大鼠液压脑损伤后BDNF mRNA原位杂交组织化学表达的变化
作者：董吉荣 朱诚 江基尧 卢亦成 张光霁 刘志敏
单位：董吉荣 朱诚 江基尧 卢亦成 张光霁 刘志敏 200003 上海,第二军医大学附属长征医院神经外科、上海市神经外科研究所
关键词：脑源性神经营养因子；颅脑损伤；原位杂交
中华创伤杂志980308 【摘要】 目的 研究大鼠液压脑损伤后脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA原位杂交组织化学表达的变化规律。方法 采用核酸原位杂交免疫组织化学技术(ISHH)检测大鼠轻、中度脑损伤大脑皮层和海马BDNF mRNA表达的动态变化。结果 伤后皮层局灶周围、海马BDNF mRNA表达皆有增加,分别于伤后2、4小时达高峰,海马中以CA2区增加最明显,中度损伤时表达增加的幅度比轻度损伤时大。结论 脑损伤后脑皮层和海马BDNF mRNA表达增加,提示机体对颅脑损伤存在自身保护机制。
, 百拇医药
Dynamic Changes of Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor mRNA After Fluid Percussion Brain Injury in Rats DONG Ji-rong, ZHU Cheng, JIANG Ji-yao, et al. Dept. of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Aim To study mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) after fluid percussion brain injury in rats. Methods Nucleic acid in situ hybridization histochemistry technique with an RNA probe and the computer image analysis were employed to detect the dynamic changes of BDNF mRNA in the cortex and the hippocampus after mild to medium brain injury. Results BDNF mRNA expression increased around the injured foci and the ipsilateral hippocampi, and reached peak at 2 or 4 hours after injury. More expression was observed at 1.5 atm pressure than that at 0.8 atm. Conclusion The increase of BDNF mRNA expression in the cortex and the hippocampus after brain injury shows that there exists a self-protective mechanism for body against injury.
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【Key words】 Brain-derived neurotrophic factor Brain injury In situ hybridization
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经生长因子家族成员,离体及在体实验均证明BDNF能促进胆碱能、多巴胺能及运动性神经元存活、分化和轴突再生。癫痫、低血糖、缺血、增强或减弱神经元活动的药物及创伤性损害,都能导致BDNF基因表达的显著变化,这些变化可能有利于避免脑损伤引起的神经元死亡,对脑组织起一定的保护作用[1～5]。但闭合性脑损伤BDNF mRNA的研究却很少。本研究通过已建立完善的闭合性大鼠液压脑损伤模型,利用核酸原位杂交组织化学技术,探讨大鼠单侧液压脑损伤后崐脑区BDNF mRNA原位表达的变化。
材料与方法
一、探针制备
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1.可体外转录的目的基因质粒的构建:构建含370bp BDNF cDNA片段的可体外转录的质粒pBluescript SK+,此片段比NGF家族其它成员的cDNA同源性差,具有较高的特异性。
2.模板线性化:为了给体外RNA合成提供一个终端,减少或去除与待测mRNA不互补结合碱基的量,提高核酸探针的纯度,在重组质粒目的基因的下游,将环状质粒用内切酶EcoRⅠ将DNA环切开。用HindⅢ酶切后的正义链作为阴性对照探针的模板。
