次明显降低，但他的研究仅限于1例患者的8个位点(PD3.8mm)[1]。本组样本量较大，用两种方法分别重复取样后， 第2次样本的GCF-ALP总量和浓度与第1次相比均无统计学差异; 但就每一个别牙位而言，ALP总量实际可能恢复到取样前水平的位点数仅分别为12%和36%，提示欲获得与取样前一致水平的ALP，间隔时间应超过20min。
, http://www.100md.com
袋口法避免了滤纸条插入对龈沟上皮的物理性刺激，但获得GCF量少;袋内法较袋口法获得GCF量多，但对局部的刺激可能导致血清稀释作用。Egelberg和Attstrm[3]在实验性龈炎患者群中对每一位点先用袋口法，然后用袋内法分别取3minGCF样本，表明袋口法反映炎症变化较袋内法更敏感。Tsuchida和Hara则认为袋内法取GCF量较宜反映牙龈炎症[4]。袋内法取样，插入深度易受牙石、牙周袋的宽松程度影响，而插入深度与取得的GCF量明显呈正相关，因此，不能单纯从PD的角度来评价两种方法的优劣。本组对配齐的两组样本的ALP水平进行比较，袋内法ALP总量和浓度明显高于袋口法；两组样本重复取样后，袋内法第2次的ALP总量恢复到取样前水平的位点数目多于袋口法，推测该方法恢复到取样前水平所需间隔时间较袋口法相对短。 因此，作者认为用袋内法取样较佳,袋口法的ALP浓度不存在回归关系也支持了此观点。虽然袋内法的ALP浓度存在回归关系，第2次样本的ALP浓度达到取样前水平的位点数与用总量表示时无显著差别，但浓度在重复取样中变异仍比较明显，这与它同时受到酶总量和GCF体积的影响有关。 而GCF测定的微小误差会导致浓度的很大误差， 取样过程中严格隔湿并去除龈上菌斑的条件下，唾液和菌斑对GCF体积的影响还会有5.2%～8.6%，其浓度仍会受到较大影响。即使有了唾液污染、带有少量菌斑，因其中的ALP较GCF中之ALP少得多，对酶总量则无明显影响[5，6]。而且，ALP主要由局部组织生成， 插入袋内造成的刺激引起血清稀释仅对浓度有影响，对ALP总量无明显影响[1，6]，这也是袋口组ALP浓度比较时比酶总量比较少了2份样本的原因。因此，作者认为在取样方法研究中，用酶总量表示为佳，这与近年推荐用酶总量作为诊断指标的观点一致[7，8]。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Binder TA, Goodson JM, Socransky SS. Gingival fluid levels of acid and alkaline phosphatase. J Periodont Res,1987,22:14-19.
2 Chapple IL, Matthews JB,Thorpe GH,et al. A new ultrasensitive chemiluminescent assay for the site-specific quantification of alkaline phosphatase in gingival crevicular fluid. J Periodontal Res, 1993,28:266-273.
3 Egelberg J,Attstrm R. Comparison between orifice and intracrevicular methods of sampling gingival fluid. J Periodont Res, 1973, 8:384-388.
, 百拇医药
4 Tsuchida K, Hara K. Clinical significance of gingival fluid measurement by “Periotron”. J Periodont Res, 1981,52:697-700.
5 Griffiths GS, Wilton JM, Curtis MA. Contamination of human gingival crevicular fluid by plaque and saliva. Archs Oral Biol, 1992, 37: 559-564.
6 Chapple IL, Glenwright HD, Matthews JB, et al. Site-specific alkaline phosphatase levels in gingival crevicular fluid in health and gingivitis: cross-sectional studies. J Clin Periodontol ,1994,21: 409-414.
, http://www.100md.com
7 Persson GR, Page RC. Effect of sampling time and repetition on gingival crevicular fluid and aspartate aminotransferase activity. J Periodont Res, 1990,25:236-242.
8 Chambers DA, Imery PB, Cohen RL, et al. A longitudinal study of aspartate aminotransferase in human gingival crevicular fluid. J Periodont Res ,1991,26:65-74.
