激光照射对豚鼠内耳结构和前庭功能的影响
作者：江 新 蔡昌松 蔡 萍
单位：江苏省南通市南通医学院附属医院耳鼻科(226001)
关键词：He-Ne激光；鼓膜；Corti氏器；前庭功能
中国激光医学杂志980305Influence of He-Ne Laser Irradiation on the Structure of the
Inner Ear and Vestibulum Function of Guinea Pigs
Jiang Xin, Cai Changsong, Cai Ping
Department of Otorhinolaryngology, The Affiliated Hospital of Nantong Medical
, 百拇医药
College, Nantong, Jiangsu(226001)
摘要 为了探讨He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构和前庭功能的影响，用不同功率密度的He-Ne激光照射豚鼠鼓膜，观察内耳结构及前庭功能的变化。结果发现He-Ne激光每天照射豚鼠鼓膜10 min～15 min，连续10天后，当光纤末端输出功率密度为42.4 mW/cm2时，Corti氏器外毛细胞和静纤毛排列紊乱；当光纤末端输出功率密度为56.6 mW/cm2时，除上述改变外，还有Corti氏器变形，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残缺不齐，部分消失，Claudius细胞和边界细胞内出现空泡；当功率密度为35.4 mW/cm2时，内耳结构无改变。上述功率密度的激光照射豚鼠鼓膜，对前庭功能均无影响。提示临床上用He-Ne激光照射鼓膜治疗中耳病变时，其光纤末端输出功率密度应控制在35.4 mW/cm2以下，每天照射时间不宜超过15 min，连续照射以10天为宜，否则可能影响听力。
, 百拇医药
ABSTRACT
The purpose of this study is to investigate the influence of He-Ne laser irradiation of tympanic membrane on the structure of inner ear and on the vestibulum function. The impairment of the structure in the inner ear was examined by light and electron microscopy and the vestibulum function was tested after He-Ne laser irradiation to the guinea pig tympanic membrane with various power densities. It is demonstrated that after the laser irradiation at 42.4 mW/cm2 for 10 or 15 minutes once a day for 10 days, the outer hair cells and stereocilia in the Corti's organ are disarranged. When the power density of 56.6 mW/cm2 was used there were deformation of the Corti's organ, vague appearance of inner hair cells, regional disorder or loss of stereocilia and vacuolization of Claudius cells and border cells, but the vestibulum function was well preserved. When a power density of 35.4 mW/cm2 was used, the Corti's organ was normal. It is suggested that when the tympanic membrane is irradiated by He-Ne laser, in order to avoid any possible damage to hearing, the output power density from the optic fiber tip should be controlled under 35.4 mW/cm2, the irradiation time not longer than 15 minutes, and no more than 10 times for a session.
, 百拇医药
Key words He-Ne laser , Tympanic membrane, Corti's organ, Vestibulum function
目前国内外已广泛应用He-Ne激光照射鼓膜治疗渗出性中耳炎、大疱性鼓膜炎和急性化脓性中耳炎等中耳疾病，经临床观察均取得一定疗效。为了研究He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构和前庭功能是否有影响，以指导临床治疗，进一步提高听力，防止并发症，我们进行了动物实验。分别行光学显微镜、扫描电镜和透射电镜检查，观察He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构的影响。
实验一 研究He-Ne激光照射鼓膜对内耳显微结构的影响
一、实验动物
选取听力正常、体重约500 g的杂色豚鼠34只，随机分为六组，如表1。第6组2只，为对照组。
, 百拇医药
二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数。见表1。
豚鼠用鼠夹盒固定，将He-Ne激光光纤置入豚鼠耳道后方，光纤末端距耳道口2 mm行激光照射。1～24号豚鼠照射10次后立即处死，25～32号照射10次后，饲养10天处死，行耳蜗低温混合石蜡切片。
(二)取材和固定：将豚鼠以5%硫贲妥钠注入腹腔麻醉，剂量为15 mg/100g体重。处死后，迅速取下颞骨，打开听泡，暴露鼓膜、听骨链和骨性耳蜗。打开蜗顶、取出镫骨，刺破圆窗膜，用较细滴管将Bouin氏液由蜗顶小孔反复灌注1 min～2 min，然后将骨性耳蜗连同部分颞骨浸入Bouin氏液固定24 h。
表1 He-Ne激光照射1～6组豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.1 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
, http://www.100md.com
Animal
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
, http://www.100md.com
功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
1
1～6
4
, 百拇医药
6
14.1
5(No. 1,2)
10(No. 3,4)
15(No. 5,6)
10
2
7～12
8(No. 7～9)
10(No. 10～12)
6
28.3
, 百拇医药 35.4
5(No. 7～9)
10(No. 10～12)
10
3
13～18
12
6
42.4
5(No. 13,14)
10(No. 15,16)
15(No. 17,18)
, http://www.100md.com
10
4
19～24
16
6
56.6
5(No. 19,20)
10(No. 21,22)
15(No. 23,24)
10
5
25,26
27,28
, http://www.100md.com
29,30
31,32
4
8
12
16
6
14.1
28.3
42.4
56.6
10(No. 25,27,29,31)
15(No. 26,28,30,32)
, http://www.100md.com
10
6
33,34
0
0
0
0
0
注：10、19、27号豚鼠在照射过程中或饲养中死亡
Note: The guinea pigs No.10, 19, and 27 died during laser irradiation or the breeding period.
