应用聚合酶链反应探讨乙肝病毒感染与胆石症的关系
作者：刘小方 郭仁宣 田雨霖 郭克建 佟玉兰 于孔伟
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院普外二科(刘小方、郭仁宣、田雨霖、郭克建、佟玉兰)；辽宁省庄河市人民医院(于孔伟)
关键词：胆总管结石；肝炎病毒，乙型；聚合酶链反应
中华外科杂志/980313
【摘要】 目的 探讨乙肝病毒感染在胆石症发病中的作用。 方法 应用聚合酶链式反应技术(PCR)，对32例血清乙肝标志物阳性的胆石症患者和20例乙肝标志物阳性的非胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本进行HBV-DNA检测。 结果 32例胆石症患者的胆囊标本HBV-DNA 阳性检出率为40.63%,20例非胆石症患者的胆囊标本HBV-DNA阳性检出率为15%。 结论 提示乙肝病毒感染与胆石症发生有关。用PCR技术检测石蜡包埋胆囊组织中的HBV-DNA是一种简便、可靠的方法。
, 百拇医药
PCR in detecting the correlation between infection of HBV and cholelithiasis Liu Xiaofang,Guo Renxuan,Tian Yulin,et al.Department of Surgery,First Clinical Hospital, China Medical University,Shenyang 110001.
【Abstract】 Objective To study the correlation between cholelithiasis and the infection of HBV. Method 32 formalin-fixed and paraffin-embedded gallbladder samples of cholelithiasis patients and 20 gallbladder samples of noncholelithiasis patients were investigated using the polyme rase chain reaction-Ethidium bromide(PCR-EB)assay.The 52 patients were positive to HBV serologic markers. Result The results showed that HBV-DNA was found in 13 gallbladder samples of 32 cholelithiasis patients(40.63%),significantly higher than that in 3 gallbladder samples of 20 noncholelithiasis patients(15%). Conclusion The infection of HBV and the formation of cholelithiasis are correlated.
, 百拇医药
【Key words】 Common bile duct calculi Hepatitis,B virus Polymerase chain reaction
近来研究证实，乙肝病毒可以在肝外组织复制,并可通过免疫反应引起肝外组织损害。国内外学者在乙肝患者的胆汁及胆道组织中发现了乙肝病毒抗原和HBV-DNA,为探讨乙肝病毒感染与胆石症发病原因提供了重要线索。我们应用聚合酶链反应技术(PCR)，对我院52例血清乙肝标志物阳性患者的石蜡包埋胆囊组织中的HBV-DNA进行了检测,以探讨乙肝病毒感染与胆石症发病的关系。
资料与方法
一、一般资料
1.标本来源:收集我院1989～1994年32例乙肝标志物阳性胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本。32例中男女比例为1.9∶1。年龄25～70岁,平均58.4岁。另取20例乙肝标志物阳性非胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本做对照。对照组中16例为胆囊息肉患者，3例胰头癌,1例胆总管下段癌。其中男女比例为2.3∶1。年龄28～65岁,平均54.6岁。
, 百拇医药
2.主要试剂:采用华美生物工程公司生产的PCR扩增试剂盒。用来检测HBV-DNA的一对引物选自HBV-C区基因序列，扩增片段为270bp。其碱基序列为:5′-GCTTTGGGGCATGGACATTGACC-
CCGTATAA-3′和5′-CTGACTACTACTAATT-
CCCTGGATGCTGGGGTCT-3′。
二、方法
1.病理检查：石蜡切片HE染色后光镜下进行病理组织学观察。
2.乙肝病毒血清标志物的检出：用ELISA法测定。
3.模板DNA的提取:取3～5张10 μm厚的石蜡切片置入1.5 ml的Eppendoff管中,经二甲苯脱蜡,100%乙醇处理,然后加3滴丙酮，置于37～50℃水浴中直至乙醇完全挥发。向上述干燥样品中加入每ml含200 μg蛋白酶K的消化缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5;1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5% Tween 20]。置55℃水浴3小时,灭活蛋白酶K,离心后取上清液5 μl。
