类风湿关节炎病人滑膜细胞增生与fas和bcl-2基因的表达
作者：
张兴民 蒋明 郑德先 刘峰 肖声
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫内科(张兴民、蒋明、刘峰)；基础医学研究所生化室(郑德先、肖声)
关键词：关节炎，类风湿；滑膜；基因表达
中华医学杂志980305 【摘要】 目的 探讨类风湿关节炎(RA)病人滑膜细胞增生是否与细胞凋亡有关。 方法 通过体外转录合成，并标记fas及其配体(fasL)和bcl-2 RNA探针，应用原位杂交方法检测19例滑膜组织的基因表达。用免疫组织化学方法检测蛋白表达。用DNA电泳和流式细胞分析仪检测细胞凋亡。结果 7例RA病人滑膜衬里层细胞明显增生，其中6例有fas mRNA表达，5例表达bcl-2，而fasL mRNA在所有病例均不表达。在RA滑膜衬里层中，bcl-2mRNA总是伴随fas而表达，且fas和bcl-2的表达率较骨性关节炎(OA)及正常对照者(NC)明显增高(P<0.05)。免疫组织化学结果表明，fas和bcl-2蛋白在滑膜衬里层有表达。从6例RA、4例OA病人及3例正常对照者滑膜组织中提取DNA，仅1例OA病人可见典型的DNA梯形图形。培养的RA和OA病人滑 膜细胞经流式细胞分析仪检测，表明自发凋亡的细胞很少(<5%)。结论 RA病人滑膜细胞内不存在明显的细胞凋亡现象，bcl-2过量表达可能抑制了RA滑膜细胞凋亡，是RA滑膜细胞增生的原因之一。
, 百拇医药
Rheumatoid arthritis synoviocyte hyperplasia and expression of fas and bcl-2 genes Zhang Xingmin, Jiang Ming, Zheng Dexian, et al. Department of Clinical Immunology ＆ Rheumatology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To determine whether apoptosis occurs in the proliferative synovial tissue and cells from patients with rheumatoid arthritis (RA). Methods In situ hybridization was carried out by using labeled RNA probes of fas, fasL, and bcl-2 synthesized by in vitro transcription. Apoptosis was examined by DNA electrophoresis and flow cytometry. Results fas mRNAs were expressed in 6 of 7 patients with RA. bcl-2 mRNAs were positive in 5 of 7 patients with RA. fasL mRNAs were not detectable in all the patients. bcl-2 mRNAs were always coexpressed with fas in RA synovial lining cells. The positive rates of fas and bcl-2 expression in RA synovial tissues were significantly higher than those of patients with osteoarthritis (OA) and normal synovial tissues (P<0.05). Immunochemistry staining showed that Fas and Bcl-2 proteins were expressed in the synovial lining cells. Nucleic DNA extracted from the synovial tissues of 6 patients with RA, 4 patients with OA and 2 normal controls. Agarose gel electrophoresis demonstrated that DNA ladders occurred in only one OA synovial tissue. The spontaneous apoptosis in cultured synoviocytes from patients with RA and OA was lower as analyzed by immunofluorescence staining and flow cytometry. Conclusion The phenomena of apoptosis in RA synoviocytes was not significant and overexpression of bcl-2 perhaps inhibited apoptosis in these cells, leading to hyperplasia of RA synoviocytes.
