神经节苷脂GM1对阿尔采默病β-淀粉样蛋白前体代谢的影响
作者：张岱 阮燕 Konrad Beyreuther 周东丰 沈渔
单位：100083 北京医科大学精神卫生研究所(张岱、阮燕、周东丰、沈渔)；德国海德堡分子生物学中心(Konrad Beyreuther)
关键词：阿尔采默病；淀粉样β蛋白；神经节苷脂类
中华医学杂志980306 【摘要】 目的 研究外源性神经节苷脂GM1干扰细胞β-淀粉样蛋白前体代谢的作用，探讨GM1与阿尔采默病特征性病理变化老年斑和其他淀粉样病变形成的关系。 方法 选用人类β-淀粉样蛋白前体基因(APP695)转染细胞模型，用同位素代谢标记方法测定GM1对细胞β-淀粉样蛋白前体代谢及其水解产物分泌性β-淀粉样蛋白前体释放的影响；用Western印迹和斑点印迹法分析GM1与重组β-淀粉样蛋白前体的亲和性。 结果 GM1干扰细胞β-淀粉样蛋白前体的水解代谢和抑制分泌性β-淀粉样蛋白前体的释放，GM1与β-淀粉样蛋白前体特异性结合。 结论 GM1代谢异常可能与阿尔采默病脑淀粉样蛋白聚积和沉淀有关。
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Effect of ganglioside GM1 on the metabolism of Alzheimer amyloid β-protein precursor Zhang Dai, Ruan Yan, Beyreuther K, et al. Institute of Mental Health, Beijing Medical University, 100083 Beijing, Center for Molecular Biology, University of Heidelberg. 69120 Heidelberg, Germany
【Abstract】 Objective To study the effect of GM1 ganglioside interfering the metabolism of amyloid β-protein precursor (APP) on cells for exploring the relationship between GM1 and development of Alzheimer senile plaques and the other amyloidoses. Methods GM1 influencing the metabolism of APP and the release of its metabolite secretory APP on human APP695 cDNA transfected cells were detected by metabolic radiolabeling. The affinity of GM1 and recombinant secretory APP was analyzed by Western blot and dot blot. Results GM1 specifically bound APP, and interfered the proteolysis of APP and inhibited the release of secretory APP on cells. Conclusion The abnormal metabolism of GM1 may contribute to the aggregation and deposition of amyloid β-protein in Alzheimer brains.
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【Key words】 Alzheimer′s disease Amyloid beta-protein Gangliosides
(Natl Med J China, 1998, 78:179～182)
β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是构成阿尔采默病(AD)脑特征性病变老年斑的核心成分，也是AD脑神经纤维缠结以及血管淀粉样变性的生化基础[1，2]；有研究提示，β-淀粉样蛋白前体(amyloid β-protein precursor, APP)的异常水解过程能促使Aβ生成增加，故而探讨APP水解代谢的有关影响因素有助于阐明Aβ的生成机制。神经节苷脂GM1是细胞膜重要组成部分，位于脂双层外层，在中枢神经系统的含量最为丰富。虽尚不清楚确切生理机制，但既往研究提示，GM1参与细胞代谢、信号传递，是某些毒素蛋白特异性受体等[3，4]。近期研究发现，AD脑GM1含量增加[5]，老年斑有GM1成分[6，7]，提示GM1可能参与AD的病理变化。另一方面，因GM1可能有改善记忆力以及具有神经修复的功能，某些学者倾向于试用GM1治疗AD[8]。近来GM1与AD关系的研究逐渐受到重视，也颇有争议，是一个值得深入探讨的领域。本研究选用人类APP695基因转染细胞模型以及重组蛋白等实验材料，试图了解GM1是否具有影响细胞APP水解、促进Aβ分泌的作用。