(三)制作切片：
, 百拇医药
1.将骨性耳蜗从固定液中取出，流水冲洗3 min～5 min后，置入5%三氯醋酸水溶液中脱钙5 h～24 h。
2.将标本置于由低浓度至高浓度的酒精内脱水，每种浓度浸泡4 h～5 h。
3.浸入正丁醇石蜡媒剂4 h～6 h。
4.置于低温混合石蜡Ⅰ和Ⅱ中各浸渍1.5 h，而后包埋。
5.切片厚5 μm，HE染色，光学显微镜观察。
三、实验结果
见表1，第1～3组和25～30号动物经不同功率密度(14.1 mW/cm2、28.3 mW/cm2、35.4 mW/cm2和42.4 mW/cm2)的He-Ne激光照射后，Corti氏器无明显变化，与对照组相似。第4组标本见Corti氏器内Claudius细胞和边界细胞内有些空泡。第31和32号动物标本的Corti氏器未见恢复，与照射后立即处死的标本相似。
, 百拇医药
实验二 研究He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳扫描电镜的超微结构影响
一、实验动物
取听力正常杂色豚鼠30只，随机平均分为六组。第12组2只，为对照组。
表2 7～12组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.2 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
Animal
groups
豚鼠号数
Animal
, 百拇医药
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
, 百拇医药
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
7
35～40
4
6
14.1
5(No. 35,36)
10(No. 37,38)
, http://www.100md.com
15(No. 39,40)
10
8
41～46
8(No. 41～44)
10(No. 45,46)
6
28.3
35.4
5(No. 41,42)
10(No. 43～46)
10
, http://www.100md.com
9
47～52
12
6
42.4
5(No. 47,48)
10(No. 49,50)
15(No. 51,52)
10
10
53～58
16
6
, 百拇医药
56.6
5(No. 53,54)
10(No. 55,56)
15(No. 57,58)
10
11
59
60
61
62
4
8
12
, 百拇医药
16
6
14.1
28.3
42.4
56.6
5(No. 59～62右耳 Right ear)
10(No. 59和61左耳 Left ear)
15(No. 60,62左耳 Left ear)
10
12
63～64
, 百拇医药
0
0
0
0
0
二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的方法：同实验一，参数见表2。35～58号豚鼠照射后立即处死。59～62号豚鼠照射10次后，饲养10天再处死，电镜观察。63，64号豚鼠系对照组。
(二)取材和固定：将7～12组豚鼠处死，取出颞骨，暴露耳蜗。在解剖显微镜下，用细针将蜗尖挑开小孔，取出镫骨，刺破圆窗膜，用细滴管将2.5%戊二醛液由蜗尖小孔灌流入蜗管10次，把标本放入戊二醛中固定2 h。用磷酸缓冲液漂洗2次。将耳蜗放入1%锇酸中固定1 h，继用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗1 h。在解剖镜下剥去蜗壳，除去螺旋韧带和前庭膜，制成耳蜗标本。
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(三)制作切片：将标本放在2%单宁酸液中浸2次，每次30 min，用磷酸缓冲液漂洗1 h，经梯度酒精脱水各2 min，再用纯醋酸异戊酯浸泡2 h后，将标本干燥。用导电胶粘到钢座上，经离子溅射仪镀膜，行扫描电镜观察。
三、实验结果
43号鼠在照射中死亡。7，8组和47，48号动物实验的结果与对照组(图1)相似。说明所用的功率密度对Corti氏器无明显影响。49～52号标本外毛细胞和静纤毛排列紊乱，纤毛形态不规则，部分变短、变矮，部分缺损；51，52号标本比49，50号的改变更明显，程度更重(图2和3)。53～56号标本除上述改变外，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残存不齐，部分消失，部分只有很短微绒毛(图4)。57，58号标本上述改变更明显。11组照射后再饲养10天处死，其耳蜗改变与相应照射剂量组大致相似。
, 百拇医药
图1 63号豚鼠耳蜗扫描电镜检查(对照组) 正常内、外毛细胞和静纤毛(第三圈) ×1 500
Fig.1 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.63 (control). The inner and outer
hair cells and stereocilia show a normal appearance(third circle). ×1 500
图2 50号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱，第三排静纤毛变形、倒伏(第二圈) ×1 500
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Fig.2 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.50. The outer hair cells are
disordered. The third array of stereocilia are deformed and lodging(second circle). ×1 500
图3 51号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱。静纤毛变形，变短矮，部分缺失。
内毛细胞和静纤毛完整(第三圈) ×2 000
Fig.3 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.51. The outer hair cells are disordered,deformed, shortened and some of them are lost. The stereocilia are complete(third circle). ×2 000
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图4 56号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱。静纤毛部分变短矮，部分变形或缺失。
内毛细胞境界不清，静纤毛几乎消失，只有很短的微绒毛(第三圈) ×3 000
Fig.4 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.56. The outer hair cells are disordered.