, 百拇医药
【Key words】 Arthritis, rheumatoid Synoviocyte meinbrane Gene expression
(Natl Med J China, 1998, 78：175-178)
类风湿关节炎(RA)的病理特征之一为滑膜细胞大量增生、炎性细胞侵润及血管翳形成，其机制尚不清楚，有人提出类风湿关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的减弱有关[1]，但缺乏实验证据。我们通过检测RA、骨性关节炎(OA)病人和正常对照者滑膜组织中fas及其配体(fasL)和bcl-2 mRNA和蛋白的表达及滑膜组织细胞凋亡情况，探讨RA滑膜增生与细胞凋亡的关系。
对象和方法
一、对象
19例滑膜组织标本来自北京医科大学人民医院骨科和本院骨科，均为手术时取材，其中RA病人7例，OA病人9例，正常对照者(来自骨折病人)3例。所有病人均符合国际公认的诊断标准。
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二、方法
1.标本处理：手术取下滑膜组织，包埋后，立即放入液氮内保存。
2.fas和bcl-2 cDNA的亚克隆：分别将含有人fas和bcl-2的pCDM8和pBabe Puro质粒(由中国医学科学院基础医学研究所生化室提供)转化到DH5α大肠杆菌内。将pCDM8内的fas cDNA用内切酶XhoⅠ和PstⅠ切下，再用Klenow酶将XhoⅠ端补平。pBabe Puro质粒DNA则用EcoRⅠ和Sal Ⅱ切下bcl-2 cDNA。分别将fas和bcl-2的cDNA定向克隆到pGEM-4Z质粒(购自Promega公司)中，将重组质粒转化JM109菌，蓝白斑筛选重组质粒，得到重组质粒pGEM-4Z/fas和pGEM-4Z/bcl-2。
3.fasL质粒的鉴定、扩增及提取：用KpnⅠ和ScaⅠ将pBluescript SK质粒内人fasL cDNA切开，电泳后可见0.85kb的cDNA片断，按常规方法提取质粒DNA。
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4.fas、fasL及bcl-2的正义和反义RNA探针的制备：分别用内切酶将质粒线性化，按地高辛RNA标记试剂盒(宝灵曼公司产品)说明，用RNA聚合酶进行体外转录及标记反义和正义RNA探针。
5.原位杂交：将滑膜组织切成8 μm的冰冻切片粘于多聚赖氨酸处理过的玻片上，于4%多聚甲醛液中固定10分钟，磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)浸洗5分钟，2次，然后参照文献[2]方法进行杂交，用NBT/BCIP染色10分钟。
6.HE染色：常规HE染色方法。
7.免疫组织化学检测fas和bcl-2蛋白：切片经3%过氧化氢处理，10%正常羊血清封闭，加入1∶50倍稀释的兔抗人fas和bcl-2抗体(北京中山生物公司)，4℃过夜。加入羊抗兔IgG抗体，37℃反应1小时。冲洗后加入1∶100的过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP法)，室温反应30分钟，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。将胞膜呈棕黄色者定为阳性。
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8.滑膜细胞DNA电泳[3]：以大蒜素诱导的Molt-4凋亡细胞为阳性对照。
9.滑膜细胞培养及流式细胞分析[4]：培养7～10天的滑膜细胞经0.25%胰酶消化，收集细胞。PBS液冲洗2次，用70%的乙醇固定细胞。去除固定液，将细胞悬浮于0.4 ml PBS液中，加10μl浓度为5 mg/ml的RNA酶，37℃消化1小时。最后加入25 μl 1 mg/ml的碘化丙啶，4℃过夜，流式细胞分析仪分析细胞凋亡。
10.统计学处理：显著性检验用χ2检验。
结果
一、RA病人滑膜衬里层细胞明显增生
HE染色发现7例RA病人的滑膜细胞均明显增生，滑膜衬里层细胞由5～10层细胞组成，细胞数明显增多，下层有大量淋巴细胞浸润，有血管翳形成，血管壁内皮有少量淋巴细胞浸润。而OA病人滑膜衬里层有2～5层细胞，下层很少有淋巴细胞侵润。正常对照者有1～2层滑膜衬里层细胞，下层富
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图1 原位杂交检测RA滑膜细胞fas mRNA的表达，NBT/BCIP染色，呈蓝紫色者为杂交阳性的细胞 ×400 图2 原位杂交检测RA滑膜细胞bcl-2 mRNA表达，NBT/BCIP染色，呈蓝紫色者为杂交阳性的细胞 ×200 图3 免疫组织化学法检测RA滑膜细胞Fas蛋白的表达，DAB染色和苏木素复染，胞浆呈棕黄色者为阳性 ×200
含胶原组织及脂肪组织。
二、滑膜组织内fas，fasL和bcl-2mRNA的表达
fas和bcl-2在RA病人滑膜衬里层细胞内mRNA表达明显高于OA病人和正常对照者(P<0.05)，见图1，2。3例正常对照者滑膜组织内均不表达bcl-2，而有1例fas阳性，在所有对象的滑膜衬里层细胞内未见fasL mRNA表达。其结果见附表。