3.地高辛cRNA探针的制备:EcoRⅠ酶切质粒加入包括Dig-16-UTP的NTP、T7RNA聚合酶42℃2小时合成cRNA探针,T3RNA聚合酶则合成阴性对照探针[6～9]。
二、大鼠液压脑损伤
1.实验分组:雄性SD大鼠75只,体重250～320g。假手术组5只,轻度(打击强度0.8atm)和中度(打击强度1.5atm)脑损伤组各35只。各分为伤后0.5、1、2、4、12、24、48小时7组。
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2.液压损伤装置(由美国弗吉利亚大学医学院研制):主要由圆型液柱、打击架、压力传感器和示波器组成。打击锤产生的压力经活塞、圆型液柱传至颅脑,作用于脑组织和血管。压力的大小由打击锤的高度调节,并通过压力传感器在示波器上显示。
3.手术操作:2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(30mg/kg)。动物头部固定于立体定向仪上。消毒后,纵向切开头皮至颅骨,剥离左侧颞肌,于矢状缝左旁4mm,冠状缝合2mm处钻孔,放置外伤打击管,用自凝牙托粉固定,缝合头皮。硬膜破损者弃之不用。整个过程用电热毯维持正常体温。次日,大鼠乙醚麻醉,出现夹足反射后行0.8、1.5atm强度打击造成轻度或中度颅脑损伤。有呼吸抑制时用呼吸机维持呼吸。假手术组不致伤[10，11]。
三、取材、切片和杂交
1.取材和切片:所有动物均在上午取材。Zamboni氏固定液250ml灌注固定。无菌条件下冠状取出损伤部脑片厚约5mm,连续冠状冰冻切片,厚50μm。
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2.切片的预处理:对经PBS漂洗后的漂浮切片依次加入甘氨酸、Triton、蛋白酶K及乙酸酐等液体以减少游离醛基、增加探针渗透力、暴露待测mRNA,并降低非特异性反应。
3.杂交、杂交后冲洗及显色:将切片用灭菌滤纸吸干,放入杂交液中,42℃保温24小时。杂交液盛于1.5ml离心管中,1次盛杂交液0.5ml、大脑切片20张,杂交液中地高辛核酸探针含量0.5μg/ml。依次用4×SSC、2×SSC(含RNaseA)、1×SSC、0.5×SSC漂洗后,加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片断,1∶1000稀释,室温4小时,再以PBS、TSM冲洗。NBT、BCIP显色后,将切片贴于涂有铬明矾明胶的载片上,暗处晾干,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片[7～9]。
结 果
一、正常大鼠脑BDNF mRNA的分布
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假手术组显色结果,手术侧与健侧无差异。皮层、海马、隔核、杏仁核等区皆有分布。皮层染色最浅,海马齿状核最深。胞质核周染色,核及胞膜呈阴性。正义链对照组染色皆为阴性。
二、脑损伤后BDNF mRNA的变化
脑损伤后,伤侧皮层局灶周围、伤侧海马BDNF mRNA表达都有增加,以前者和海马中CA2区增加最为明显,而CA1区增加幅度最小。
伤侧损伤局灶皮层BDNF mRNA染色以伤后2小时达到最高峰,48小时开始下降;伤侧海马CA2区则在4小时达高峰,DG、CA3、CA4则在6小时左右表达最高,在伤后24小时开始下降。
1.5atm强度损伤时,损伤局灶周围、海马CA2区和DG区的染色强度较0.8atm致伤时染色强度深。损伤局部周围坏死组织无BDNF mRNA表达。
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讨 论
本实验选择单链反义RNA为探针。这种探针与缺口平移标记的DNA探针相比特异性高,RNA/RNA形成的杂交分子热稳定性好;探针的大小比较恒定,增加了杂交的敏感性和均一性;反义RNA探针不含载体序列,减少了非特异性杂交;因是单链探针,无需变性,也不会发生重退火的情况,杂交中全部与靶核酸连接。本实验将标记的正义链作为对照,证明正义RNA是一种良好的阴性对照选择。地高辛作为探针的标记,分辨率高,反应时间短,探针特异性好,无放射性污染。
本实验发现在正常大鼠脑内BDNF mRNA分布规律,正好同由隔区胆碱能神经元投射来的神经末梢在海马中的分布情况相一致,推测BDNF可能直接影响海马内胆碱能递质的传递。考虑到海马在动物学习记忆功能中的重要性以及BDNF在海马中表达量最高的事实,推测BDNF除起神经营养作用外,还同涉及学习和记忆过程的长时程效应及突触可塑性有关。BDNF mRNA在皮层中的广泛分布,提示了BDNF对皮层神经元的营养作用。