The stereocilia are shortened, deformed and some of them disappeared. The structure of inner hair cells is vague.
The stereocilia almost disappeared completely and only a few short microcilia left(third circle). ×3 000
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实验三 He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳透射电镜超微结构的影响
一、实验动物
听力正常的豚鼠28只，随机分为六组，第13～17组每组4只，第18组2只，为对照组。
二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的方法：同实验一，参数见表3。65～80号照射10次后立即处死。81～84号照射10次后饲养10天处死，电镜检查。表3 13～18组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.3 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
Animal
, 百拇医药
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
功率密度
, http://www.100md.com
Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
13
65～68
4
6
, 百拇医药
14.1
5(No. 65～67右耳Right ear)
10(No. 65～67左耳Lift ear)
15(No. 68)
10
14
69～72
8(No. 69,70,71右耳
Right ear)
10(No. 71左耳
Left ear,No.72)
, 百拇医药
6
28.3
35.4
5(No. 69～71右耳 Right ear)
10(No. 69～71左耳Left ear,72)
10
15
73～76
12
6
42.4
5(No. 73～75右耳Right ear)
, 百拇医药
10(No. 73～75左耳Left ear)
15(No. 76)
10
16
77～80
16
6
56.6
5(No. 77～79右耳Right ear)
10(No. 77～79左耳Left ear)
15(No. 80)
, 百拇医药 10
17
81～84
4(No. 81)
8(No. 82)
12(No. 83)
16(No. 84)
6
14.1
28.3
42.4
56.6
5(No. 81～84右耳Right ear)
, 百拇医药
10(No. 81,83左耳Left ear)
15(No. 82,84左耳Left ear)
10
18
85～86
0
0
0
0
0
(二)取材和固定：同实验二。
(三)制作切片：将标本经0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗4 h，在解剖镜下去除蜗壳，取下螺旋韧带和各圈上、下半圈螺旋器，用1%锇酸固定2 h，置入梯度酒精脱水后包埋，经半薄切片染色及定向后行超薄切片，铀染，行透射电镜观察。
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三、实验结果
65～76号豚鼠耳蜗内的内、外毛细胞、支持细胞和有鞘神经纤维结构均完整，与对照组相似。77～80号和84号内毛细胞境界不清，Claudius细胞和边界细胞内细胞浆部分溶解。
实验四 研究He-Ne激光照射鼓膜对前庭功能的影响
一、实验动物
听力正常的杂色豚鼠40只，随机分为五组，每组8只。第19～22组系实验组，第23组为对照组。
二、实验方法
同实验一，参数见表4。19～22组豚鼠分别在激光照射鼓膜10次前后检查前庭功能。以60 r/min的转速使动物水平旋转20 s后，立即观察眼球震颤持续时间，计算眼震抑制率。
, 百拇医药
眼震抑制率=〔(He-Ne激光照射前眼震时间-He-Ne激光照射10次后眼震时间)/He-Ne激光照射前眼震时间〕×100%
眼震抑制率的大小表示前庭功能受损的程度。抑制率愈大，前庭功能受损愈明显。
三、实验结果
见表5。19～22组分别与对照组比较，经统计学处理，P均>0.05，差异无显著意义。说明输出功率密度为14.1 mW/cm2、28.3 mW/cm2、42.4 mW/cm2和56.6 mW/cm2的He-Ne激光照射豚鼠鼓膜10 min，每天1次，照射10次后对前庭功能无明显影响。表4 19～23组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.4 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
, http://www.100md.com
Animal
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
, 百拇医药
