反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
作者：周玉杰 汪丽蕙 周爱儒 刘文军 朱晓君 陈光慧 牛大地 汤健
单位：100034 北京医科大学第一医院心内科[周玉杰现在中日友好医院心内科工作(北京，邮政编码100029)]
关键词：平滑肌；细胞；基因治疗；成纤维细胞生长因子
中华医学杂志980321 【摘要】 目的 应用反义N-ras1基因阻断成纤维细胞生长因子(bFGF)的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞(VSMC)增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法 利用构建的含反义N-ras1基因的逆转录病毒质粒(fpGv1-MT-Antisense N-ras1)转染于培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)，fpGv1-MT逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对bFGF诱导的VSMC的影响。 结果 反义N-ras1细胞数为(16.8±1.3)×104(细胞/ml)，空载质粒对照细胞为(30.1±1.2)×104，两者差异有显著意义(P<0.001)；反义N-ras1细胞3H-TdR掺入率为7 643±672(cpm)，空载质粒对照细胞为15 131±138(cpm)，两者差异有非常显著意义(P<0.001)，同时应用反义N-ras1基因的细胞Ras mRNA表达水平明显降低，其表达蛋白p21也明显降低。 结论 反义N-ras1基因对VSMC及bFGF诱导VSMC增殖有抑制作用。
, 百拇医药
Antisense N-ras1 gene inhibits the proliferation of VSMC induced by bFGF after arterial injury Zhou Yujie, Wang Lihui, Zhou Airu, et al. Department of Cardiology, First hospital, Beijing Medical University, Beijing 100029.
【Abstract】 Objective To develop a new way to prevent the process of restenosis after arterial injury, we transfer the recombinant antisense N-ras1 gene to the cultured SMCs and studied the influence of gene therapy with antisense N-ras1 on the SMCs proliferation induced by bFGF.Methods With the recombinant antisense N-ras1 plasmids (fpGv1-MT-N-ras1) transfered to the cultured SMC, we studied the effect on the SMCs proliferation induced by bFGF.Results The results of the experiment indicated that the count of cells transfered antisense N-ras1 was 16.8±1.3×104, the control cells transfered fpGv1-MT retrovirus vector were 30.1±1.2×104 (cell/ml) (P<0.001). cell [3H] thymedine incorporation was 7 643±672 cpm in gene therapy cells, and 15 131±138 cpm in vector control cells (P<0.001). Gene therapy cells ras mRNA and p21 were significantly decreased by Northern blotting and Western blotting technique.Conclusion These results suggest that antisense N-ras1 gene may inhibit the proliferation of cultured VSMC induced by bFGF.
, 百拇医药
【Key words】 Smooth muscle Cell gene therapy fibroblast growth factor
(Natl Med J China, 1998, 78：227-229)
血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖是血管介入治疗后再狭窄及高血压等心血管疾病的主要病理特征。现已证实上述心血管病VSMC增殖的重要因素是某些癌基因表达异常[1、2]。ras基因在细胞信息传递过程中起着重要的作用，是参与细胞增殖的重要基因[3]。成纤维细胞生长因子(bFGF)是强烈的细胞裂变原，能够刺激多种细胞的增殖。本实验利用反义N-ras1基因研究对其bFGF诱导下VSMCs增殖的影响。
材料和方法
一、材料
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N-ras1逆转录病毒重组质粒(fpGv1-MT-N-ras1)及逆转录病毒载体由北京医科大学心血管研究所提供，DNA限制性内切酶、bFGF购自美国Promega公司。
二、探针的制备[4]
扩增提取质粒，进行酶切鉴定。酚冻融法回收探针。采用随机引物法标记探针，探针经过Sephdex G50柱层板，分离标记的探针和游离核苷酸及同位素，收集洗脱液的第一峰，用液闪测定放射计数，计算掺入率和放射性比活。本实验掺入率都在60%以上，探针比活在2×108～3.3×109 cpm/μg DNA之间。
三、组织提取物的制备
