黄芪和干扰素合剂抗单纯疱疹病毒的作用
作者：张丽兰 刘永清 喻志爱 张利萍 张淀 侯斌 汪芳迅 侯云德
单位：100052 北京 病毒基因工程国家重点实验室，中国预防医学科学院生物技术新药研究中心
关键词：黄芪；干扰素；单纯疱疹病毒
中华实验和临床病毒学杂志980324 【摘要】 目的 研究中药黄芪乙醇提取物与重组人α2b型干扰素组成栓剂或软膏的抗单纯疱疹病毒作用。方法 采用2BS细胞，在96孔板上进行栓剂或软膏水溶物对I型单纯疱疹病毒的抑制作用试验；干扰素的效价测定采用WISH/VSV法。结果 黄芪与干扰素联合应用在2BS细胞培养上抑制单纯疱疹病毒的繁殖有明显的协同作用；组成复方干扰素软膏、栓剂的辅形成分对干扰素的测定系统无明显影响。结论 本结果与前文报道的黄芪与干扰素联合应用对抑制14、39型鼻病毒有协同作用的结果是一致的。
Study on the anti-herpes simplex virus activity of a suppository or ointment form of Astragalus membranaceus combined with interferon alpha 2b in human diploid cell culture Zhang Lilan,LiuYongqing,Yu Zhiai et al.Biotech Center for New Pharmaceutical Development,Chinese Academy of Preventive Medicine.State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering,Beijing 100052
, http://www.100md.com
Abstract A study on the anti-herpes simplex virus activity of the suppository or ointment form of Astragalus membranaceus(AM)combined with recombinant human interferon alpha 2b(IFN)was carried out in human diploid cell culture.AM is a Chinese herb medicine and have been used in China as a tonic for thousands of years and the IFN was produced from E.coli with 95%purity.Obtained results indicated that the placebo suppository and ointment(without AM and IFN)seemed not to decrease markedly the anti-viral activity of IFN in WISH/VSV assay system.The anti-herpes simplex virus activities of suppository and ointment forms of AM and IFN were shown to be significantly higher than that of IFN alone.It is well known that chronic cervicitis is closely related to papillomavirus,cytomegalovirus as well as herpes virus infections.The AM-IFN suppository is suggested to be used in the treatment of cervicitis and the ointment in the treatment of skin herpes.
, 百拇医药
Key words: Huang Qi Interferon Herpes simplex virus
前文报道，采用纱布浸湿干扰素水剂在宫颈局部贴敷，治疗慢性宫颈炎有明显疗效〔1〕，体外和动物试验证明中药黄芪与干扰素具有协同作用〔2，3〕，黄芪与干扰素联合应用治疗慢性宫颈炎有明显的增效作用，减半量的干扰素与黄芪联合应用的疗效与加倍量的干扰效果相当〔4〕。鉴于水剂剂型治疗慢性宫颈炎或口角疱疹使用不便，我们将重组人α2b型干扰素与黄芪乙醇提取液合理组方，研制成栓剂和软膏，在人二倍体细胞上研究了抗单纯疱疹病毒感染的活性。
1 材料和方法
1.1 病毒株 单纯疱疹病毒I型由中国预防医学科学院病毒学研究所全国医学病毒毒种中心提供，在人二倍体细胞2BS上传代，TCID50/ml为106。滤泡性口腔炎病毒(VSV)由病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室提供，在原代鸡胚细胞中传代。
, 百拇医药
1.2 细胞株 2BS细胞系，27代，由北京生物制品研究所提供。细胞培养液为Eagle's液，内含10%初生牛血清，0.03%谷氨酰胺；青霉素100U/ml；链霉素100μg/ml；pH 7.0～7.4。