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材料与方法
一、材料
1.细胞模型：人类APP695基因转染人神经母细胞瘤细胞株(HY-SY5Y)可稳定表达人类APP695野生型(德国海德堡大学分子生物学中心提供)[9]。
2.重组分泌性APP770(secretory APP770，简称APPs)由德国海德堡大学分子生物学中心提供[10]。
3.抗体：抗APP单克隆抗体22C11(Boehringer Mannheim公司产品)，抗Aβ1～16单克隆抗体W02(海国海德堡大学分子生物学中心提供)[11]，辣根过氧化物酶偶联霍乱毒素B亚单位(Sigma公司产品)，辣根过氧化物酶偶联抗鼠IgG(Amersham公司产品)。
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4.主要试剂：DMEM培养基、MEM培养基(Met-AA)、灭活胎牛血清、霍乱毒素B亚单位(CTB)和细胞培养级GM1(Sigma公司产品)，潮霉素B、蛋白质G-sepharose(Boehringer Mannheim公司产品)，35[S]标记甲硫氨酸、ECL Western blot发光试剂和胶片(Amersham公司产品)。
二、方法
1.细胞培养条件：将培养瓶中处于对数生长期的HY-SY5Y细胞(APP695)移至10 cm培养皿，加入10 ml DMEM培养基、10%灭活胎牛血清(FCS)和潮霉素B(0.4 μg/ml)，于37℃、5%CO2温箱培养，细胞贴壁生长直至其密度>90%。用于35[S]标记免疫沉淀实验的4组细胞弃培养液后用无血清培养基洗涤2次，分别加入3 ml不含甲硫氨酸MEM培养基(Met-AA)和100 μCi35[S]标记甲硫氨酸，除空白对照细胞仅加入PBS(pH 7.5)外，3组实验细胞分别加入10、50和100 μmol GM1(用PBS溶解，超声促溶)，细胞于37℃、5%CO2培养1～8小时。
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2.35[S]标记免疫沉淀法：分别收集4组细胞含同位素的培养基，于4℃离心(13 000 r/min)5分钟；移去培养液的细胞用预冷PBS(pH7.5)洗涤3次，用细胞裂解液(1% Triton X-100，1%脱氧胆酸，0.1% SDS)溶解细胞，4℃离心(13 000 r/min)10分钟。分别取上述培养基和细胞溶解物上清各0.1 ml于1.5 ml离心管，各管再加入0.9 ml PBS、5 μg W02和25 μl蛋白质G-Sepharose,4℃混和8小时，离心(5 000 r/min)5分钟；沉淀物用细胞裂解液洗涤、离心，重复该步骤5次，最后用Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤；离心后在沉淀物中加入15 μl Laemmli加样缓冲液，100℃加热5分钟，离心，取上清液上样。电泳前配制8%SDS-PAGE凝胶，电泳结束后凝胶用固定液固定30分钟，干燥后进行放射自显影。
3.GM1与重组APPs结合实验：(1)GM1分子量仅为1 547，而APPs分子量约为97 000，故GM1-APPs复合物在凝胶泳动位置几乎与APPs相同。本研究使用CTB作为GM1的载体(GM1是CTB特异性膜受体[4])，以减缓APPs-GM1-CTB的凝胶电泳迁移率。取2 μg重组APPs和10 μgGM1或2 μg重组APPs、10 μg GM1和4 μg CTB置于0.5 ml离心试管，室温孵育4小时，加入Laemmli加样缓冲液终止结合反应，70℃加热10分钟，离心后取上清液上样；电泳用6%SDS-PAGE凝胶，电泳结束后凝胶用考马斯蓝染色。(2)Western印迹法：取10 ng重组APPs和50 ng GM1或10 ng重组APPs、50 ngGM1和20 ngCTB置于0.5 ml离心试管，室温孵育4小时，电泳方法同(1)，电泳结束后蛋白质转移至硝酸纤维素膜(400 mA，4小时)，该膜用5%脱脂奶粉封闭1小时，PBS漂洗3次，加入22C11(1∶10 000稀释)室温孵育1小时，再用辣根过氧化物酶偶联抗鼠IgG孵育1小时，漂洗后用DAB显色。(3)斑点印迹法：各取0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、60和80 ng重组APP，分别在硝酸纤维素膜(0.2 μm)点样，该膜以5%脱脂奶粉封闭1小时后加0.4 mgGM1室温孵育4小时，用TBS(pH8.2)漂洗3次，再以辣根过氧化物酶偶联CTB温育1小时，用ECL系统检测。
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4.吸光度分析和统计分析：胶片上放射自显影和斑点印迹结果经AGFA ARCUS Ⅱ扫描仪读取，使用Fuji phosphoimager BAS 1 000软件系统定量测定，吸光度数值用SPSS软件配对t检验方法进行统计学分析。
结果
一、GM1抑制人类APP695基因转染细胞APP降解代谢和APPs的分泌