附表 fas、fasL及bcl-2mRNA在滑膜衬里层
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细胞中的表达比例 组别
例数
fas
bcl-2
fasL
正常对照
3
1/3
0/3
0
类风湿关节炎
7
6/7*
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5/7*
0
骨性关节炎
9
5/9
2/9
0
注：与其他两组比较*P均<0.05
三、滑膜衬里层细胞fas蛋白和bcl-2蛋白的表达
免疫组织化学显示，在19例滑膜组织中所有fas和bcl-2 mRNA表达阳性的标本其相应的fas和bcl-2蛋白亦阳性(图3)。
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四、滑膜细胞DNA电泳
6例RA病人、4例OA病人及2例正常的滑膜组织中仅1例OA病人可见典型的DNA阶梯图形(图4)。
1.标准DNA分子；2.阳性对照(Molt4细胞)；
3，4.RA滑膜细胞；5，6.OA滑膜细胞
图4 滑膜细胞DNA电泳
五、流式细胞分析结果
对2例RA和2例OA病人培养的滑膜细胞经流式细胞分析表明，凋亡细胞数较少(均<5%)，且两者比较差别无显著意义(P>0.05)。
讨论
, 百拇医药
最近，Firestein等[5]报道RA及OA病人滑膜组织内有细胞凋亡现象，且RA病人滑膜细胞凋亡较OA病人更为明显，电泳可见典型的DNA阶梯图形。但这一结果不能解释病人滑膜增生非常明显的事实。而我们在RA病人滑膜组织细胞内未检测到DNA阶梯图形，且培养的滑膜细胞经流式细胞分析仪检测表明，RA和OA病人的滑膜细胞内凋亡的细胞较少，均小于5%，说明RA病人滑膜细胞不因过度增生而出现过多的细胞凋亡，符合其病理特点。
细胞凋亡是受多基因调控的，有些基因如fas、肿瘤坏死因子(TNF)α等基因诱导凋亡，而bcl-2、p53等基因抑制凋亡的发生。fas蛋白是一种细胞膜表面受体，属于TNF家族，与fasL结合后引起细胞凋亡。fas蛋白可在大多数胸腺细胞，激活的人T和B细胞以及一些肿瘤细胞表面表达。而fasL则主要在 激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞中表达[6]。有报道，fas蛋白可在RA和OA病人滑膜细胞表达，与抗fas抗体结合后可诱导滑膜细胞凋亡，表明滑膜细胞表面的fas具有传导凋亡信号的功能[3]。本实验中，fas mRNA在RA病人中表达率较高，提示RA增生的滑膜衬里层细胞可能处于激活状态，如果环境中有其配体的存在，则可诱导凋亡的发生。然而，我们在滑膜衬里层未发现fasL mRNA的表达，说明滑膜衬里层细胞本身不能同时表达fas和fasL诱导自身细胞的凋亡。许多因素可上调fas的表达，如干扰素-γ(IFN-γ)上调成纤维细胞fas的表达；TNFα诱导滑膜细胞fas表达增强，通过与TNFα受体结合，诱导滑膜细胞凋亡[5]。有实验表明RA病人滑膜细胞分泌IFN-γ，TNFα较正常增加，因此，RA滑膜细胞fas表达增高可能与关节液内这些细胞因子水平增高有关。
, 百拇医药
bcl-2基因是在滤泡性淋巴瘤细胞中染色体易位t(14∶18)的断点上发现的一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能。有学者证明bcl-2的过量表达可抑制fas介导的细胞凋亡[7]，但也有的实验结果表明，bcl-2不能抑制fas介导的胸腺细胞，B淋巴样细胞以及激活T细胞的凋亡。Sugiyama等[8]用免疫组织化学证实在RA滑膜细胞过度表达bcl-2、p53、p21及c-myc，而在正常人滑膜细胞中这些蛋白均不表达，认为bcl-2的过量表达可能抑制了RA病人滑膜细胞凋，而p53、p21及c-myc对凋亡过程基本无影响。我们的研究结果支持了这一推测，在7例RA病人有5例同时表达fas和bcl-2，而在9例OA病人中仅有1例同时表达这两种基因。提示，RA病人滑膜胞的增生可能与bcl-2过量表达有关。但RA病人滑膜细胞bcl-2的表达是否抑制fas介导的细胞的凋亡，尚需深入研究。
免疫组织化学分析表明，fas和bcl-2 mRNA的表达与其蛋白表达一致，说明fas、bcl-2 mRNA均可在滑膜细胞内翻译成蛋白质，使其在相应的部位表达，发挥各自的生物学功能。
, 百拇医药
本研究结果表明，RA滑膜细胞凋亡相关基因表达异常，细胞凋亡并不 随滑膜细胞过度增生而增加，导致细胞增生与凋亡的不平衡，这可能是RA滑膜细胞增生的主要原因之一。由于本试验病例数较少，尚无法确切阐明滑膜细胞凋亡在RA发病中的作用，但抗fas抗体及某些药物可诱导滑 膜细胞发生凋亡，向关节炎小鼠的关节腔内注射抗fas抗体可明显减轻关节滑膜炎，提示我们可以应用细胞凋亡理论来探索RA发病的机制及治疗的新方法。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Mountz JD, Wu JG, Cheng JH, et al. Autoimmune disease: a problem of defective apoptosis. Arthritis Rheum, 1994, 37：1415-1420.