断头处死雄性SD大鼠，立即在无菌操作下取出主动脉，分离血管壁中膜并剪成0.1 mm×0.3 mm小块，放于25 ml卡氏培养瓶中，置37℃的CO2孵育箱内培养。7～10天可见细胞从组织中萌出，待原代细胞生长融合达3/4培养面即传代，将6～10代细胞经Lipofectin方法转染fpGv1-MT-antisense N-ras1重组质粒及fpGv1-MT逆转录病毒空载质粒，经G418法筛选分别得到A细胞及V细胞，未转染质粒的为F细胞。将上述细胞分别接种于含20%FCS的1 640培养液的24孔培养板上(每孔接种细胞数4×104个/ml)，待细胞融合后，将培养基换成含20%胎牛血清(FCS)1 640培养液，此时，部分样品细胞计数、提取RNA及蛋白，其它样品分别加入同等剂量bFGF(10 ng/ml)，分别得到Ab细胞、Vb细胞及Fb细胞，培养24小时后部分样品用来细胞计数、提取RNA及蛋白，另一部分每孔加入37 kBq/ml的3H-TdR，5小时后，用冰D-Hanks液冲洗细胞4次，以液体闪烁计数器测定每孔的放射性。
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四、细胞总RNA的提取及其浓度纯度测定
采用一步法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度(A)值。RNA样品取5 μl稀释在995 μl水中，测260 nm、280 nm的A值，计算RNA的含量及260 nm/280 nmA值的比值。
五、Northern Blot与Western Blot
将变性的RNA样品与制备的探针进行杂交分析[4]。聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳[4]。抗体分别为1∶10稀释的p21抗体与酶联二级试剂(碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG2.0 μl)。
六、统计学处理
细胞计数、3H-TdR掺入率数据以
±s表示，运用组间t检验进行统计学分析。
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结果
一、重组质粒酶切及RNA纯度
质粒载体为fpGv1-MT，长度5.8 kb，N-ras1 cDNA片段长度为0.9 kb，E-coR Ⅰ，BglⅡ酶切，样品260 nm/280 nm A值的比值为1.9。
二、反义N-ras1基因对VSMC及bFGF诱导的VSMC的影响
应用病毒空载体的V细胞和未转染病毒的F细胞，其细胞增殖计数分别为(14.5±1.2)×104，(13.5±1.1)×104(细胞/ml)，二者差异无显著意义(P>0.05)，而应用fpGv1-MT-antisense-N-ras1的A细胞计数为(8.5±1.0)×104，显著低于两组对照细胞，与二组细胞差异均有非常显著意义(P<0.001)。经bFGF(10 ng/ml)作用后，Vb细胞、Fb细胞计数分别为(30.1±1.2)×104，(28.7±1.40)×104，两者差异无显著意义(P>0.05)；Ab细胞计数为(16.8±1.3)×104，与Vb细胞及Fb细胞相比差异均有非常显著意义(P<0.001)，表明N-ras1基因在细胞水平上抑制SMC增殖作用，使细胞对bFGF反应性明显下降。
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三、反义N-ras1基因对VSMCsDNA合成的影响
V细胞及F细胞3H-TdR掺入率分别为7 766±317(cpm)；7 873±327(cpm)，二者差异无显著意义(P>0.05)。A细胞3H-TdR掺入率为4 654±323(cpm)，与两组对照差异均有非常显著意义(P<0.001)。经bFGF(10 ng/ml，24小时)作用后，Vb细胞、Fb细胞3H-TdR掺入率分别为15 131±1 138(cpm)、14 687±1 086(cpm)，Ab细胞为7 043±672，与两组对照细胞差异均有非常显著意义(P<0.001)。由此可见，反义N-ras1基因能抑制VSMCs DNA的合成，经过bFGF诱导的细胞与未用bFGF的细胞相比，Vb细胞及Fb细胞分别提高了49%和46%，而A细胞仅提高了34%，提示A细胞对bFGF促进DNA合成作用的反应性明显降低。
四、反义N-ras1对VSMC mRNA表达的影响
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Northern blot结果显示(图1)，A细胞mRNA表达水平明显比V细胞及F细胞低，Ab细胞RasmRNA表达水平也明显低于bFGF刺激的对照细
A.转染fpGv1-MT-Antisense N-ras gene；Ab.A+bFGF；V.转染fpGv1-MT空载体；Vb.V+bFGF；F.未转染病毒载体；Fb.F+bFGF
图1 Northern印迹
胞，提示反义N-ras1抑制了VSMCs及bFGF刺激的VSMC ras mRNA表达。
五、反义N-ras1基因对ras表达产物p21蛋白的影响
Western blot显示(图2)，A细胞及Ab细胞p21蛋白表达明显降低，提示反义N-ras1基因在基础水平及bFGF诱导下对ras产物p21蛋白的产生均有抑制作用。
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图2 Western印迹(图示同图1)
讨论
血管内皮损伤性刺激后，内皮细胞、VSMC、巨噬细胞等均能释放各种生长因子，通过自分泌或旁分泌机制刺激VSMC增殖。本结果表明，bFGF是促进VSMC增殖的重要因子，其阻断bFGF对VSMCs增殖的强烈刺激作用有重要的意义。本实验中，利用反义N-ras1基因抑制bFGF刺激VSMCs的增殖。由于Ras在细胞信息传递中的承上启下的特殊地位，反义N-ras1基因转染VSMCs，直接转录出反义RNA与相应的mRNA形成双链，阻止mRNA翻译过程，也可以抑制其转录过程，其表达产物p21蛋白也受到抑制，最终细胞增殖中胞内信息总通路受到抑制[5]。实验结果显示，反义N-ras1基因对bFGF诱导下的VSMC增殖、DNA合成、ras mRNA表达及p21蛋白表达均有抑制作用，这为以VSMC增殖为特征的心血管病，如血管狭窄、介入治疗后再狭窄及高血压等发病机制及治疗提供了探索的途径。