6次独立实验均得到相同结果。经同位素标记，HY-SY5Y细胞溶解物中APP的含量随GM1浓度增加而增长，与对照细胞比较，10 μmol GM1处理组APP含量增加1.21±0.16倍(t=3.24，P<0.05)，50 μmol和100 μmolGM1组分别增加1.78±0.25倍(t=5.78，P<0.01)和2.11±0.31倍(t=8.57，P<0.001)(图1)。细胞培养液中APPs的水平则随GM1剂量增加而下降(10 μmol GM1：0.92±0.12，t=1.49，P>0.05；50 μmol和100 μmol GM1分别为0.81±0.13，t=2.88，P<0.05和0.71±0.19，t=4.45，P<0.01)(图1)。此外，GM1影响细胞APP代谢的作用发生在GM1处理后第2小时，且与GM1剂量无关。
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二、GM1与重组APPs特异性结合
SDS-PAGE凝胶考马斯蓝染色结果表明，与第2泳道APPs标准比较，第4泳道GM1-CTB与APPs结合，使原位点APPs含量明显减少，在约185 000位置上出现APPs-GM1-CTB复合物条带，
A.免疫沉淀结果所示35[S]标记APP和APPs的含量变化；1.14[C]高分子量蛋白质标准；2：MEM培养基和50 μmol GM1；3、7：空白对照；4、8.10 μmol GM1；5、9.50 μmol GM1；6、10.100 μmol GM1；3～6.细胞培养液；7～10.细胞溶解物；B.棒状图所示APP和APPs吸光度分析结果，*P<0.05，**P<0.01，***P< 0.001；6例
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图1 GM1抑制细胞APP代谢和减少APPs分泌
1.高分子量蛋白质标准；2～5：APPs浓度均为2 μg；3、4、6：GM1浓度均为10μg；4～6.CTB浓度均为4μg
图2 第4泳道APPs-GM1-CTB缀合物形成
1.预染色高分子量蛋白质标准(Sigma)；2～5.APPs均为10ng；3、4、6.GM1浓度均为50ng；4～6.CTB浓度均为20ng
图3 抗APP抗体所示第4泳道APPs分子的迁移
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A.1.50 ng转铁蛋白；2～11.APPs点样浓度分别为0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、60和80 ng；B.吸光度分析结果所得GM1与APPs饱和结合曲线
图4 GM1与APPs特异性结合
第5泳道CTB与APPs无结合反应(图2)。Western印迹法表明第4泳道分子量约为185 000的蛋白带与特异性抗APP抗体22C11有免疫亲和性，证明APPs与GM1-CTB结合后其分子的迁移，22C11与GM1或CTB无交叉反应(图3)。SDS、β-巯基乙醇以及乙晴和丙酮等有机溶剂均不影响该结合反应。斑点印迹和饱和曲线显示GM1与APPs特异性结合(图4)。
讨论
APP是一种具有单一跨膜域的膜受体样结构的跨膜糖蛋白。虽尚不完全了解其生理功能，但已有研究表明，APP基因缺陷，动物神经机能不全以及出现异常行为[12]，APP主要水解产物APPs也具有调节细胞信号传导、促进神经元突触发生和细胞生长以及神经损伤修复的功能[2]。本研究表明，外源性GM1抑制人类APP695基因转染细胞APP水解代谢，造成过多APP聚积在细胞表面，可能影响其膜受体样生物效应；另外，GM1减少细胞APPs的释放，使APPs在细胞基质的含量下降，也使其正常生理功能受到不利影响。这一方面的研究有待深入进行。
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正常APP水解代谢仅产生少量Aβ，如果某因素促进APP异常水解，有利于细胞表面β和γ分泌酶加工途径，就能促使Aβ生成增加。我们发现，GM1与APP分子特异性结合(初步结果证明，GM1的结合位点位于APP分子的N末端氨基酸残基1-262)。作为APP配体，GM1可能在APP穿膜过程中与其结合，影响APP移动和内吞，并可能引起构象改变，不但抑制APP代谢和干扰其生物活性，也给APP分泌酶提供更多底物，引起细胞Aβ释放增多。我们发现，GM1促进APP基因转染细胞短Aβ(Aβ1-40)和长Aβ(Aβ1-42)的分泌(Aβ1-42与AD脑老年斑形成的关系更为密切)，支持上述观点。另一方面，我们曾证实，GM1能与细胞分泌的Aβ1-42和Aβ1-40特异性结合，尤与Aβ1-42亲和性更强(待发表)。GM1与Aβ的相互作用，除可能间接抑制了细胞Aβ水解酶对Aβ释放后的降解之外，亦降低了Aβ的溶解度，有利于长、短Aβ在细胞外的聚积和沉淀。