功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
19
87～94
4
, 百拇医药
6
14.1
10
10
20
95～102
8
6
28.3
10
10
21
103～110
, http://www.100md.com 12
6
42.4
10
10
22
111～118
16
6
56.6
10
10
23
119～126
, http://www.100md.com
0
0
0
0
0
表5 各组豚鼠的眼震抑制率(%)
Tab.5 The inhibition rate of nystagmus in various groups of the guinea pigs(%) 编号
Organ numbers
19组
Group 19
20组
, http://www.100md.com
Group 20
21组
Group 21
22组
Group 22
23组(对照组)
23 Group(Control)
1
9
0
11
0
16
, 百拇医药
2
10
5
0
5
6
3
0
0
8
7
0
4
6
, http://www.100md.com
10
9
7
4
5
5
17
15
12
13
6
13
9
0
, 百拇医药
14
15
7
15
14
0
13
9
8
17
5
21
16
8
, 百拇医药
t值 t value
0.18
0.47
0.27
0.14
P值 P value
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
讨 论
一、He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳的影响因功率密度不同而异。光纤末端输出功率8 mW、功率密度28.3 mW/cm2、每天照射5 min～15 min，输出功率10mW、功率密度35.4 mW/cm2、每天照射10 min和输出功率12 mW、功率密度42.4mW/cm2、每天照射5 min，连续照射10天后，对内耳一般无影响。光纤末端输出功率12 mW、功率密度42.4 mW/cm2、每天照射10min～15min，连续照射10天后，可使Corti氏器外毛细胞和静纤毛排列紊乱，纤毛形态不规则。当功率达16 mW、功率密度56.6 mW/cm2时，除上述改变外，Claudius细胞和边界细胞内发生空泡，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残存不齐，部分消失。功率愈大、照射时间愈长，耳蜗结构改变愈明显，但对前庭功能无明显影响。提示临床上用He-Ne激光照射鼓膜治疗渗出性中耳炎等病变时，光纤末端输出功率应控制在10mW、功率密度35.4mW/cm2、每天照射1次，每次10 min，以10次为宜。否则可能损伤Corti氏器、影响听力。
, 百拇医药
二、静纤毛散乱与其劲度有关。Tilney[1]认为这是静纤毛内肌动蛋白微丝结构形式以及微丝间分子交联桥的变化引起的。当肌动蛋白微丝结构形式变化或其间的交联桥发生分解时，肌动蛋白微丝变得相当柔软，整个静纤毛劲度大为下降。多数学者认为上述变化是静纤毛早期损伤的表现。本实验当光纤末端输出功率达12 mW、功率密度42.4 mW/cm2时，则出现上述改变。
三、根据Davis的电池学说原理，静纤毛的剪切运动在耳蜗机械运动—生物电效应中起着“扳机”式的触发作用。静纤毛损伤时，此作用受到影响，因而出现听力下降。细胞内的变化则为代谢改变时的标志[2]。
Liberman等[3]认为正常耳蜗神经对低和中等声强的反应，可能是外毛细胞的兴奋经盖膜机械性传至内毛细胞长静纤毛的结果。而对80 dB～90dB的声强刺激反应，则与其短静纤毛的兴奋相关。同时证明，单纯长静纤毛全部缺如时，与之相关联的耳蜗神经纤维最大的自发放电率比正常减少1/3[4]。
, 百拇医药
本实验当He-Ne激光光纤末端输出功率达12 mW时，外毛细胞和静纤毛发生障碍，故损伤的听力可能为低音和中音。当光纤输出功率达16 mW(功率密度56.6
mW/cm2)时，内、外毛细胞和静纤毛均受影响，故听力的下降可能影响到高、中、低音。 参 考 文 献
1.Tilney LG: Organization of actin filaments in the stereocilla of cochlear haircell. J Cell Boil, 1980, 86：244.
2.林基桢：急性细菌性中耳炎耳蜗超微结构观察.中华耳鼻咽喉科杂志，1990，25：72.
3.Liberman MC, Dodds LW. Acute ultrastructural changes in acostic trauma: serial-section reconstruction of stereocilia and cuticular plates. Hear Res, 1987, 26：45.
4.Liberman MC, Dodds LW. Single-neuron labeling and chronic cochlear pathology. Ⅱ. Stereocilia damage and alterations of spontaneous discharge rates. Hear Res, 1984, 16：43.