1.3 黄芪针剂(AM) 深度为2g/ml，购自上海福达制药有限公司。
1.4 干扰素(IFN)及其效价滴定 重组人α2b型干扰素由北京远策药业有限公司生产，从大肠杆菌中提取并纯化，纯度>95%。干扰素效价测定采用WISH细胞/VSV病变抑制法；结果用卫生部药品和生物制品检定所提供的干扰素标准品进行校正。栓剂和软膏均在完全溶于水后进行干扰素测定。
1.5 黄芪-干扰素软膏处方 每100g软膏含黄芪10g，人α2b型干扰素2000万单位，三氯叔丁醇1.5g，卡波末2.0g；软膏呈凝状，细腻，pH6.0。黄芪-干扰素栓剂处方：每100g栓剂含黄芪10g，人α2b型干扰素2000万单位，淀粉30g，乳糖10g，CMS-Na 2g，硬脂酸镁0.5g；栓剂每片重0.4g，37℃水浴中崩解时间小于60秒；硬度大于4kg。
, 百拇医药
1.6 干扰素抗单纯疱疹病毒的效果测定 基本上与测定干扰素效价相同，主要点是：采用2BS人二倍体细胞，96孔板，每孔接种细胞104个左右，培养液为Eagle's液，内含10%初生牛血清，0.03%谷氨酰胺，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，37℃，5%CO2恒温箱培养，约2～3天后形成单层，吸去培养液，再用Hank's液洗涤1次，以去除牛血清，将事先溶解的栓剂和涂剂4倍稀释，每稀释度接种2孔，在37℃5%CO2恒温箱过夜培养，次日进行100～1000TCID50/ml单纯疱疹病毒攻击。细胞培养维持液为含2%初生牛血清的Eagle's液，实验组的培养液中还加有1%的黄芪。病毒攻击后继续在37℃ 5% CO2恒温箱中继续培养，待病毒对照管出现完全病变后，结晶紫染色，采用540nm波长滤光片阅读吸光度A值，滴度以国际单位表示。实验中设置对照组，即空白栓剂和空白软膏也先溶于水后与定量的干扰素混合进行干扰素效价测定；对照为同等量的单纯干扰素水剂。
, 百拇医药
2 结果
2.1 空白栓剂和软膏对细胞培养的细胞毒作用 将空白栓剂和软膏用细胞培养液完全溶解后倍比稀释加入已成片的单层细胞，37℃ 5% CO2恒温箱培养3天，1：10以上稀释度的空白栓剂或涂剂，在镜下肉眼未见明显细胞病变。
2.2 空白栓剂和软膏对单纯疱疹病毒的灭活作用 采用1：10的空白栓剂和软膏的水溶液与定量的单纯疱疹毒混合，37℃1小时后，在2BS人二倍体细胞系上测定抗单纯疱疹病毒效价。结果表明，1：10的空白栓剂和软膏本身对疱疹病毒无直接的体外灭活作用 。
2.3 空白栓剂和软膏对干扰素活性的影响 由表1可见，制备栓剂和软膏的基质成分对干扰素效价测定无明显影响；各组之间进行t值显著性测定，P值均>0.05。在室温下放置2周的复方干扰素栓剂和软膏与立即配制的干扰素栓剂与软膏的干扰素效价也基本一致；各组之间进行t值显著性测定，P值也均>0.05。
, 百拇医药
表 1 空白栓剂和软膏对干扰素活性测定的影响
Tab.1 The effect of placebo suppository and ointment on the interferon activity 干扰素制剂
Interferon
preparation
实验次数
No.exp.
干扰素效价(log/ml)
Interferon titer
(log/ml) (x±s)
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同量干扰素(对照)
Interferon control
8
5.60±0.29
空白栓剂+干扰素
Placebo suppository
+interferon
4
5.46±0.12
干扰素栓剂(室温2周)
Interferon suppository
, http://www.100md.com
(At room temperature for 2 weeks)
4
5.58±0.21
空白软膏+干扰素
Placebo ointment
+interferon
4
5.62±0.20
干扰素软膏(室温2周)
Inerferon ointment
(At room temperature for 2 weeks)
, 百拇医药
4
5.33±0.15
2.4 黄芪-干扰素栓剂和软膏与单纯干扰素抗单纯疱疹病毒活性的比较 由表2可见，黄芪与干扰素栓剂和软膏联合应用可以提高干扰素的抗单纯疱疹病毒的活性。单纯干扰素组与黄芪-干扰素组比较，经t显著性测验表明，P<0.02。
3 讨论
本研究说明，研制复方干扰素抗病毒合剂的剂型-软膏和栓剂的辅形成分对干扰素的测定无明显影响；黄芪与干扰素联合应用组(干扰素栓剂和干扰素软膏)在人二倍体细胞上抑制单纯疱疹病毒繁殖的效价明显高于单纯干扰素
表 2 黄芪-干扰素栓剂和软膏与单纯干扰素抗单纯疱疹病毒活性的比较
Tab.2 Comparison of the anti-herpes virus activity of AM-IFN suppository and ointment with that of interferon alone 干扰素制剂
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Interferon
preparation
实验次数
No.exp.