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本研究提供了GM1和APP特异性结合以及GM1干扰APP695基因转染细胞APP代谢的证据。这一结果对于探讨AD脑老年斑以及其他淀粉样病变的发生机制具有重要意义，也为筛选药物预防AD的发生提供了新线索。基于本研究和既往研究结果[5～7，13]，我们认为，GM1代谢平衡失调可能是AD的重要致病因素之一。如果AD病人存在GM1代谢障碍，GM1就有可能在细胞表面逐渐累积，进而干扰APP的自然水解过程，在影响APP生物效应的同时也使之朝向有利于Aβ生成途径转化；此外，GM1与Aβ的直接作用也可引起Aβ沉淀和聚积。当然，这一假说将在APP转基因动物和AD病人的研究中加以证实。我们也将进一步研究GM1与APP和Aβ相互作用的生化机制，并设计阻断GM1与以上两者结合的药物，试用于动物模型AD的预防和治疗。无论如何，我们和他人的研究结果均不支持临床应用GM1治疗AD。
本课题为国家教委回国人员基金、中华医学基金和德国科学研究基金资助项目
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参考文献
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9 Weidemann A, Konig G, Bunke D, et al. Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer′s disease A4 amyloid protein. Cell, 1989,57：115-126.
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12 Zheng H, Jiang M, Trumbatter ME, et al. β-Amyloid precursor protein deficent mice show reactive gliosis and decreased locomotor activity. Cell, 1995,81：525-531.
13 Choo-Smith LP, Surewcz WK. The interaction between Alzheimer′s amyloid beta(1-40) peptide and ganglioside GM1-containing membranes. FEBS Lett, 1997,3：95-98. (收稿：1997-09-30 修回：1997-12-08)
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单位：100083 北京医科大学精神卫生研究所(张岱、阮燕、周东丰、沈渔)；德国海德堡分子生物学中心(Konrad Beyreuther)
关键词：阿尔采默病；淀粉样β蛋白；神经节苷脂类
中华医学杂志980306 【摘要】 目的 研究外源性神经节苷脂GM1干扰细胞β-淀粉样蛋白前体代谢的作用，探讨GM1与阿尔采默病特征性病理变化老年斑和其他淀粉样病变形成的关系。 方法 选用人类β-淀粉样蛋白前体基因(APP695)转染细胞模型，用同位素代谢标记方法测定GM1对细胞β-淀粉样蛋白前体代谢及其水解产物分泌性β-淀粉样蛋白前体释放的影响；用Western印迹和斑点印迹法分析GM1与重组β-淀粉样蛋白前体的亲和性。 结果 GM1干扰细胞β-淀粉样蛋白前体的水解代谢和抑制分泌性β-淀粉样蛋白前体的释放，GM1与β-淀粉样蛋白前体特异性结合。 结论 GM1代谢异常可能与阿尔采默病脑淀粉样蛋白聚积和沉淀有关。
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【Abstract】 Objective To study the effect of GM1 ganglioside interfering the metabolism of amyloid β-protein precursor (APP) on cells for exploring the relationship between GM1 and development of Alzheimer senile plaques and the other amyloidoses. Methods GM1 influencing the metabolism of APP and the release of its metabolite secretory APP on human APP695 cDNA transfected cells were detected by metabolic radiolabeling. The affinity of GM1 and recombinant secretory APP was analyzed by Western blot and dot blot. Results GM1 specifically bound APP, and interfered the proteolysis of APP and inhibited the release of secretory APP on cells. Conclusion The abnormal metabolism of GM1 may contribute to the aggregation and deposition of amyloid β-protein in Alzheimer brains.