(1996年1月30日收稿 1998年2月27日修回), 百拇医药
单位：江苏省南通市南通医学院附属医院耳鼻科(226001)
关键词：He-Ne激光；鼓膜；Corti氏器；前庭功能
中国激光医学杂志980305Influence of He-Ne Laser Irradiation on the Structure of the
Inner Ear and Vestibulum Function of Guinea Pigs
Jiang Xin, Cai Changsong, Cai Ping
Department of Otorhinolaryngology, The Affiliated Hospital of Nantong Medical
, 百拇医药
College, Nantong, Jiangsu(226001)
摘要 为了探讨He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构和前庭功能的影响，用不同功率密度的He-Ne激光照射豚鼠鼓膜，观察内耳结构及前庭功能的变化。结果发现He-Ne激光每天照射豚鼠鼓膜10 min～15 min，连续10天后，当光纤末端输出功率密度为42.4 mW/cm2时，Corti氏器外毛细胞和静纤毛排列紊乱；当光纤末端输出功率密度为56.6 mW/cm2时，除上述改变外，还有Corti氏器变形，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残缺不齐，部分消失，Claudius细胞和边界细胞内出现空泡；当功率密度为35.4 mW/cm2时，内耳结构无改变。上述功率密度的激光照射豚鼠鼓膜，对前庭功能均无影响。提示临床上用He-Ne激光照射鼓膜治疗中耳病变时，其光纤末端输出功率密度应控制在35.4 mW/cm2以下，每天照射时间不宜超过15 min，连续照射以10天为宜，否则可能影响听力。
, 百拇医药
ABSTRACT
The purpose of this study is to investigate the influence of He-Ne laser irradiation of tympanic membrane on the structure of inner ear and on the vestibulum function. The impairment of the structure in the inner ear was examined by light and electron microscopy and the vestibulum function was tested after He-Ne laser irradiation to the guinea pig tympanic membrane with various power densities. It is demonstrated that after the laser irradiation at 42.4 mW/cm2 for 10 or 15 minutes once a day for 10 days, the outer hair cells and stereocilia in the Corti's organ are disarranged. When the power density of 56.6 mW/cm2 was used there were deformation of the Corti's organ, vague appearance of inner hair cells, regional disorder or loss of stereocilia and vacuolization of Claudius cells and border cells, but the vestibulum function was well preserved. When a power density of 35.4 mW/cm2 was used, the Corti's organ was normal. It is suggested that when the tympanic membrane is irradiated by He-Ne laser, in order to avoid any possible damage to hearing, the output power density from the optic fiber tip should be controlled under 35.4 mW/cm2, the irradiation time not longer than 15 minutes, and no more than 10 times for a session.
, 百拇医药
Key words He-Ne laser , Tympanic membrane, Corti's organ, Vestibulum function
目前国内外已广泛应用He-Ne激光照射鼓膜治疗渗出性中耳炎、大疱性鼓膜炎和急性化脓性中耳炎等中耳疾病，经临床观察均取得一定疗效。为了研究He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构和前庭功能是否有影响，以指导临床治疗，进一步提高听力，防止并发症，我们进行了动物实验。分别行光学显微镜、扫描电镜和透射电镜检查，观察He-Ne激光照射鼓膜对内耳结构的影响。
实验一 研究He-Ne激光照射鼓膜对内耳显微结构的影响
一、实验动物
选取听力正常、体重约500 g的杂色豚鼠34只，随机分为六组，如表1。第6组2只，为对照组。
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二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数。见表1。
豚鼠用鼠夹盒固定，将He-Ne激光光纤置入豚鼠耳道后方，光纤末端距耳道口2 mm行激光照射。1～24号豚鼠照射10次后立即处死，25～32号照射10次后，饲养10天处死，行耳蜗低温混合石蜡切片。
(二)取材和固定：将豚鼠以5%硫贲妥钠注入腹腔麻醉，剂量为15 mg/100g体重。处死后，迅速取下颞骨，打开听泡，暴露鼓膜、听骨链和骨性耳蜗。打开蜗顶、取出镫骨，刺破圆窗膜，用较细滴管将Bouin氏液由蜗顶小孔反复灌注1 min～2 min，然后将骨性耳蜗连同部分颞骨浸入Bouin氏液固定24 h。
表1 He-Ne激光照射1～6组豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.1 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
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Animal
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
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功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
1
1～6
4
, 百拇医药
6
14.1
5(No. 1,2)
10(No. 3,4)
15(No. 5,6)
10
2
7～12
8(No. 7～9)
10(No. 10～12)
6
28.3
, 百拇医药 35.4
5(No. 7～9)
10(No. 10～12)
10
3
13～18
12
6
42.4
5(No. 13,14)
10(No. 15,16)
15(No. 17,18)
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10
4
19～24
16
6
56.6
5(No. 19,20)
10(No. 21,22)
15(No. 23,24)
10
5
25,26
27,28
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29,30
31,32
4
8
12
16
6
14.1
28.3
42.4
56.6
10(No. 25,27,29,31)
15(No. 26,28,30,32)
, http://www.100md.com
10
6
33,34
0
0
0
0
0
注：10、19、27号豚鼠在照射过程中或饲养中死亡
Note: The guinea pigs No.10, 19, and 27 died during laser irradiation or the breeding period.