2 李占淳，黄岩，石爱荣.应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA.解剖学报，1994，25：：323-326.
, 百拇医药
3 Nakajima T, Aono H, Hasunuma T, et al. Apoptosis and functional Fas antigen in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum, 1995, 38：485-491.
4 Alvaro-Gracia JM, Zvaifler MN, Firestein GS. Cytokines in chronic inflammatory arthritis. V. Mutual antgonism between interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on HLA-DR expression, proliferation, collagenase production, and granulocyte marcrophage colony-stimulating factor production by rheumatoid arthritis synoviocytes. J Clin Invest, 1990, 86：1790-1798.
, 百拇医药
5 Firestein GS, Yeo M, Zvaifler NJ. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovium. J Clin Invest, 1995, 96：1631-1638.
6 Ngata S. Apoptosis regulated by a death factor and its recepter: Fas Ligand and Fas. Phi Trans Act Roy Soc, 1994, 345：281-286.
7 Itoh N, Tsujimoto T, Nagata S. Effect of bcl-2 on Fas antigen-mediated cell death. J Immunol, 1993, 151：621-627.
8 Sugiyama M, Tsukazaki T, Yoneckura A, et al. Location of apoptosis and related proteins in the synovium of patients with rheumatiod arthritis. Ann Rheum Dis, 1996, 55：442-449. (收稿：1996-12-18 修回：1997-07-15), http://www.100md.com
张兴民 蒋明 郑德先 刘峰 肖声
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫内科(张兴民、蒋明、刘峰)；基础医学研究所生化室(郑德先、肖声)
关键词：关节炎，类风湿；滑膜；基因表达
中华医学杂志980305 【摘要】 目的 探讨类风湿关节炎(RA)病人滑膜细胞增生是否与细胞凋亡有关。 方法 通过体外转录合成，并标记fas及其配体(fasL)和bcl-2 RNA探针，应用原位杂交方法检测19例滑膜组织的基因表达。用免疫组织化学方法检测蛋白表达。用DNA电泳和流式细胞分析仪检测细胞凋亡。结果 7例RA病人滑膜衬里层细胞明显增生，其中6例有fas mRNA表达，5例表达bcl-2，而fasL mRNA在所有病例均不表达。在RA滑膜衬里层中，bcl-2mRNA总是伴随fas而表达，且fas和bcl-2的表达率较骨性关节炎(OA)及正常对照者(NC)明显增高(P<0.05)。免疫组织化学结果表明，fas和bcl-2蛋白在滑膜衬里层有表达。从6例RA、4例OA病人及3例正常对照者滑膜组织中提取DNA，仅1例OA病人可见典型的DNA梯形图形。培养的RA和OA病人滑 膜细胞经流式细胞分析仪检测，表明自发凋亡的细胞很少(<5%)。结论 RA病人滑膜细胞内不存在明显的细胞凋亡现象，bcl-2过量表达可能抑制了RA滑膜细胞凋亡，是RA滑膜细胞增生的原因之一。
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Rheumatoid arthritis synoviocyte hyperplasia and expression of fas and bcl-2 genes Zhang Xingmin, Jiang Ming, Zheng Dexian, et al. Department of Clinical Immunology ＆ Rheumatology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730