干扰素效价(log/ml)
Interferon titer
(log/ml) (x±s)
单纯干扰素
Interferon alone
2
4.416±0.115
, 百拇医药 黄芪加干扰素软膏
AM-IFN ointment
2
5.058±0.413
黄芪加干扰素栓剂
AM-IFN suppository
2
5.603±0.232
组，也说明黄芪与干扰素对抑制单纯疱疹病毒繁殖有明显的协同作用，这与前文报道一致〔5〕。复方干扰素栓剂便于在阴道内使用防治与人乳头瘤病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒相关的慢性宫颈炎。由于人乳头瘤病毒16、18型与宫颈癌关系密切，使用复方干扰素栓剂也可起到预防宫颈癌的目的。由此可见，复方抗病毒合剂可成为一种防治常见病的中西医结合的高技术常用药物。参 考 文 献
, 百拇医药
1 钱止维，李玉英，毛淑娟，等.人αD型干扰素治疗慢性宫颈炎的疗效.中华妇产科杂志，1987，22(6)：335-339.
2 Hou Y D,Hu Y W,Jia K L,et al.Effect of Radix Astragali seu Hedysari on the interferon system.Chinese Med,J,1981,94(1):35-40.
3 钱止维，毛淑娟，蔡晓晨，等.人重组αD型干扰素与黄芪联合应用治疗宫颈糜烂.中西医结合杂志，1987，7(5)：268-271.
4 钱止维，毛淑娟，蔡晓晨，等.人宫颈乳头瘤病毒(HPV)对黄芪干扰素的治疗反应.中华实验和临床病毒学杂志，1987，1(1)：60-64.
5 张丽兰，吴德华，侯云德，等.黄芪对基因工程α2b型干扰素抗鼻病毒14型的协同作用.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(1)：77-81.
本研究受卫生部重点开发项目的支持
1997年12月9日收稿 1998年7月8日修回, 百拇医药
单位：100052 北京 病毒基因工程国家重点实验室，中国预防医学科学院生物技术新药研究中心
关键词：黄芪；干扰素；单纯疱疹病毒
中华实验和临床病毒学杂志980324 【摘要】 目的 研究中药黄芪乙醇提取物与重组人α2b型干扰素组成栓剂或软膏的抗单纯疱疹病毒作用。方法 采用2BS细胞，在96孔板上进行栓剂或软膏水溶物对I型单纯疱疹病毒的抑制作用试验；干扰素的效价测定采用WISH/VSV法。结果 黄芪与干扰素联合应用在2BS细胞培养上抑制单纯疱疹病毒的繁殖有明显的协同作用；组成复方干扰素软膏、栓剂的辅形成分对干扰素的测定系统无明显影响。结论 本结果与前文报道的黄芪与干扰素联合应用对抑制14、39型鼻病毒有协同作用的结果是一致的。
Study on the anti-herpes simplex virus activity of a suppository or ointment form of Astragalus membranaceus combined with interferon alpha 2b in human diploid cell culture Zhang Lilan,LiuYongqing,Yu Zhiai et al.Biotech Center for New Pharmaceutical Development,Chinese Academy of Preventive Medicine.State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering,Beijing 100052
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Abstract A study on the anti-herpes simplex virus activity of the suppository or ointment form of Astragalus membranaceus(AM)combined with recombinant human interferon alpha 2b(IFN)was carried out in human diploid cell culture.AM is a Chinese herb medicine and have been used in China as a tonic for thousands of years and the IFN was produced from E.coli with 95%purity.Obtained results indicated that the placebo suppository and ointment(without AM and IFN)seemed not to decrease markedly the anti-viral activity of IFN in WISH/VSV assay system.The anti-herpes simplex virus activities of suppository and ointment forms of AM and IFN were shown to be significantly higher than that of IFN alone.It is well known that chronic cervicitis is closely related to papillomavirus,cytomegalovirus as well as herpes virus infections.The AM-IFN suppository is suggested to be used in the treatment of cervicitis and the ointment in the treatment of skin herpes.