(收稿:1996-10-15 修回:1997-11-17), 百拇医药
单位：100081 北京医科大学口腔医学院
关键词：碱性磷酸酶；取样方法
中华口腔医学杂志980212 【摘要】 目的 观察重复取样后两次样本的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平的变化，比较袋口和袋内两种取样方法。方法 分别用袋口和袋内法间隔20min重复取龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)样本， 并测定其中的ALP水平。 结果 两种方法取样示，20min后的ALP水平与第1次相比差异无显著性(P>0.05); 袋内法获得的ALP水平明显高于袋口法(P<0.001); 重复取样后，多数位点ALP水平不能完全恢复，但袋内法略优于袋口法，用酶总量表达略优于用浓度表达。 结论 重复取样的间隔期宜超过20min; 建议用袋内法取样测定ALP水平并以酶总量表示为佳。
, 百拇医药
Comparison of sampling methods and their effects on alkaline phosphatase levels in gingival crevicular fluid He Lu， Sha Yueqin， Cao Caifang . School of Stomatology ,Beijing Medical University ,Beijing 100081
【Abstract】 Objective To observe the change of alkaline phosphatase (ALP) after repeat sampling and compare the two sampling methods (orifice method and intra-pocket method). Methods Gingival crevicular fluid (GCF) was sampled repeatedly by the interval of 20 minutes, with orifice and intra-pocket method respectively， and the levels of ALP in GCF were determined. Results Mean levels of ALP per site and concentration of ALP are not statistically different between two samples after repeat sampling with orifice method as well as intra-pocket method (P>0.05). ALP levels (per site and per μl) are much higher for intra-pocket method than orifice method (P<0.001).From the viewpoint of the numbers of recovery sites after repeat sampling , though ALP levels at most sites can't entirly recover to their original levels with both method, intra-pocket method is still a little better than orifice method, and ALP levels per site is better than ALP concentration. Conclusion The interval of repeat sampling should be prolonged more than 20 minutes. It is better to determine the GCF-ALP with intra-pocket method and also the recommended pattern that express enzyme levels is total activity per site but not concentration.
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【Key words】 Alkaline phosphatase Sampling method
近年来用不同方法对龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中细菌产物、宿主来源的酶及抗体、细胞因子等多种成分的研究，揭示了宿主反应在牙周组织局部的表现，对牙周疾病病因机制的阐述及监测牙周炎的发生、发展、指导临床治疗均有重要意义。一般常用滤纸条在袋口或袋内取GCF，但均满足不了多项生化指标综合评价的需要，从而影响对牙周炎活动期的判断和预测。重复取样则可将多次重复采取的样本混合形成一个牙位的一份GCF储池，或者各重复采取的样本进行多成分或一种成分的多方法分析,既扩大了样本量，避免了牙位特异性的影响，又便于研究各成分的交互作用。GCF中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)与牙周组织的活动性破坏密切相关，用袋内法重复取样后有能恢复到取样前水平的趋势，但样本量太小[1]。用袋口法对ALP重复取样尚未见报道。我们分别用袋口法、袋内法间隔20min重复取样，比较两次样本的GCF-ALP水平的变化，以期找到重复取样的较短间隔期，并对两种取样方法进行比较。