【Abstract】 Objective To determine whether apoptosis occurs in the proliferative synovial tissue and cells from patients with rheumatoid arthritis (RA). Methods In situ hybridization was carried out by using labeled RNA probes of fas, fasL, and bcl-2 synthesized by in vitro transcription. Apoptosis was examined by DNA electrophoresis and flow cytometry. Results fas mRNAs were expressed in 6 of 7 patients with RA. bcl-2 mRNAs were positive in 5 of 7 patients with RA. fasL mRNAs were not detectable in all the patients. bcl-2 mRNAs were always coexpressed with fas in RA synovial lining cells. The positive rates of fas and bcl-2 expression in RA synovial tissues were significantly higher than those of patients with osteoarthritis (OA) and normal synovial tissues (P<0.05). Immunochemistry staining showed that Fas and Bcl-2 proteins were expressed in the synovial lining cells. Nucleic DNA extracted from the synovial tissues of 6 patients with RA, 4 patients with OA and 2 normal controls. Agarose gel electrophoresis demonstrated that DNA ladders occurred in only one OA synovial tissue. The spontaneous apoptosis in cultured synoviocytes from patients with RA and OA was lower as analyzed by immunofluorescence staining and flow cytometry. Conclusion The phenomena of apoptosis in RA synoviocytes was not significant and overexpression of bcl-2 perhaps inhibited apoptosis in these cells, leading to hyperplasia of RA synoviocytes.
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【Key words】 Arthritis, rheumatoid Synoviocyte meinbrane Gene expression
(Natl Med J China, 1998, 78：175-178)
类风湿关节炎(RA)的病理特征之一为滑膜细胞大量增生、炎性细胞侵润及血管翳形成，其机制尚不清楚，有人提出类风湿关节炎滑膜细胞增殖与凋亡的减弱有关[1]，但缺乏实验证据。我们通过检测RA、骨性关节炎(OA)病人和正常对照者滑膜组织中fas及其配体(fasL)和bcl-2 mRNA和蛋白的表达及滑膜组织细胞凋亡情况，探讨RA滑膜增生与细胞凋亡的关系。
对象和方法
一、对象
19例滑膜组织标本来自北京医科大学人民医院骨科和本院骨科，均为手术时取材，其中RA病人7例，OA病人9例，正常对照者(来自骨折病人)3例。所有病人均符合国际公认的诊断标准。
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二、方法
1.标本处理：手术取下滑膜组织，包埋后，立即放入液氮内保存。
2.fas和bcl-2 cDNA的亚克隆：分别将含有人fas和bcl-2的pCDM8和pBabe Puro质粒(由中国医学科学院基础医学研究所生化室提供)转化到DH5α大肠杆菌内。将pCDM8内的fas cDNA用内切酶XhoⅠ和PstⅠ切下，再用Klenow酶将XhoⅠ端补平。pBabe Puro质粒DNA则用EcoRⅠ和Sal Ⅱ切下bcl-2 cDNA。分别将fas和bcl-2的cDNA定向克隆到pGEM-4Z质粒(购自Promega公司)中，将重组质粒转化JM109菌，蓝白斑筛选重组质粒，得到重组质粒pGEM-4Z/fas和pGEM-4Z/bcl-2。
3.fasL质粒的鉴定、扩增及提取：用KpnⅠ和ScaⅠ将pBluescript SK质粒内人fasL cDNA切开，电泳后可见0.85kb的cDNA片断，按常规方法提取质粒DNA。