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本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kindy MS, Sonnenshein GE. Regulation of oncongene expression in cultured aortic smooth muscle cells. J Biol Chem, 1986,261：12865-12868.
2 Naftilan AJ, Gilliland GK, Eldridge CS, et al. Induction of proto-oncogene cjun by angiotensin Ⅱ. Mol Cell Biol, 1990,10：5536-5540.
3 Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular switch in signal transduction. J Biol Chem, 1992,267：24 149-24153.
, 百拇医药
4 Sambrook J, Fristch EF, Maniatist SJ, et al. Molecular cloning ed2. New York: Cold Spring harbor, 1992.737-1028.
5 Polakis P, Mccormick F. Structural requirements for the interaction of p21ras with GAP, exchange factors, and Its biological effect target. J Biol Chem, 1993,268：9157-9160.
(收稿：1997-03-19 修回：1997-11-20), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院心内科[周玉杰现在中日友好医院心内科工作(北京，邮政编码100029)]
关键词：平滑肌；细胞；基因治疗；成纤维细胞生长因子
中华医学杂志980321 【摘要】 目的 应用反义N-ras1基因阻断成纤维细胞生长因子(bFGF)的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞(VSMC)增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法 利用构建的含反义N-ras1基因的逆转录病毒质粒(fpGv1-MT-Antisense N-ras1)转染于培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)，fpGv1-MT逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对bFGF诱导的VSMC的影响。 结果 反义N-ras1细胞数为(16.8±1.3)×104(细胞/ml)，空载质粒对照细胞为(30.1±1.2)×104，两者差异有显著意义(P<0.001)；反义N-ras1细胞3H-TdR掺入率为7 643±672(cpm)，空载质粒对照细胞为15 131±138(cpm)，两者差异有非常显著意义(P<0.001)，同时应用反义N-ras1基因的细胞Ras mRNA表达水平明显降低，其表达蛋白p21也明显降低。 结论 反义N-ras1基因对VSMC及bFGF诱导VSMC增殖有抑制作用。
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Antisense N-ras1 gene inhibits the proliferation of VSMC induced by bFGF after arterial injury Zhou Yujie, Wang Lihui, Zhou Airu, et al. Department of Cardiology, First hospital, Beijing Medical University, Beijing 100029.
【Abstract】 Objective To develop a new way to prevent the process of restenosis after arterial injury, we transfer the recombinant antisense N-ras1 gene to the cultured SMCs and studied the influence of gene therapy with antisense N-ras1 on the SMCs proliferation induced by bFGF.Methods With the recombinant antisense N-ras1 plasmids (fpGv1-MT-N-ras1) transfered to the cultured SMC, we studied the effect on the SMCs proliferation induced by bFGF.Results The results of the experiment indicated that the count of cells transfered antisense N-ras1 was 16.8±1.3×104, the control cells transfered fpGv1-MT retrovirus vector were 30.1±1.2×104 (cell/ml) (P<0.001). cell [3H] thymedine incorporation was 7 643±672 cpm in gene therapy cells, and 15 131±138 cpm in vector control cells (P<0.001). Gene therapy cells ras mRNA and p21 were significantly decreased by Northern blotting and Western blotting technique.Conclusion These results suggest that antisense N-ras1 gene may inhibit the proliferation of cultured VSMC induced by bFGF.