(三)制作切片：
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1.将骨性耳蜗从固定液中取出，流水冲洗3 min～5 min后，置入5%三氯醋酸水溶液中脱钙5 h～24 h。
2.将标本置于由低浓度至高浓度的酒精内脱水，每种浓度浸泡4 h～5 h。
3.浸入正丁醇石蜡媒剂4 h～6 h。
4.置于低温混合石蜡Ⅰ和Ⅱ中各浸渍1.5 h，而后包埋。
5.切片厚5 μm，HE染色，光学显微镜观察。
三、实验结果
见表1，第1～3组和25～30号动物经不同功率密度(14.1 mW/cm2、28.3 mW/cm2、35.4 mW/cm2和42.4 mW/cm2)的He-Ne激光照射后，Corti氏器无明显变化，与对照组相似。第4组标本见Corti氏器内Claudius细胞和边界细胞内有些空泡。第31和32号动物标本的Corti氏器未见恢复，与照射后立即处死的标本相似。
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实验二 研究He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳扫描电镜的超微结构影响
一、实验动物
取听力正常杂色豚鼠30只，随机平均分为六组。第12组2只，为对照组。
表2 7～12组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.2 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
Animal
groups
豚鼠号数
Animal
, 百拇医药
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
, 百拇医药
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
7
35～40
4
6
14.1
5(No. 35,36)
10(No. 37,38)
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15(No. 39,40)
10
8
41～46
8(No. 41～44)
10(No. 45,46)
6
28.3
35.4
5(No. 41,42)
10(No. 43～46)
10
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9
47～52
12
6
42.4
5(No. 47,48)
10(No. 49,50)
15(No. 51,52)
10
10
53～58
16
6
, 百拇医药
56.6
5(No. 53,54)
10(No. 55,56)
15(No. 57,58)
10
11
59
60
61
62
4
8
12
, 百拇医药
16
6
14.1
28.3
42.4
56.6
5(No. 59～62右耳 Right ear)
10(No. 59和61左耳 Left ear)
15(No. 60,62左耳 Left ear)
10
12
63～64
, 百拇医药
0
0
0
0
0
二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的方法：同实验一，参数见表2。35～58号豚鼠照射后立即处死。59～62号豚鼠照射10次后，饲养10天再处死，电镜观察。63，64号豚鼠系对照组。
(二)取材和固定：将7～12组豚鼠处死，取出颞骨，暴露耳蜗。在解剖显微镜下，用细针将蜗尖挑开小孔，取出镫骨，刺破圆窗膜，用细滴管将2.5%戊二醛液由蜗尖小孔灌流入蜗管10次，把标本放入戊二醛中固定2 h。用磷酸缓冲液漂洗2次。将耳蜗放入1%锇酸中固定1 h，继用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗1 h。在解剖镜下剥去蜗壳，除去螺旋韧带和前庭膜，制成耳蜗标本。
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(三)制作切片：将标本放在2%单宁酸液中浸2次，每次30 min，用磷酸缓冲液漂洗1 h，经梯度酒精脱水各2 min，再用纯醋酸异戊酯浸泡2 h后，将标本干燥。用导电胶粘到钢座上，经离子溅射仪镀膜，行扫描电镜观察。
三、实验结果
43号鼠在照射中死亡。7，8组和47，48号动物实验的结果与对照组(图1)相似。说明所用的功率密度对Corti氏器无明显影响。49～52号标本外毛细胞和静纤毛排列紊乱，纤毛形态不规则，部分变短、变矮，部分缺损；51，52号标本比49，50号的改变更明显，程度更重(图2和3)。53～56号标本除上述改变外，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残存不齐，部分消失，部分只有很短微绒毛(图4)。57，58号标本上述改变更明显。11组照射后再饲养10天处死，其耳蜗改变与相应照射剂量组大致相似。
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图1 63号豚鼠耳蜗扫描电镜检查(对照组) 正常内、外毛细胞和静纤毛(第三圈) ×1 500
Fig.1 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.63 (control). The inner and outer
hair cells and stereocilia show a normal appearance(third circle). ×1 500
图2 50号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱，第三排静纤毛变形、倒伏(第二圈) ×1 500
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Fig.2 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.50. The outer hair cells are
disordered. The third array of stereocilia are deformed and lodging(second circle). ×1 500
图3 51号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱。静纤毛变形，变短矮，部分缺失。
内毛细胞和静纤毛完整(第三圈) ×2 000
Fig.3 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.51. The outer hair cells are disordered,deformed, shortened and some of them are lost. The stereocilia are complete(third circle). ×2 000
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图4 56号豚鼠耳蜗扫描电镜检查 外毛细胞排列紊乱。静纤毛部分变短矮，部分变形或缺失。
内毛细胞境界不清，静纤毛几乎消失，只有很短的微绒毛(第三圈) ×3 000
Fig.4 A SEM micrograph of the cochlea of the guinea pig No.56. The outer hair cells are disordered.