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4.fas、fasL及bcl-2的正义和反义RNA探针的制备：分别用内切酶将质粒线性化，按地高辛RNA标记试剂盒(宝灵曼公司产品)说明，用RNA聚合酶进行体外转录及标记反义和正义RNA探针。
5.原位杂交：将滑膜组织切成8 μm的冰冻切片粘于多聚赖氨酸处理过的玻片上，于4%多聚甲醛液中固定10分钟，磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)浸洗5分钟，2次，然后参照文献[2]方法进行杂交，用NBT/BCIP染色10分钟。
6.HE染色：常规HE染色方法。
7.免疫组织化学检测fas和bcl-2蛋白：切片经3%过氧化氢处理，10%正常羊血清封闭，加入1∶50倍稀释的兔抗人fas和bcl-2抗体(北京中山生物公司)，4℃过夜。加入羊抗兔IgG抗体，37℃反应1小时。冲洗后加入1∶100的过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP法)，室温反应30分钟，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。将胞膜呈棕黄色者定为阳性。
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8.滑膜细胞DNA电泳[3]：以大蒜素诱导的Molt-4凋亡细胞为阳性对照。
9.滑膜细胞培养及流式细胞分析[4]：培养7～10天的滑膜细胞经0.25%胰酶消化，收集细胞。PBS液冲洗2次，用70%的乙醇固定细胞。去除固定液，将细胞悬浮于0.4 ml PBS液中，加10μl浓度为5 mg/ml的RNA酶，37℃消化1小时。最后加入25 μl 1 mg/ml的碘化丙啶，4℃过夜，流式细胞分析仪分析细胞凋亡。
10.统计学处理：显著性检验用χ2检验。
结果
一、RA病人滑膜衬里层细胞明显增生
HE染色发现7例RA病人的滑膜细胞均明显增生，滑膜衬里层细胞由5～10层细胞组成，细胞数明显增多，下层有大量淋巴细胞浸润，有血管翳形成，血管壁内皮有少量淋巴细胞浸润。而OA病人滑膜衬里层有2～5层细胞，下层很少有淋巴细胞侵润。正常对照者有1～2层滑膜衬里层细胞，下层富
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图1 原位杂交检测RA滑膜细胞fas mRNA的表达，NBT/BCIP染色，呈蓝紫色者为杂交阳性的细胞 ×400 图2 原位杂交检测RA滑膜细胞bcl-2 mRNA表达，NBT/BCIP染色，呈蓝紫色者为杂交阳性的细胞 ×200 图3 免疫组织化学法检测RA滑膜细胞Fas蛋白的表达，DAB染色和苏木素复染，胞浆呈棕黄色者为阳性 ×200
含胶原组织及脂肪组织。
二、滑膜组织内fas，fasL和bcl-2mRNA的表达
fas和bcl-2在RA病人滑膜衬里层细胞内mRNA表达明显高于OA病人和正常对照者(P<0.05)，见图1，2。3例正常对照者滑膜组织内均不表达bcl-2，而有1例fas阳性，在所有对象的滑膜衬里层细胞内未见fasL mRNA表达。其结果见附表。
附表 fas、fasL及bcl-2mRNA在滑膜衬里层
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细胞中的表达比例 组别
例数
fas
bcl-2
fasL
正常对照
3
1/3
0/3
0
类风湿关节炎
7
6/7*
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5/7*
0
骨性关节炎
9
5/9
2/9
0
注：与其他两组比较*P均<0.05
三、滑膜衬里层细胞fas蛋白和bcl-2蛋白的表达
免疫组织化学显示，在19例滑膜组织中所有fas和bcl-2 mRNA表达阳性的标本其相应的fas和bcl-2蛋白亦阳性(图3)。
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四、滑膜细胞DNA电泳
6例RA病人、4例OA病人及2例正常的滑膜组织中仅1例OA病人可见典型的DNA阶梯图形(图4)。
1.标准DNA分子；2.阳性对照(Molt4细胞)；
3，4.RA滑膜细胞；5，6.OA滑膜细胞
图4 滑膜细胞DNA电泳
五、流式细胞分析结果
对2例RA和2例OA病人培养的滑膜细胞经流式细胞分析表明，凋亡细胞数较少(均<5%)，且两者比较差别无显著意义(P>0.05)。
讨论
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最近，Firestein等[5]报道RA及OA病人滑膜组织内有细胞凋亡现象，且RA病人滑膜细胞凋亡较OA病人更为明显，电泳可见典型的DNA阶梯图形。但这一结果不能解释病人滑膜增生非常明显的事实。而我们在RA病人滑膜组织细胞内未检测到DNA阶梯图形，且培养的滑膜细胞经流式细胞分析仪检测表明，RA和OA病人的滑膜细胞内凋亡的细胞较少，均小于5%，说明RA病人滑膜细胞不因过度增生而出现过多的细胞凋亡，符合其病理特点。