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【Key words】 Smooth muscle Cell gene therapy fibroblast growth factor
(Natl Med J China, 1998, 78：227-229)
血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖是血管介入治疗后再狭窄及高血压等心血管疾病的主要病理特征。现已证实上述心血管病VSMC增殖的重要因素是某些癌基因表达异常[1、2]。ras基因在细胞信息传递过程中起着重要的作用，是参与细胞增殖的重要基因[3]。成纤维细胞生长因子(bFGF)是强烈的细胞裂变原，能够刺激多种细胞的增殖。本实验利用反义N-ras1基因研究对其bFGF诱导下VSMCs增殖的影响。
材料和方法
一、材料
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N-ras1逆转录病毒重组质粒(fpGv1-MT-N-ras1)及逆转录病毒载体由北京医科大学心血管研究所提供，DNA限制性内切酶、bFGF购自美国Promega公司。
二、探针的制备[4]
扩增提取质粒，进行酶切鉴定。酚冻融法回收探针。采用随机引物法标记探针，探针经过Sephdex G50柱层板，分离标记的探针和游离核苷酸及同位素，收集洗脱液的第一峰，用液闪测定放射计数，计算掺入率和放射性比活。本实验掺入率都在60%以上，探针比活在2×108～3.3×109 cpm/μg DNA之间。
三、组织提取物的制备
断头处死雄性SD大鼠，立即在无菌操作下取出主动脉，分离血管壁中膜并剪成0.1 mm×0.3 mm小块，放于25 ml卡氏培养瓶中，置37℃的CO2孵育箱内培养。7～10天可见细胞从组织中萌出，待原代细胞生长融合达3/4培养面即传代，将6～10代细胞经Lipofectin方法转染fpGv1-MT-antisense N-ras1重组质粒及fpGv1-MT逆转录病毒空载质粒，经G418法筛选分别得到A细胞及V细胞，未转染质粒的为F细胞。将上述细胞分别接种于含20%FCS的1 640培养液的24孔培养板上(每孔接种细胞数4×104个/ml)，待细胞融合后，将培养基换成含20%胎牛血清(FCS)1 640培养液，此时，部分样品细胞计数、提取RNA及蛋白，其它样品分别加入同等剂量bFGF(10 ng/ml)，分别得到Ab细胞、Vb细胞及Fb细胞，培养24小时后部分样品用来细胞计数、提取RNA及蛋白，另一部分每孔加入37 kBq/ml的3H-TdR，5小时后，用冰D-Hanks液冲洗细胞4次，以液体闪烁计数器测定每孔的放射性。
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四、细胞总RNA的提取及其浓度纯度测定
采用一步法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm吸光度(A)值。RNA样品取5 μl稀释在995 μl水中，测260 nm、280 nm的A值，计算RNA的含量及260 nm/280 nmA值的比值。
五、Northern Blot与Western Blot
将变性的RNA样品与制备的探针进行杂交分析[4]。聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳[4]。抗体分别为1∶10稀释的p21抗体与酶联二级试剂(碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG2.0 μl)。
六、统计学处理
细胞计数、3H-TdR掺入率数据以
±s表示，运用组间t检验进行统计学分析。, http://www.100md.com
结果
一、重组质粒酶切及RNA纯度
质粒载体为fpGv1-MT，长度5.8 kb，N-ras1 cDNA片段长度为0.9 kb，E-coR Ⅰ，BglⅡ酶切，样品260 nm/280 nm A值的比值为1.9。
二、反义N-ras1基因对VSMC及bFGF诱导的VSMC的影响
应用病毒空载体的V细胞和未转染病毒的F细胞，其细胞增殖计数分别为(14.5±1.2)×104，(13.5±1.1)×104(细胞/ml)，二者差异无显著意义(P>0.05)，而应用fpGv1-MT-antisense-N-ras1的A细胞计数为(8.5±1.0)×104，显著低于两组对照细胞，与二组细胞差异均有非常显著意义(P<0.001)。经bFGF(10 ng/ml)作用后，Vb细胞、Fb细胞计数分别为(30.1±1.2)×104，(28.7±1.40)×104，两者差异无显著意义(P>0.05)；Ab细胞计数为(16.8±1.3)×104，与Vb细胞及Fb细胞相比差异均有非常显著意义(P<0.001)，表明N-ras1基因在细胞水平上抑制SMC增殖作用，使细胞对bFGF反应性明显下降。