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【Key words】 Alzheimer′s disease Amyloid beta-protein Gangliosides
(Natl Med J China, 1998, 78:179～182)
β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)是构成阿尔采默病(AD)脑特征性病变老年斑的核心成分，也是AD脑神经纤维缠结以及血管淀粉样变性的生化基础[1，2]；有研究提示，β-淀粉样蛋白前体(amyloid β-protein precursor, APP)的异常水解过程能促使Aβ生成增加，故而探讨APP水解代谢的有关影响因素有助于阐明Aβ的生成机制。神经节苷脂GM1是细胞膜重要组成部分，位于脂双层外层，在中枢神经系统的含量最为丰富。虽尚不清楚确切生理机制，但既往研究提示，GM1参与细胞代谢、信号传递，是某些毒素蛋白特异性受体等[3，4]。近期研究发现，AD脑GM1含量增加[5]，老年斑有GM1成分[6，7]，提示GM1可能参与AD的病理变化。另一方面，因GM1可能有改善记忆力以及具有神经修复的功能，某些学者倾向于试用GM1治疗AD[8]。近来GM1与AD关系的研究逐渐受到重视，也颇有争议，是一个值得深入探讨的领域。本研究选用人类APP695基因转染细胞模型以及重组蛋白等实验材料，试图了解GM1是否具有影响细胞APP水解、促进Aβ分泌的作用。
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材料与方法
一、材料
1.细胞模型：人类APP695基因转染人神经母细胞瘤细胞株(HY-SY5Y)可稳定表达人类APP695野生型(德国海德堡大学分子生物学中心提供)[9]。
2.重组分泌性APP770(secretory APP770，简称APPs)由德国海德堡大学分子生物学中心提供[10]。
3.抗体：抗APP单克隆抗体22C11(Boehringer Mannheim公司产品)，抗Aβ1～16单克隆抗体W02(海国海德堡大学分子生物学中心提供)[11]，辣根过氧化物酶偶联霍乱毒素B亚单位(Sigma公司产品)，辣根过氧化物酶偶联抗鼠IgG(Amersham公司产品)。
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4.主要试剂：DMEM培养基、MEM培养基(Met-AA)、灭活胎牛血清、霍乱毒素B亚单位(CTB)和细胞培养级GM1(Sigma公司产品)，潮霉素B、蛋白质G-sepharose(Boehringer Mannheim公司产品)，35[S]标记甲硫氨酸、ECL Western blot发光试剂和胶片(Amersham公司产品)。
二、方法
1.细胞培养条件：将培养瓶中处于对数生长期的HY-SY5Y细胞(APP695)移至10 cm培养皿，加入10 ml DMEM培养基、10%灭活胎牛血清(FCS)和潮霉素B(0.4 μg/ml)，于37℃、5%CO2温箱培养，细胞贴壁生长直至其密度>90%。用于35[S]标记免疫沉淀实验的4组细胞弃培养液后用无血清培养基洗涤2次，分别加入3 ml不含甲硫氨酸MEM培养基(Met-AA)和100 μCi35[S]标记甲硫氨酸，除空白对照细胞仅加入PBS(pH 7.5)外，3组实验细胞分别加入10、50和100 μmol GM1(用PBS溶解，超声促溶)，细胞于37℃、5%CO2培养1～8小时。
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2.35[S]标记免疫沉淀法：分别收集4组细胞含同位素的培养基，于4℃离心(13 000 r/min)5分钟；移去培养液的细胞用预冷PBS(pH7.5)洗涤3次，用细胞裂解液(1% Triton X-100，1%脱氧胆酸，0.1% SDS)溶解细胞，4℃离心(13 000 r/min)10分钟。分别取上述培养基和细胞溶解物上清各0.1 ml于1.5 ml离心管，各管再加入0.9 ml PBS、5 μg W02和25 μl蛋白质G-Sepharose,4℃混和8小时，离心(5 000 r/min)5分钟；沉淀物用细胞裂解液洗涤、离心，重复该步骤5次，最后用Tris缓冲液(pH 7.4)洗涤；离心后在沉淀物中加入15 μl Laemmli加样缓冲液，100℃加热5分钟，离心，取上清液上样。电泳前配制8%SDS-PAGE凝胶，电泳结束后凝胶用固定液固定30分钟，干燥后进行放射自显影。