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1989年Isackson首次证明癫痫发作可导致大鼠皮层和海马BDNF mRNA表达增高,随后又发现低血糖、缺血、介入性脑创伤亦可导致神经营养因子(neurotrophic factor, NTF)基因和受体表达的变化,但闭合性脑创伤对NTF表达影响的研究未见报道。本课题采用大鼠液压脑损伤模型,造成单侧闭合性脑损伤,研究脑伤后BDNF mRNA的变化,对探讨脑损伤的自身保护机制及完善脑损伤的治疗有一定的意义[12]。
本实验发现大鼠液压脑损伤后损伤皮层和海马CA2区BDNF mRNA表达明显增加,与其直接受力有关。而脑缺血只对CA1区神经元起调节作用。脑损伤对BDNF mRNA表达的调节只在特定的细胞群产生,说明各个脑区神经元调节BDNF mRNA表达的潜力不同。同等程度损伤后,各脑区BDNF mRNA表达达到最大量的时间亦不同。液压伤后损伤周围皮层神经元只需2小时,说明其受损伤影响调节BDNF mRNA表达的灵敏度较高,也可能与受伤的程度有关。中度损伤时,皮层损伤灶局部无BDNF mRNA表达,表明坏死神经元已失去表达的能力。Lindvall等发现离体皮层神经元KCL去极化导致BDNF mRNA的表达增加可阻止细胞死亡,且第一次脑损伤后所致的BDNF合成增加可阻止第二次损伤所致的细胞死亡。这些证明脑损伤后BDNF mRNA的表达增加是神经元对脑损伤的自身保护[12]。
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脑损伤调节BDNF mRNA表达的机制仍不清楚。现在认为脑损伤引起谷氨酸释放、神经元去极化及Ca2+内流等因素均诱导BDNF基因的表达,其中NMDA和非NMDA型氨基酸受体参与了此过程[5，12]。
参考文献
[1]Ebendal T. Function and evolution in the NGF family and its receptors. J Neurosci Res, 1992, 32∶461-470.
[2]Davies AM. The role of neurotrophins in the developing nerves system. J Neurobiology, 1994, 25∶1334-1347.
[3]Rosenthal A, Goeddel DV, Nguyen T, et al. Primary structure and biological activity of human-derived neurotrophic factor. Endocrinology, 1991, 129∶1289-1294.
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[4]Sinson G, Perri BR, McItosh TK, et al. Improvement of cognitive deficits and decreased cholingergic neuronal cell loss and apoptosic cell death following neurotrophin infusion after experimental traumatic brain injury. J Neurosurg, 1997, 86∶511-516.
[5]Mocchetti I, Wrathal JR. Neurotrophic factors in central nerves system trauma. J Neurotrauma, 1995, 12∶853-870.
[6]Wetmore C, Emfors P, Persson H, et al. Localization of brain-derived neurotrophic factors mRNA to neurons in the brain by in situ hybridization. Exp Neuro, 1990, 109∶141-152.
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[7]苏慧慈.原位杂交. 北京:中国科学技术出版社, 1994, 190-206.
[8]卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社, 1993, 225-228.
[9]倪灿荣.免疫组组织化学实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社,1993, 254-260.
[10]刘信龙,江基尧.国外液压颅脑伤模型的研究现状.国外医学.神经病学神经外科学分册,1994, 2∶78-80.
[11]刘信龙,江基尧,杨中坚,等.大鼠液压颅脑伤后血糖、脑脊液乳酸及局部脑血流的变化.中华实验外科杂志, 1994, 11∶353-354.
[12]Lindvall O, Kokain Z, Bengzon J, et al. Neurotrophins and brain insults. TINS, 1994, 17∶490-496.