细胞凋亡是受多基因调控的，有些基因如fas、肿瘤坏死因子(TNF)α等基因诱导凋亡，而bcl-2、p53等基因抑制凋亡的发生。fas蛋白是一种细胞膜表面受体，属于TNF家族，与fasL结合后引起细胞凋亡。fas蛋白可在大多数胸腺细胞，激活的人T和B细胞以及一些肿瘤细胞表面表达。而fasL则主要在 激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞中表达[6]。有报道，fas蛋白可在RA和OA病人滑膜细胞表达，与抗fas抗体结合后可诱导滑膜细胞凋亡，表明滑膜细胞表面的fas具有传导凋亡信号的功能[3]。本实验中，fas mRNA在RA病人中表达率较高，提示RA增生的滑膜衬里层细胞可能处于激活状态，如果环境中有其配体的存在，则可诱导凋亡的发生。然而，我们在滑膜衬里层未发现fasL mRNA的表达，说明滑膜衬里层细胞本身不能同时表达fas和fasL诱导自身细胞的凋亡。许多因素可上调fas的表达，如干扰素-γ(IFN-γ)上调成纤维细胞fas的表达；TNFα诱导滑膜细胞fas表达增强，通过与TNFα受体结合，诱导滑膜细胞凋亡[5]。有实验表明RA病人滑膜细胞分泌IFN-γ，TNFα较正常增加，因此，RA滑膜细胞fas表达增高可能与关节液内这些细胞因子水平增高有关。
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bcl-2基因是在滤泡性淋巴瘤细胞中染色体易位t(14∶18)的断点上发现的一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的功能。有学者证明bcl-2的过量表达可抑制fas介导的细胞凋亡[7]，但也有的实验结果表明，bcl-2不能抑制fas介导的胸腺细胞，B淋巴样细胞以及激活T细胞的凋亡。Sugiyama等[8]用免疫组织化学证实在RA滑膜细胞过度表达bcl-2、p53、p21及c-myc，而在正常人滑膜细胞中这些蛋白均不表达，认为bcl-2的过量表达可能抑制了RA病人滑膜细胞凋，而p53、p21及c-myc对凋亡过程基本无影响。我们的研究结果支持了这一推测，在7例RA病人有5例同时表达fas和bcl-2，而在9例OA病人中仅有1例同时表达这两种基因。提示，RA病人滑膜胞的增生可能与bcl-2过量表达有关。但RA病人滑膜细胞bcl-2的表达是否抑制fas介导的细胞的凋亡，尚需深入研究。
免疫组织化学分析表明，fas和bcl-2 mRNA的表达与其蛋白表达一致，说明fas、bcl-2 mRNA均可在滑膜细胞内翻译成蛋白质，使其在相应的部位表达，发挥各自的生物学功能。
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本研究结果表明，RA滑膜细胞凋亡相关基因表达异常，细胞凋亡并不 随滑膜细胞过度增生而增加，导致细胞增生与凋亡的不平衡，这可能是RA滑膜细胞增生的主要原因之一。由于本试验病例数较少，尚无法确切阐明滑膜细胞凋亡在RA发病中的作用，但抗fas抗体及某些药物可诱导滑 膜细胞发生凋亡，向关节炎小鼠的关节腔内注射抗fas抗体可明显减轻关节滑膜炎，提示我们可以应用细胞凋亡理论来探索RA发病的机制及治疗的新方法。
本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Mountz JD, Wu JG, Cheng JH, et al. Autoimmune disease: a problem of defective apoptosis. Arthritis Rheum, 1994, 37：1415-1420.
2 李占淳，黄岩，石爱荣.应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA.解剖学报，1994，25：：323-326.
, 百拇医药
3 Nakajima T, Aono H, Hasunuma T, et al. Apoptosis and functional Fas antigen in rheumatoid arthritis synoviocytes. Arthritis Rheum, 1995, 38：485-491.
4 Alvaro-Gracia JM, Zvaifler MN, Firestein GS. Cytokines in chronic inflammatory arthritis. V. Mutual antgonism between interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on HLA-DR expression, proliferation, collagenase production, and granulocyte marcrophage colony-stimulating factor production by rheumatoid arthritis synoviocytes. J Clin Invest, 1990, 86：1790-1798.
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