, 百拇医药
4.PCR扩增:取模板DNA5 μl,PCR混合物(含引物及4种三磷酸盐脱氧核苷酸)28 μl,taq DNA聚合酶1 μl,HBV-DNA模板2 μl置于0.5 ml离心管内,混匀离心,然后加入30 μl液体石蜡封顶。94℃ 5分种后,94℃ 45秒变性,55℃ 45秒退火,72℃ 45秒延伸。设置循环35次,最后72℃10分种。
5.电泳:配制2%的琼脂糖凝胶,在电泳板上铺胶打孔。取扩增产物15 μl点样在凝胶板的点样孔中。经TBE电泳缓冲液室温电泳30分钟，在紫外透射反射分析仪下观察结果。以乙肝病毒的阳性血清为阳性对照,以蒸镏水替代模板DNA为阴性对照。以阳性对照为基准,若在270 bp处见到DNA区带为阳性结果，反之为阴性结果。
6.统计学方法:用χ2检验对实验结果进行统计学处理。
结果
, 百拇医药 32例胆石症患者的胆囊标本经HE染色镜检,胆囊均呈慢性炎症改变,慢性炎症检出率为100%；20例对照组的胆囊组织HE染色切片中，仅4例出现胆囊慢性炎症改变,其慢性炎症检出率为20%,二者之间差异有显著性意义(P<0.01)。32例血清乙肝标志物阳性的胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性13例,阳性检出率40.63%;20例乙肝标志物阳性的非胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性3例,阳性检出率15%，二者之间差异有显著性意义(P<0.01)。
讨论
过去,人们认为HBV是专一性嗜肝病毒,病毒的复制和所引起的细胞损害主要限于肝脏。然而,近年来的研究证明,HBV可以在肝以外的器官和组织中存在和复制。Hoefs等[1]在乙肝病毒感染者的胆汁标本中检测到HBsAg。以后Blum等[2]用原位杂交法在乙肝患者的胆道上皮细胞中检出乙肝病毒基因组。林秀玉等[3]以单克隆抗体和ABC法在乙肝患者的胆囊组织检出HBsAg和HBcAg。郎振为等[4]用PCR技术在乙肝患者的胆囊中检出HBV-DNA。本实验应用PCR技术，对32例乙肝标志物阳性胆石症患者和20例乙肝标志物阳性非胆石症患者的胆囊组织HBV-DNA进行了检测,发现胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性13例，阳性率40.63%。非胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性3例，阳性率15%,从而加深了对HBV泛嗜性的认识。
, 百拇医药
目前认为胆石症形成的基本因素为胆汁淤滞、胆汁理化性质改变、感染。这三种因素在胆石症形成上的作用往往很难分开。大量文献报道乙肝患者发生胆石症的机率显著高于正常人。Mason等[5]认为，HBV可在肝外组织存在,并进行复制。在胆道上皮复制可引起免疫损伤造成病毒性胆管炎、胆囊炎。Yoffe和Noonan[6]认为在肝外组织中HBV的存在,免疫复合物的沉积,引起抗原抗体反应,导致免疫损伤。在胆道系统的免疫损伤则可引起病毒性胆囊炎、胆管炎。肝炎时,肝细胞器受损,合成蛋白及胆酸障碍，胆汁不能正常分泌。胆汁分泌异常造成了胆汁理化性质改变和胆汁淤滞。这些因素单独或共同作用导致乙肝病毒感染患者胆石症发病率增高。本组32例乙肝病毒感染的胆石症患者，胆囊组织均呈慢性炎症改变,各层组织均有淋巴细胞,单核细胞浸润和明显纤维化。而乙肝病毒感染的非胆石症患者，仅有4例胆囊组织中有慢性炎症改变。32例乙肝病毒感染的胆石症患者，胆囊慢性炎症检出率为100%，HBV-DNA阳性检出率为40.63%；而20例乙肝病毒感染的非胆石症患者，胆囊慢性炎症的检出率为20%，HBV-DNA的阳性检出率为15%,它们之间差异有非常显著性意义(P<0.01)。结果表明乙肝病毒感染与胆石症形成及胆道系统慢性炎症改变有密切关系。
, 百拇医药
参考文献
1Hoefs JC,Renner IG,Ashcavai M,et al.Hepatitis B surface antigen in pancreatic and biliary secretions.Grastroenterology,1980,79:191-194.
2Blum HE,Stowring L,Figus A,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocytes,bile duct epithelium,and vascular elements by in situs hybridization.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:6685-6688.
3林秀玉，廖慧玉，朱仁平，等.肝病患者胆囊组织中乙型肝炎病毒抗体检测及其意义.中华内科杂志，1993，32：549-551.
, 百拇医药
4郎振为，阎惠平，黄德庄，等.聚合酶链反应检测乙型肝炎患者肝外组织中的乙型肝炎病毒DNA.中华内科杂志,1994,33:232.
5Mason A,Wiock M,White H,et al.Hepatitis B virus replication indiv-ersecell types during chronic-hepatitis B virus infection. Hepatology,1993,18:781-789.