(收稿:1997-04-08 修回:1998-02-25), 百拇医药
单位：董吉荣 朱诚 江基尧 卢亦成 张光霁 刘志敏 200003 上海,第二军医大学附属长征医院神经外科、上海市神经外科研究所
关键词：脑源性神经营养因子；颅脑损伤；原位杂交
中华创伤杂志980308 【摘要】 目的 研究大鼠液压脑损伤后脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA原位杂交组织化学表达的变化规律。方法 采用核酸原位杂交免疫组织化学技术(ISHH)检测大鼠轻、中度脑损伤大脑皮层和海马BDNF mRNA表达的动态变化。结果 伤后皮层局灶周围、海马BDNF mRNA表达皆有增加,分别于伤后2、4小时达高峰,海马中以CA2区增加最明显,中度损伤时表达增加的幅度比轻度损伤时大。结论 脑损伤后脑皮层和海马BDNF mRNA表达增加,提示机体对颅脑损伤存在自身保护机制。
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Dynamic Changes of Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor mRNA After Fluid Percussion Brain Injury in Rats DONG Ji-rong, ZHU Cheng, JIANG Ji-yao, et al. Dept. of Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003
【Abstract】 Aim To study mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) after fluid percussion brain injury in rats. Methods Nucleic acid in situ hybridization histochemistry technique with an RNA probe and the computer image analysis were employed to detect the dynamic changes of BDNF mRNA in the cortex and the hippocampus after mild to medium brain injury. Results BDNF mRNA expression increased around the injured foci and the ipsilateral hippocampi, and reached peak at 2 or 4 hours after injury. More expression was observed at 1.5 atm pressure than that at 0.8 atm. Conclusion The increase of BDNF mRNA expression in the cortex and the hippocampus after brain injury shows that there exists a self-protective mechanism for body against injury.
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【Key words】 Brain-derived neurotrophic factor Brain injury In situ hybridization
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经生长因子家族成员,离体及在体实验均证明BDNF能促进胆碱能、多巴胺能及运动性神经元存活、分化和轴突再生。癫痫、低血糖、缺血、增强或减弱神经元活动的药物及创伤性损害,都能导致BDNF基因表达的显著变化,这些变化可能有利于避免脑损伤引起的神经元死亡,对脑组织起一定的保护作用[1～5]。但闭合性脑损伤BDNF mRNA的研究却很少。本研究通过已建立完善的闭合性大鼠液压脑损伤模型,利用核酸原位杂交组织化学技术,探讨大鼠单侧液压脑损伤后崐脑区BDNF mRNA原位表达的变化。
材料与方法
一、探针制备
, 百拇医药
1.可体外转录的目的基因质粒的构建:构建含370bp BDNF cDNA片段的可体外转录的质粒pBluescript SK+,此片段比NGF家族其它成员的cDNA同源性差,具有较高的特异性。
2.模板线性化:为了给体外RNA合成提供一个终端,减少或去除与待测mRNA不互补结合碱基的量,提高核酸探针的纯度,在重组质粒目的基因的下游,将环状质粒用内切酶EcoRⅠ将DNA环切开。用HindⅢ酶切后的正义链作为阴性对照探针的模板。