3.GM1与重组APPs结合实验：(1)GM1分子量仅为1 547，而APPs分子量约为97 000，故GM1-APPs复合物在凝胶泳动位置几乎与APPs相同。本研究使用CTB作为GM1的载体(GM1是CTB特异性膜受体[4])，以减缓APPs-GM1-CTB的凝胶电泳迁移率。取2 μg重组APPs和10 μgGM1或2 μg重组APPs、10 μg GM1和4 μg CTB置于0.5 ml离心试管，室温孵育4小时，加入Laemmli加样缓冲液终止结合反应，70℃加热10分钟，离心后取上清液上样；电泳用6%SDS-PAGE凝胶，电泳结束后凝胶用考马斯蓝染色。(2)Western印迹法：取10 ng重组APPs和50 ng GM1或10 ng重组APPs、50 ngGM1和20 ngCTB置于0.5 ml离心试管，室温孵育4小时，电泳方法同(1)，电泳结束后蛋白质转移至硝酸纤维素膜(400 mA，4小时)，该膜用5%脱脂奶粉封闭1小时，PBS漂洗3次，加入22C11(1∶10 000稀释)室温孵育1小时，再用辣根过氧化物酶偶联抗鼠IgG孵育1小时，漂洗后用DAB显色。(3)斑点印迹法：各取0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、60和80 ng重组APP，分别在硝酸纤维素膜(0.2 μm)点样，该膜以5%脱脂奶粉封闭1小时后加0.4 mgGM1室温孵育4小时，用TBS(pH8.2)漂洗3次，再以辣根过氧化物酶偶联CTB温育1小时，用ECL系统检测。
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4.吸光度分析和统计分析：胶片上放射自显影和斑点印迹结果经AGFA ARCUS Ⅱ扫描仪读取，使用Fuji phosphoimager BAS 1 000软件系统定量测定，吸光度数值用SPSS软件配对t检验方法进行统计学分析。
结果
一、GM1抑制人类APP695基因转染细胞APP降解代谢和APPs的分泌
6次独立实验均得到相同结果。经同位素标记，HY-SY5Y细胞溶解物中APP的含量随GM1浓度增加而增长，与对照细胞比较，10 μmol GM1处理组APP含量增加1.21±0.16倍(t=3.24，P<0.05)，50 μmol和100 μmolGM1组分别增加1.78±0.25倍(t=5.78，P<0.01)和2.11±0.31倍(t=8.57，P<0.001)(图1)。细胞培养液中APPs的水平则随GM1剂量增加而下降(10 μmol GM1：0.92±0.12，t=1.49，P>0.05；50 μmol和100 μmol GM1分别为0.81±0.13，t=2.88，P<0.05和0.71±0.19，t=4.45，P<0.01)(图1)。此外，GM1影响细胞APP代谢的作用发生在GM1处理后第2小时，且与GM1剂量无关。
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二、GM1与重组APPs特异性结合
SDS-PAGE凝胶考马斯蓝染色结果表明，与第2泳道APPs标准比较，第4泳道GM1-CTB与APPs结合，使原位点APPs含量明显减少，在约185 000位置上出现APPs-GM1-CTB复合物条带，
A.免疫沉淀结果所示35[S]标记APP和APPs的含量变化；1.14[C]高分子量蛋白质标准；2：MEM培养基和50 μmol GM1；3、7：空白对照；4、8.10 μmol GM1；5、9.50 μmol GM1；6、10.100 μmol GM1；3～6.细胞培养液；7～10.细胞溶解物；B.棒状图所示APP和APPs吸光度分析结果，*P<0.05，**P<0.01，***P< 0.001；6例
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图1 GM1抑制细胞APP代谢和减少APPs分泌