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材料与方法
1. 病例选择： 从北京医科大学口腔医学院牙周科初诊患者中选择成人牙周炎(adult periodontitis, AP)和快速进展性牙周炎(rapidly progressive periodontitis， RPP)患者， 每人选择4～10个不相邻的邻面牙周炎位点(探诊深度≥4mm)。上述患者均身体健康无系统性疾患，1年内未做过牙周系统治疗，3个月内未连续服用抗生素3天以上， 妇女未妊娠。袋口法：共17例患者，男10例，女7例；其中AP14例，RPP3例，年龄19～64岁，平均43.1岁，共100颗牙，100个位点。袋内法：共17例患者，男8例，女9例；其中AP13例， RPP4例，年龄20～65岁，平均41.4岁，共102颗牙，102 个位点。
2. 临床指标：①菌斑指数(plaque index, PLI)，用Silness&L
e法；②出血指数(bleeding index, BI)， 用改良Mazza法；③探诊深度(probing depth, PD)，用Michigan O牙周探针检查。, 百拇医药
3. GCF的收集及测量：取样部位隔湿、吹干，去除龈上菌斑并记录PLI，袋口法取样者将专用滤纸条(Periopaper, Proflow, USA)轻轻插入龈缘下方≤1mm处；袋内法则将同样的滤纸条轻轻插入牙周袋内，至有轻微阻力为止。两法均留置30s后取出，用龈沟液测量仪Periotron 6000测定GCF量，即刻放入Eppendorf管密封。20min后在同一牙位同法取样、定量，将滤纸条放入另一Eppendorf管密封。弃去带血样本。将装有GCF样本的Eppendorf管于-70℃贮存待检。
4. GCF-ALP的测定：样本于室温下解冻，每管均加入80μl 缓冲液(0.05mol/LTris-HCl，pH8.0)震荡1h，再于4℃、10 000r/min离心10min，取上清液，用Beckman 全自动生化检测仪测定ALP的浓度(IU/L)。
结果
1. 经χ2检验，袋口组与袋内组患者相比，其性别、AP和RPP的构成比均无统计学差异(P>0.05)；经t和t′检验，两组患者的年龄、临床指标亦无统计学差异(P>0.05)。
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2. 经Mann-Whitney检验， 用袋内法取样时，第1次和第2次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)都比用袋口法取样时显著升高(P<0.001)。详见表1。
表1 袋口法和袋内法两组重复取样
GCF-ALP水平的比较(
±) 指标取样顺序
袋口法
(n=100)
袋内法
(n=102)
, 百拇医药
ALP总量
1
93.88±6.58
430.72±40.25*
(μIU)
2
89.61±5.95
375.40±31.30*
ALP浓度
1
430.41±44.54
653.32±48.48*
, 百拇医药
(IU/L)(n=98)
2
402.97±40.06
584.21±40.96*
*袋内法与袋口法比较，P <0.001
3. 配对秩和检验表明， 无论用袋口法还是袋内法，间隔20min重复取样，前后两次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
4. 多元回归分析表明， 重复取样后，用酶总量表示时，袋口法取样仅12%的位点ALP有可能恢复到取样前的水平，袋内法取样仅36%的位点有可能恢复到取样前的水平。用浓度表示时， 袋口法不存在回归关系， 而袋内法仅有31%的位点能恢复到取样前水平。经χ2检验，袋内法重复取样，ALP总量能恢复的位点数明显多于袋口法重复取样(P<0.001)，而与ALP浓度能恢复的位点数比较则无统计学差异(P>0.05)。见表2。
, 百拇医药
表2 重复取样两次样本GCF-ALP水平的多元回归 项目
常数
b
R
SE
百分比(%)
百分比的
χ2检验
袋口法
(n=98)
59.12
0.39
, 百拇医药
0.35
61.95
12
袋内法
(n=102)
141.18
0.77
0.60
326.91
36
P<0.01**
266.27*
, 百拇医药
0.66
0.56
407.74
31
P>0.05***
*ALP浓度的回归分析，**袋内法与袋口法比较，***袋内法的ALP浓度与ALP总量比较；百分比代表两次样本ALP水平可能相一致的个别位点占样本总位点的百分比。讨论
临床传统检测ALP的方法为分光光度计法， 检测GCF-ALP水平敏感度不高，Chapple等[2]所用化学发光法适于GCF-ALP检测，但成本高，不适用于临床。如重复采取的ALP能达到取样前水平，则可扩大传统检测法的临床适用性。对ALP的重复取样仅见Binder的袋内法取样， 间隔20秒后，ALP总量有升高趋势，却无统计学差异，其第1次样本ALP浓度较第2～5次明显降低，但他的研究仅限于1例患者的8个位点(PD3.8mm)[1]。本组样本量较大，用两种方法分别重复取样后， 第2次样本的GCF-ALP总量和浓度与第1次相比均无统计学差异; 但就每一个别牙位而言，ALP总量实际可能恢复到取样前水平的位点数仅分别为12%和36%，提示欲获得与取样前一致水平的ALP，间隔时间应超过20min。