3.地高辛cRNA探针的制备:EcoRⅠ酶切质粒加入包括Dig-16-UTP的NTP、T7RNA聚合酶42℃2小时合成cRNA探针,T3RNA聚合酶则合成阴性对照探针[6～9]。
二、大鼠液压脑损伤
1.实验分组:雄性SD大鼠75只,体重250～320g。假手术组5只,轻度(打击强度0.8atm)和中度(打击强度1.5atm)脑损伤组各35只。各分为伤后0.5、1、2、4、12、24、48小时7组。
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2.液压损伤装置(由美国弗吉利亚大学医学院研制):主要由圆型液柱、打击架、压力传感器和示波器组成。打击锤产生的压力经活塞、圆型液柱传至颅脑,作用于脑组织和血管。压力的大小由打击锤的高度调节,并通过压力传感器在示波器上显示。
3.手术操作:2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(30mg/kg)。动物头部固定于立体定向仪上。消毒后,纵向切开头皮至颅骨,剥离左侧颞肌,于矢状缝左旁4mm,冠状缝合2mm处钻孔,放置外伤打击管,用自凝牙托粉固定,缝合头皮。硬膜破损者弃之不用。整个过程用电热毯维持正常体温。次日,大鼠乙醚麻醉,出现夹足反射后行0.8、1.5atm强度打击造成轻度或中度颅脑损伤。有呼吸抑制时用呼吸机维持呼吸。假手术组不致伤[10，11]。
三、取材、切片和杂交
1.取材和切片:所有动物均在上午取材。Zamboni氏固定液250ml灌注固定。无菌条件下冠状取出损伤部脑片厚约5mm,连续冠状冰冻切片,厚50μm。
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2.切片的预处理:对经PBS漂洗后的漂浮切片依次加入甘氨酸、Triton、蛋白酶K及乙酸酐等液体以减少游离醛基、增加探针渗透力、暴露待测mRNA,并降低非特异性反应。
3.杂交、杂交后冲洗及显色:将切片用灭菌滤纸吸干,放入杂交液中,42℃保温24小时。杂交液盛于1.5ml离心管中,1次盛杂交液0.5ml、大脑切片20张,杂交液中地高辛核酸探针含量0.5μg/ml。依次用4×SSC、2×SSC(含RNaseA)、1×SSC、0.5×SSC漂洗后,加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片断,1∶1000稀释,室温4小时,再以PBS、TSM冲洗。NBT、BCIP显色后,将切片贴于涂有铬明矾明胶的载片上,暗处晾干,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片[7～9]。
结 果
一、正常大鼠脑BDNF mRNA的分布
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假手术组显色结果,手术侧与健侧无差异。皮层、海马、隔核、杏仁核等区皆有分布。皮层染色最浅,海马齿状核最深。胞质核周染色,核及胞膜呈阴性。正义链对照组染色皆为阴性。
二、脑损伤后BDNF mRNA的变化
脑损伤后,伤侧皮层局灶周围、伤侧海马BDNF mRNA表达都有增加,以前者和海马中CA2区增加最为明显,而CA1区增加幅度最小。
伤侧损伤局灶皮层BDNF mRNA染色以伤后2小时达到最高峰,48小时开始下降;伤侧海马CA2区则在4小时达高峰,DG、CA3、CA4则在6小时左右表达最高,在伤后24小时开始下降。
1.5atm强度损伤时,损伤局灶周围、海马CA2区和DG区的染色强度较0.8atm致伤时染色强度深。损伤局部周围坏死组织无BDNF mRNA表达。
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讨 论
本实验选择单链反义RNA为探针。这种探针与缺口平移标记的DNA探针相比特异性高,RNA/RNA形成的杂交分子热稳定性好;探针的大小比较恒定,增加了杂交的敏感性和均一性;反义RNA探针不含载体序列,减少了非特异性杂交;因是单链探针,无需变性,也不会发生重退火的情况,杂交中全部与靶核酸连接。本实验将标记的正义链作为对照,证明正义RNA是一种良好的阴性对照选择。地高辛作为探针的标记,分辨率高,反应时间短,探针特异性好,无放射性污染。
本实验发现在正常大鼠脑内BDNF mRNA分布规律,正好同由隔区胆碱能神经元投射来的神经末梢在海马中的分布情况相一致,推测BDNF可能直接影响海马内胆碱能递质的传递。考虑到海马在动物学习记忆功能中的重要性以及BDNF在海马中表达量最高的事实,推测BDNF除起神经营养作用外,还同涉及学习和记忆过程的长时程效应及突触可塑性有关。BDNF mRNA在皮层中的广泛分布,提示了BDNF对皮层神经元的营养作用。