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三、反义N-ras1基因对VSMCsDNA合成的影响
V细胞及F细胞3H-TdR掺入率分别为7 766±317(cpm)；7 873±327(cpm)，二者差异无显著意义(P>0.05)。A细胞3H-TdR掺入率为4 654±323(cpm)，与两组对照差异均有非常显著意义(P<0.001)。经bFGF(10 ng/ml，24小时)作用后，Vb细胞、Fb细胞3H-TdR掺入率分别为15 131±1 138(cpm)、14 687±1 086(cpm)，Ab细胞为7 043±672，与两组对照细胞差异均有非常显著意义(P<0.001)。由此可见，反义N-ras1基因能抑制VSMCs DNA的合成，经过bFGF诱导的细胞与未用bFGF的细胞相比，Vb细胞及Fb细胞分别提高了49%和46%，而A细胞仅提高了34%，提示A细胞对bFGF促进DNA合成作用的反应性明显降低。
四、反义N-ras1对VSMC mRNA表达的影响
, 百拇医药
Northern blot结果显示(图1)，A细胞mRNA表达水平明显比V细胞及F细胞低，Ab细胞RasmRNA表达水平也明显低于bFGF刺激的对照细
A.转染fpGv1-MT-Antisense N-ras gene；Ab.A+bFGF；V.转染fpGv1-MT空载体；Vb.V+bFGF；F.未转染病毒载体；Fb.F+bFGF
图1 Northern印迹
胞，提示反义N-ras1抑制了VSMCs及bFGF刺激的VSMC ras mRNA表达。
五、反义N-ras1基因对ras表达产物p21蛋白的影响
Western blot显示(图2)，A细胞及Ab细胞p21蛋白表达明显降低，提示反义N-ras1基因在基础水平及bFGF诱导下对ras产物p21蛋白的产生均有抑制作用。
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图2 Western印迹(图示同图1)
讨论
血管内皮损伤性刺激后，内皮细胞、VSMC、巨噬细胞等均能释放各种生长因子，通过自分泌或旁分泌机制刺激VSMC增殖。本结果表明，bFGF是促进VSMC增殖的重要因子，其阻断bFGF对VSMCs增殖的强烈刺激作用有重要的意义。本实验中，利用反义N-ras1基因抑制bFGF刺激VSMCs的增殖。由于Ras在细胞信息传递中的承上启下的特殊地位，反义N-ras1基因转染VSMCs，直接转录出反义RNA与相应的mRNA形成双链，阻止mRNA翻译过程，也可以抑制其转录过程，其表达产物p21蛋白也受到抑制，最终细胞增殖中胞内信息总通路受到抑制[5]。实验结果显示，反义N-ras1基因对bFGF诱导下的VSMC增殖、DNA合成、ras mRNA表达及p21蛋白表达均有抑制作用，这为以VSMC增殖为特征的心血管病，如血管狭窄、介入治疗后再狭窄及高血压等发病机制及治疗提供了探索的途径。
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本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Kindy MS, Sonnenshein GE. Regulation of oncongene expression in cultured aortic smooth muscle cells. J Biol Chem, 1986,261：12865-12868.
2 Naftilan AJ, Gilliland GK, Eldridge CS, et al. Induction of proto-oncogene cjun by angiotensin Ⅱ. Mol Cell Biol, 1990,10：5536-5540.
3 Satoch T, Nakafuku M, Kaziro Y. Function of ras as a molecular switch in signal transduction. J Biol Chem, 1992,267：24 149-24153.
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4 Sambrook J, Fristch EF, Maniatist SJ, et al. Molecular cloning ed2. New York: Cold Spring harbor, 1992.737-1028.
5 Polakis P, Mccormick F. Structural requirements for the interaction of p21ras with GAP, exchange factors, and Its biological effect target. J Biol Chem, 1993,268：9157-9160.
(收稿：1997-03-19 修回：1997-11-20), http://www.100md.com