6Yoffe B,Noonan CA.Hepatitis B virus: new and evolving issues.Dig Dis Sci,1992,37:1-9., 百拇医药
单位：110001 沈阳，中国医科大学第一临床学院普外二科(刘小方、郭仁宣、田雨霖、郭克建、佟玉兰)；辽宁省庄河市人民医院(于孔伟)
关键词：胆总管结石；肝炎病毒，乙型；聚合酶链反应
中华外科杂志/980313
【摘要】 目的 探讨乙肝病毒感染在胆石症发病中的作用。 方法 应用聚合酶链式反应技术(PCR)，对32例血清乙肝标志物阳性的胆石症患者和20例乙肝标志物阳性的非胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本进行HBV-DNA检测。 结果 32例胆石症患者的胆囊标本HBV-DNA 阳性检出率为40.63%,20例非胆石症患者的胆囊标本HBV-DNA阳性检出率为15%。 结论 提示乙肝病毒感染与胆石症发生有关。用PCR技术检测石蜡包埋胆囊组织中的HBV-DNA是一种简便、可靠的方法。
, 百拇医药
PCR in detecting the correlation between infection of HBV and cholelithiasis Liu Xiaofang,Guo Renxuan,Tian Yulin,et al.Department of Surgery,First Clinical Hospital, China Medical University,Shenyang 110001.
【Abstract】 Objective To study the correlation between cholelithiasis and the infection of HBV. Method 32 formalin-fixed and paraffin-embedded gallbladder samples of cholelithiasis patients and 20 gallbladder samples of noncholelithiasis patients were investigated using the polyme rase chain reaction-Ethidium bromide(PCR-EB)assay.The 52 patients were positive to HBV serologic markers. Result The results showed that HBV-DNA was found in 13 gallbladder samples of 32 cholelithiasis patients(40.63%),significantly higher than that in 3 gallbladder samples of 20 noncholelithiasis patients(15%). Conclusion The infection of HBV and the formation of cholelithiasis are correlated.
, 百拇医药
【Key words】 Common bile duct calculi Hepatitis,B virus Polymerase chain reaction
近来研究证实，乙肝病毒可以在肝外组织复制,并可通过免疫反应引起肝外组织损害。国内外学者在乙肝患者的胆汁及胆道组织中发现了乙肝病毒抗原和HBV-DNA,为探讨乙肝病毒感染与胆石症发病原因提供了重要线索。我们应用聚合酶链反应技术(PCR)，对我院52例血清乙肝标志物阳性患者的石蜡包埋胆囊组织中的HBV-DNA进行了检测,以探讨乙肝病毒感染与胆石症发病的关系。
资料与方法
一、一般资料
1.标本来源:收集我院1989～1994年32例乙肝标志物阳性胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本。32例中男女比例为1.9∶1。年龄25～70岁,平均58.4岁。另取20例乙肝标志物阳性非胆石症患者的石蜡包埋胆囊标本做对照。对照组中16例为胆囊息肉患者，3例胰头癌,1例胆总管下段癌。其中男女比例为2.3∶1。年龄28～65岁,平均54.6岁。
, 百拇医药
2.主要试剂:采用华美生物工程公司生产的PCR扩增试剂盒。用来检测HBV-DNA的一对引物选自HBV-C区基因序列，扩增片段为270bp。其碱基序列为:5′-GCTTTGGGGCATGGACATTGACC-
CCGTATAA-3′和5′-CTGACTACTACTAATT-
CCCTGGATGCTGGGGTCT-3′。
二、方法
1.病理检查：石蜡切片HE染色后光镜下进行病理组织学观察。
2.乙肝病毒血清标志物的检出：用ELISA法测定。
3.模板DNA的提取:取3～5张10 μm厚的石蜡切片置入1.5 ml的Eppendoff管中,经二甲苯脱蜡,100%乙醇处理,然后加3滴丙酮，置于37～50℃水浴中直至乙醇完全挥发。向上述干燥样品中加入每ml含200 μg蛋白酶K的消化缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5;1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5% Tween 20]。置55℃水浴3小时,灭活蛋白酶K,离心后取上清液5 μl。