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1989年Isackson首次证明癫痫发作可导致大鼠皮层和海马BDNF mRNA表达增高,随后又发现低血糖、缺血、介入性脑创伤亦可导致神经营养因子(neurotrophic factor, NTF)基因和受体表达的变化,但闭合性脑创伤对NTF表达影响的研究未见报道。本课题采用大鼠液压脑损伤模型,造成单侧闭合性脑损伤,研究脑伤后BDNF mRNA的变化,对探讨脑损伤的自身保护机制及完善脑损伤的治疗有一定的意义[12]。
本实验发现大鼠液压脑损伤后损伤皮层和海马CA2区BDNF mRNA表达明显增加,与其直接受力有关。而脑缺血只对CA1区神经元起调节作用。脑损伤对BDNF mRNA表达的调节只在特定的细胞群产生,说明各个脑区神经元调节BDNF mRNA表达的潜力不同。同等程度损伤后,各脑区BDNF mRNA表达达到最大量的时间亦不同。液压伤后损伤周围皮层神经元只需2小时,说明其受损伤影响调节BDNF mRNA表达的灵敏度较高,也可能与受伤的程度有关。中度损伤时,皮层损伤灶局部无BDNF mRNA表达,表明坏死神经元已失去表达的能力。Lindvall等发现离体皮层神经元KCL去极化导致BDNF mRNA的表达增加可阻止细胞死亡,且第一次脑损伤后所致的BDNF合成增加可阻止第二次损伤所致的细胞死亡。这些证明脑损伤后BDNF mRNA的表达增加是神经元对脑损伤的自身保护[12]。
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脑损伤调节BDNF mRNA表达的机制仍不清楚。现在认为脑损伤引起谷氨酸释放、神经元去极化及Ca2+内流等因素均诱导BDNF基因的表达,其中NMDA和非NMDA型氨基酸受体参与了此过程[5，12]。
参考文献
[1]Ebendal T. Function and evolution in the NGF family and its receptors. J Neurosci Res, 1992, 32∶461-470.
[2]Davies AM. The role of neurotrophins in the developing nerves system. J Neurobiology, 1994, 25∶1334-1347.
[3]Rosenthal A, Goeddel DV, Nguyen T, et al. Primary structure and biological activity of human-derived neurotrophic factor. Endocrinology, 1991, 129∶1289-1294.
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[4]Sinson G, Perri BR, McItosh TK, et al. Improvement of cognitive deficits and decreased cholingergic neuronal cell loss and apoptosic cell death following neurotrophin infusion after experimental traumatic brain injury. J Neurosurg, 1997, 86∶511-516.
[5]Mocchetti I, Wrathal JR. Neurotrophic factors in central nerves system trauma. J Neurotrauma, 1995, 12∶853-870.
[6]Wetmore C, Emfors P, Persson H, et al. Localization of brain-derived neurotrophic factors mRNA to neurons in the brain by in situ hybridization. Exp Neuro, 1990, 109∶141-152.
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[7]苏慧慈.原位杂交. 北京:中国科学技术出版社, 1994, 190-206.
[8]卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社, 1993, 225-228.
[9]倪灿荣.免疫组组织化学实验新技术及应用.北京:北京科学技术出版社,1993, 254-260.
[10]刘信龙,江基尧.国外液压颅脑伤模型的研究现状.国外医学.神经病学神经外科学分册,1994, 2∶78-80.
[11]刘信龙,江基尧,杨中坚,等.大鼠液压颅脑伤后血糖、脑脊液乳酸及局部脑血流的变化.中华实验外科杂志, 1994, 11∶353-354.
[12]Lindvall O, Kokain Z, Bengzon J, et al. Neurotrophins and brain insults. TINS, 1994, 17∶490-496.
(收稿:1997-04-08 修回:1998-02-25), 百拇医药