1.高分子量蛋白质标准；2～5：APPs浓度均为2 μg；3、4、6：GM1浓度均为10μg；4～6.CTB浓度均为4μg
图2 第4泳道APPs-GM1-CTB缀合物形成
1.预染色高分子量蛋白质标准(Sigma)；2～5.APPs均为10ng；3、4、6.GM1浓度均为50ng；4～6.CTB浓度均为20ng
图3 抗APP抗体所示第4泳道APPs分子的迁移
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A.1.50 ng转铁蛋白；2～11.APPs点样浓度分别为0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、60和80 ng；B.吸光度分析结果所得GM1与APPs饱和结合曲线
图4 GM1与APPs特异性结合
第5泳道CTB与APPs无结合反应(图2)。Western印迹法表明第4泳道分子量约为185 000的蛋白带与特异性抗APP抗体22C11有免疫亲和性，证明APPs与GM1-CTB结合后其分子的迁移，22C11与GM1或CTB无交叉反应(图3)。SDS、β-巯基乙醇以及乙晴和丙酮等有机溶剂均不影响该结合反应。斑点印迹和饱和曲线显示GM1与APPs特异性结合(图4)。
讨论
APP是一种具有单一跨膜域的膜受体样结构的跨膜糖蛋白。虽尚不完全了解其生理功能，但已有研究表明，APP基因缺陷，动物神经机能不全以及出现异常行为[12]，APP主要水解产物APPs也具有调节细胞信号传导、促进神经元突触发生和细胞生长以及神经损伤修复的功能[2]。本研究表明，外源性GM1抑制人类APP695基因转染细胞APP水解代谢，造成过多APP聚积在细胞表面，可能影响其膜受体样生物效应；另外，GM1减少细胞APPs的释放，使APPs在细胞基质的含量下降，也使其正常生理功能受到不利影响。这一方面的研究有待深入进行。
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正常APP水解代谢仅产生少量Aβ，如果某因素促进APP异常水解，有利于细胞表面β和γ分泌酶加工途径，就能促使Aβ生成增加。我们发现，GM1与APP分子特异性结合(初步结果证明，GM1的结合位点位于APP分子的N末端氨基酸残基1-262)。作为APP配体，GM1可能在APP穿膜过程中与其结合，影响APP移动和内吞，并可能引起构象改变，不但抑制APP代谢和干扰其生物活性，也给APP分泌酶提供更多底物，引起细胞Aβ释放增多。我们发现，GM1促进APP基因转染细胞短Aβ(Aβ1-40)和长Aβ(Aβ1-42)的分泌(Aβ1-42与AD脑老年斑形成的关系更为密切)，支持上述观点。另一方面，我们曾证实，GM1能与细胞分泌的Aβ1-42和Aβ1-40特异性结合，尤与Aβ1-42亲和性更强(待发表)。GM1与Aβ的相互作用，除可能间接抑制了细胞Aβ水解酶对Aβ释放后的降解之外，亦降低了Aβ的溶解度，有利于长、短Aβ在细胞外的聚积和沉淀。
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本研究提供了GM1和APP特异性结合以及GM1干扰APP695基因转染细胞APP代谢的证据。这一结果对于探讨AD脑老年斑以及其他淀粉样病变的发生机制具有重要意义，也为筛选药物预防AD的发生提供了新线索。基于本研究和既往研究结果[5～7，13]，我们认为，GM1代谢平衡失调可能是AD的重要致病因素之一。如果AD病人存在GM1代谢障碍，GM1就有可能在细胞表面逐渐累积，进而干扰APP的自然水解过程，在影响APP生物效应的同时也使之朝向有利于Aβ生成途径转化；此外，GM1与Aβ的直接作用也可引起Aβ沉淀和聚积。当然，这一假说将在APP转基因动物和AD病人的研究中加以证实。我们也将进一步研究GM1与APP和Aβ相互作用的生化机制，并设计阻断GM1与以上两者结合的药物，试用于动物模型AD的预防和治疗。无论如何，我们和他人的研究结果均不支持临床应用GM1治疗AD。
本课题为国家教委回国人员基金、中华医学基金和德国科学研究基金资助项目
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