The stereocilia are shortened, deformed and some of them disappeared. The structure of inner hair cells is vague.
The stereocilia almost disappeared completely and only a few short microcilia left(third circle). ×3 000
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实验三 He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳透射电镜超微结构的影响
一、实验动物
听力正常的豚鼠28只，随机分为六组，第13～17组每组4只，第18组2只，为对照组。
二、实验方法
(一)He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的方法：同实验一，参数见表3。65～80号照射10次后立即处死。81～84号照射10次后饲养10天处死，电镜检查。表3 13～18组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.3 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
Animal
, 百拇医药
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
功率密度
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Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
13
65～68
4
6
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14.1
5(No. 65～67右耳Right ear)
10(No. 65～67左耳Lift ear)
15(No. 68)
10
14
69～72
8(No. 69,70,71右耳
Right ear)
10(No. 71左耳
Left ear,No.72)
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6
28.3
35.4
5(No. 69～71右耳 Right ear)
10(No. 69～71左耳Left ear,72)
10
15
73～76
12
6
42.4
5(No. 73～75右耳Right ear)
, 百拇医药
10(No. 73～75左耳Left ear)
15(No. 76)
10
16
77～80
16
6
56.6
5(No. 77～79右耳Right ear)
10(No. 77～79左耳Left ear)
15(No. 80)
, 百拇医药 10
17
81～84
4(No. 81)
8(No. 82)
12(No. 83)
16(No. 84)
6
14.1
28.3
42.4
56.6
5(No. 81～84右耳Right ear)
, 百拇医药
10(No. 81,83左耳Left ear)
15(No. 82,84左耳Left ear)
10
18
85～86
0
0
0
0
0
(二)取材和固定：同实验二。
(三)制作切片：将标本经0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗4 h，在解剖镜下去除蜗壳，取下螺旋韧带和各圈上、下半圈螺旋器，用1%锇酸固定2 h，置入梯度酒精脱水后包埋，经半薄切片染色及定向后行超薄切片，铀染，行透射电镜观察。
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三、实验结果
65～76号豚鼠耳蜗内的内、外毛细胞、支持细胞和有鞘神经纤维结构均完整，与对照组相似。77～80号和84号内毛细胞境界不清，Claudius细胞和边界细胞内细胞浆部分溶解。
实验四 研究He-Ne激光照射鼓膜对前庭功能的影响
一、实验动物
听力正常的杂色豚鼠40只，随机分为五组，每组8只。第19～22组系实验组，第23组为对照组。
二、实验方法
同实验一，参数见表4。19～22组豚鼠分别在激光照射鼓膜10次前后检查前庭功能。以60 r/min的转速使动物水平旋转20 s后，立即观察眼球震颤持续时间，计算眼震抑制率。
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眼震抑制率=〔(He-Ne激光照射前眼震时间-He-Ne激光照射10次后眼震时间)/He-Ne激光照射前眼震时间〕×100%
眼震抑制率的大小表示前庭功能受损的程度。抑制率愈大，前庭功能受损愈明显。
三、实验结果
见表5。19～22组分别与对照组比较，经统计学处理，P均>0.05，差异无显著意义。说明输出功率密度为14.1 mW/cm2、28.3 mW/cm2、42.4 mW/cm2和56.6 mW/cm2的He-Ne激光照射豚鼠鼓膜10 min，每天1次，照射10次后对前庭功能无明显影响。表4 19～23组He-Ne激光照射豚鼠鼓膜的功率、时间和次数
Tab.4 The power, time, and times of He-Ne laser irradiation used to the tympanic membrane 编组
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Animal
groups
豚鼠号数
Animal
numbers
输出功率
Output power
(mW)
光斑直径