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袋口法避免了滤纸条插入对龈沟上皮的物理性刺激，但获得GCF量少;袋内法较袋口法获得GCF量多，但对局部的刺激可能导致血清稀释作用。Egelberg和Attstr
m[3]在实验性龈炎患者群中对每一位点先用袋口法，然后用袋内法分别取3minGCF样本，表明袋口法反映炎症变化较袋内法更敏感。Tsuchida和Hara则认为袋内法取GCF量较宜反映牙龈炎症[4]。袋内法取样，插入深度易受牙石、牙周袋的宽松程度影响，而插入深度与取得的GCF量明显呈正相关，因此，不能单纯从PD的角度来评价两种方法的优劣。本组对配齐的两组样本的ALP水平进行比较，袋内法ALP总量和浓度明显高于袋口法；两组样本重复取样后，袋内法第2次的ALP总量恢复到取样前水平的位点数目多于袋口法，推测该方法恢复到取样前水平所需间隔时间较袋口法相对短。 因此，作者认为用袋内法取样较佳,袋口法的ALP浓度不存在回归关系也支持了此观点。虽然袋内法的ALP浓度存在回归关系，第2次样本的ALP浓度达到取样前水平的位点数与用总量表示时无显著差别，但浓度在重复取样中变异仍比较明显，这与它同时受到酶总量和GCF体积的影响有关。 而GCF测定的微小误差会导致浓度的很大误差， 取样过程中严格隔湿并去除龈上菌斑的条件下，唾液和菌斑对GCF体积的影响还会有5.2%～8.6%，其浓度仍会受到较大影响。即使有了唾液污染、带有少量菌斑，因其中的ALP较GCF中之ALP少得多，对酶总量则无明显影响[5，6]。而且，ALP主要由局部组织生成， 插入袋内造成的刺激引起血清稀释仅对浓度有影响，对ALP总量无明显影响[1，6]，这也是袋口组ALP浓度比较时比酶总量比较少了2份样本的原因。因此，作者认为在取样方法研究中，用酶总量表示为佳，这与近年推荐用酶总量作为诊断指标的观点一致[7，8]。, http://www.100md.com
参考文献
1 Binder TA, Goodson JM, Socransky SS. Gingival fluid levels of acid and alkaline phosphatase. J Periodont Res,1987,22:14-19.
2 Chapple IL, Matthews JB,Thorpe GH,et al. A new ultrasensitive chemiluminescent assay for the site-specific quantification of alkaline phosphatase in gingival crevicular fluid. J Periodontal Res, 1993,28:266-273.
3 Egelberg J,Attstr
m R. Comparison between orifice and intracrevicular methods of sampling gingival fluid. J Periodont Res, 1973, 8:384-388., 百拇医药
4 Tsuchida K, Hara K. Clinical significance of gingival fluid measurement by “Periotron”. J Periodont Res, 1981,52:697-700.
5 Griffiths GS, Wilton JM, Curtis MA. Contamination of human gingival crevicular fluid by plaque and saliva. Archs Oral Biol, 1992, 37: 559-564.
6 Chapple IL, Glenwright HD, Matthews JB, et al. Site-specific alkaline phosphatase levels in gingival crevicular fluid in health and gingivitis: cross-sectional studies. J Clin Periodontol ,1994,21: 409-414.
, http://www.100md.com
7 Persson GR, Page RC. Effect of sampling time and repetition on gingival crevicular fluid and aspartate aminotransferase activity. J Periodont Res, 1990,25:236-242.
8 Chambers DA, Imery PB, Cohen RL, et al. A longitudinal study of aspartate aminotransferase in human gingival crevicular fluid. J Periodont Res ,1991,26:65-74.
(收稿:1996-10-15 修回:1997-11-17), 百拇医药