, 百拇医药
4.PCR扩增:取模板DNA5 μl,PCR混合物(含引物及4种三磷酸盐脱氧核苷酸)28 μl,taq DNA聚合酶1 μl,HBV-DNA模板2 μl置于0.5 ml离心管内,混匀离心,然后加入30 μl液体石蜡封顶。94℃ 5分种后,94℃ 45秒变性,55℃ 45秒退火,72℃ 45秒延伸。设置循环35次,最后72℃10分种。
5.电泳:配制2%的琼脂糖凝胶,在电泳板上铺胶打孔。取扩增产物15 μl点样在凝胶板的点样孔中。经TBE电泳缓冲液室温电泳30分钟，在紫外透射反射分析仪下观察结果。以乙肝病毒的阳性血清为阳性对照,以蒸镏水替代模板DNA为阴性对照。以阳性对照为基准,若在270 bp处见到DNA区带为阳性结果，反之为阴性结果。
6.统计学方法:用χ2检验对实验结果进行统计学处理。
结果
, 百拇医药 32例胆石症患者的胆囊标本经HE染色镜检,胆囊均呈慢性炎症改变,慢性炎症检出率为100%；20例对照组的胆囊组织HE染色切片中，仅4例出现胆囊慢性炎症改变,其慢性炎症检出率为20%,二者之间差异有显著性意义(P<0.01)。32例血清乙肝标志物阳性的胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性13例,阳性检出率40.63%;20例乙肝标志物阳性的非胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性3例,阳性检出率15%，二者之间差异有显著性意义(P<0.01)。
讨论
过去,人们认为HBV是专一性嗜肝病毒,病毒的复制和所引起的细胞损害主要限于肝脏。然而,近年来的研究证明,HBV可以在肝以外的器官和组织中存在和复制。Hoefs等[1]在乙肝病毒感染者的胆汁标本中检测到HBsAg。以后Blum等[2]用原位杂交法在乙肝患者的胆道上皮细胞中检出乙肝病毒基因组。林秀玉等[3]以单克隆抗体和ABC法在乙肝患者的胆囊组织检出HBsAg和HBcAg。郎振为等[4]用PCR技术在乙肝患者的胆囊中检出HBV-DNA。本实验应用PCR技术，对32例乙肝标志物阳性胆石症患者和20例乙肝标志物阳性非胆石症患者的胆囊组织HBV-DNA进行了检测,发现胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性13例，阳性率40.63%。非胆石症患者胆囊组织中HBV-DNA阳性3例，阳性率15%,从而加深了对HBV泛嗜性的认识。
, 百拇医药
目前认为胆石症形成的基本因素为胆汁淤滞、胆汁理化性质改变、感染。这三种因素在胆石症形成上的作用往往很难分开。大量文献报道乙肝患者发生胆石症的机率显著高于正常人。Mason等[5]认为，HBV可在肝外组织存在,并进行复制。在胆道上皮复制可引起免疫损伤造成病毒性胆管炎、胆囊炎。Yoffe和Noonan[6]认为在肝外组织中HBV的存在,免疫复合物的沉积,引起抗原抗体反应,导致免疫损伤。在胆道系统的免疫损伤则可引起病毒性胆囊炎、胆管炎。肝炎时,肝细胞器受损,合成蛋白及胆酸障碍，胆汁不能正常分泌。胆汁分泌异常造成了胆汁理化性质改变和胆汁淤滞。这些因素单独或共同作用导致乙肝病毒感染患者胆石症发病率增高。本组32例乙肝病毒感染的胆石症患者，胆囊组织均呈慢性炎症改变,各层组织均有淋巴细胞,单核细胞浸润和明显纤维化。而乙肝病毒感染的非胆石症患者，仅有4例胆囊组织中有慢性炎症改变。32例乙肝病毒感染的胆石症患者，胆囊慢性炎症检出率为100%，HBV-DNA阳性检出率为40.63%；而20例乙肝病毒感染的非胆石症患者，胆囊慢性炎症的检出率为20%，HBV-DNA的阳性检出率为15%,它们之间差异有非常显著性意义(P<0.01)。结果表明乙肝病毒感染与胆石症形成及胆道系统慢性炎症改变有密切关系。
, 百拇医药
参考文献
1Hoefs JC,Renner IG,Ashcavai M,et al.Hepatitis B surface antigen in pancreatic and biliary secretions.Grastroenterology,1980,79:191-194.
2Blum HE,Stowring L,Figus A,et al.Detection of hepatitis B virus DNA in hepatocytes,bile duct epithelium,and vascular elements by in situs hybridization.Proc Natl Acad Sci USA,1983,80:6685-6688.
3林秀玉，廖慧玉，朱仁平，等.肝病患者胆囊组织中乙型肝炎病毒抗体检测及其意义.中华内科杂志，1993，32：549-551.
, 百拇医药
4郎振为，阎惠平，黄德庄，等.聚合酶链反应检测乙型肝炎患者肝外组织中的乙型肝炎病毒DNA.中华内科杂志,1994,33:232.
5Mason A,Wiock M,White H,et al.Hepatitis B virus replication indiv-ersecell types during chronic-hepatitis B virus infection. Hepatology,1993,18:781-789.
6Yoffe B,Noonan CA.Hepatitis B virus: new and evolving issues.Dig Dis Sci,1992,37:1-9., 百拇医药