Light spot
diameter
(mm)
, 百拇医药
功率密度
Power density
(mW/cm2)
照射时间
Irradiation time
(min)
照射次数
Times of
irradiation
19
87～94
4
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6
14.1
10
10
20
95～102
8
6
28.3
10
10
21
103～110
, http://www.100md.com 12
6
42.4
10
10
22
111～118
16
6
56.6
10
10
23
119～126
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0
0
0
0
0
表5 各组豚鼠的眼震抑制率(%)
Tab.5 The inhibition rate of nystagmus in various groups of the guinea pigs(%) 编号
Organ numbers
19组
Group 19
20组
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Group 20
21组
Group 21
22组
Group 22
23组(对照组)
23 Group(Control)
1
9
0
11
0
16
, 百拇医药
2
10
5
0
5
6
3
0
0
8
7
0
4
6
, http://www.100md.com
10
9
7
4
5
5
17
15
12
13
6
13
9
0
, 百拇医药
14
15
7
15
14
0
13
9
8
17
5
21
16
8
, 百拇医药
t值 t value
0.18
0.47
0.27
0.14
P值 P value
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
讨 论
一、He-Ne激光照射豚鼠鼓膜对内耳的影响因功率密度不同而异。光纤末端输出功率8 mW、功率密度28.3 mW/cm2、每天照射5 min～15 min，输出功率10mW、功率密度35.4 mW/cm2、每天照射10 min和输出功率12 mW、功率密度42.4mW/cm2、每天照射5 min，连续照射10天后，对内耳一般无影响。光纤末端输出功率12 mW、功率密度42.4 mW/cm2、每天照射10min～15min，连续照射10天后，可使Corti氏器外毛细胞和静纤毛排列紊乱，纤毛形态不规则。当功率达16 mW、功率密度56.6 mW/cm2时，除上述改变外，Claudius细胞和边界细胞内发生空泡，内毛细胞境界不清，静纤毛部分残存不齐，部分消失。功率愈大、照射时间愈长，耳蜗结构改变愈明显，但对前庭功能无明显影响。提示临床上用He-Ne激光照射鼓膜治疗渗出性中耳炎等病变时，光纤末端输出功率应控制在10mW、功率密度35.4mW/cm2、每天照射1次，每次10 min，以10次为宜。否则可能损伤Corti氏器、影响听力。
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二、静纤毛散乱与其劲度有关。Tilney[1]认为这是静纤毛内肌动蛋白微丝结构形式以及微丝间分子交联桥的变化引起的。当肌动蛋白微丝结构形式变化或其间的交联桥发生分解时，肌动蛋白微丝变得相当柔软，整个静纤毛劲度大为下降。多数学者认为上述变化是静纤毛早期损伤的表现。本实验当光纤末端输出功率达12 mW、功率密度42.4 mW/cm2时，则出现上述改变。
三、根据Davis的电池学说原理，静纤毛的剪切运动在耳蜗机械运动—生物电效应中起着“扳机”式的触发作用。静纤毛损伤时，此作用受到影响，因而出现听力下降。细胞内的变化则为代谢改变时的标志[2]。
Liberman等[3]认为正常耳蜗神经对低和中等声强的反应，可能是外毛细胞的兴奋经盖膜机械性传至内毛细胞长静纤毛的结果。而对80 dB～90dB的声强刺激反应，则与其短静纤毛的兴奋相关。同时证明，单纯长静纤毛全部缺如时，与之相关联的耳蜗神经纤维最大的自发放电率比正常减少1/3[4]。
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本实验当He-Ne激光光纤末端输出功率达12 mW时，外毛细胞和静纤毛发生障碍，故损伤的听力可能为低音和中音。当光纤输出功率达16 mW(功率密度56.6
mW/cm2)时，内、外毛细胞和静纤毛均受影响，故听力的下降可能影响到高、中、低音。 参 考 文 献
1.Tilney LG: Organization of actin filaments in the stereocilla of cochlear haircell. J Cell Boil, 1980, 86：244.
2.林基桢：急性细菌性中耳炎耳蜗超微结构观察.中华耳鼻咽喉科杂志，1990，25：72.
3.Liberman MC, Dodds LW. Acute ultrastructural changes in acostic trauma: serial-section reconstruction of stereocilia and cuticular plates. Hear Res, 1987, 26：45.
4.Liberman MC, Dodds LW. Single-neuron labeling and chronic cochlear pathology. Ⅱ. Stereocilia damage and alterations of spontaneous discharge rates. Hear Res, 1984, 16：43.
(1996年1月30日收稿 1998年2月27日修回), 百拇医药