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Key words: Huang Qi Interferon Herpes simplex virus
前文报道，采用纱布浸湿干扰素水剂在宫颈局部贴敷，治疗慢性宫颈炎有明显疗效〔1〕，体外和动物试验证明中药黄芪与干扰素具有协同作用〔2，3〕，黄芪与干扰素联合应用治疗慢性宫颈炎有明显的增效作用，减半量的干扰素与黄芪联合应用的疗效与加倍量的干扰效果相当〔4〕。鉴于水剂剂型治疗慢性宫颈炎或口角疱疹使用不便，我们将重组人α2b型干扰素与黄芪乙醇提取液合理组方，研制成栓剂和软膏，在人二倍体细胞上研究了抗单纯疱疹病毒感染的活性。
1 材料和方法
1.1 病毒株 单纯疱疹病毒I型由中国预防医学科学院病毒学研究所全国医学病毒毒种中心提供，在人二倍体细胞2BS上传代，TCID50/ml为106。滤泡性口腔炎病毒(VSV)由病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室提供，在原代鸡胚细胞中传代。
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1.2 细胞株 2BS细胞系，27代，由北京生物制品研究所提供。细胞培养液为Eagle's液，内含10%初生牛血清，0.03%谷氨酰胺；青霉素100U/ml；链霉素100μg/ml；pH 7.0～7.4。
1.3 黄芪针剂(AM) 深度为2g/ml，购自上海福达制药有限公司。
1.4 干扰素(IFN)及其效价滴定 重组人α2b型干扰素由北京远策药业有限公司生产，从大肠杆菌中提取并纯化，纯度>95%。干扰素效价测定采用WISH细胞/VSV病变抑制法；结果用卫生部药品和生物制品检定所提供的干扰素标准品进行校正。栓剂和软膏均在完全溶于水后进行干扰素测定。
1.5 黄芪-干扰素软膏处方 每100g软膏含黄芪10g，人α2b型干扰素2000万单位，三氯叔丁醇1.5g，卡波末2.0g；软膏呈凝状，细腻，pH6.0。黄芪-干扰素栓剂处方：每100g栓剂含黄芪10g，人α2b型干扰素2000万单位，淀粉30g，乳糖10g，CMS-Na 2g，硬脂酸镁0.5g；栓剂每片重0.4g，37℃水浴中崩解时间小于60秒；硬度大于4kg。
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1.6 干扰素抗单纯疱疹病毒的效果测定 基本上与测定干扰素效价相同，主要点是：采用2BS人二倍体细胞，96孔板，每孔接种细胞104个左右，培养液为Eagle's液，内含10%初生牛血清，0.03%谷氨酰胺，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，37℃，5%CO2恒温箱培养，约2～3天后形成单层，吸去培养液，再用Hank's液洗涤1次，以去除牛血清，将事先溶解的栓剂和涂剂4倍稀释，每稀释度接种2孔，在37℃5%CO2恒温箱过夜培养，次日进行100～1000TCID50/ml单纯疱疹病毒攻击。细胞培养维持液为含2%初生牛血清的Eagle's液，实验组的培养液中还加有1%的黄芪。病毒攻击后继续在37℃ 5% CO2恒温箱中继续培养，待病毒对照管出现完全病变后，结晶紫染色，采用540nm波长滤光片阅读吸光度A值，滴度以国际单位表示。实验中设置对照组，即空白栓剂和空白软膏也先溶于水后与定量的干扰素混合进行干扰素效价测定；对照为同等量的单纯干扰素水剂。
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2 结果
2.1 空白栓剂和软膏对细胞培养的细胞毒作用 将空白栓剂和软膏用细胞培养液完全溶解后倍比稀释加入已成片的单层细胞，37℃ 5% CO2恒温箱培养3天，1：10以上稀释度的空白栓剂或涂剂，在镜下肉眼未见明显细胞病变。
2.2 空白栓剂和软膏对单纯疱疹病毒的灭活作用 采用1：10的空白栓剂和软膏的水溶液与定量的单纯疱疹毒混合，37℃1小时后，在2BS人二倍体细胞系上测定抗单纯疱疹病毒效价。结果表明，1：10的空白栓剂和软膏本身对疱疹病毒无直接的体外灭活作用 。
2.3 空白栓剂和软膏对干扰素活性的影响 由表1可见，制备栓剂和软膏的基质成分对干扰素效价测定无明显影响；各组之间进行t值显著性测定，P值均>0.05。在室温下放置2周的复方干扰素栓剂和软膏与立即配制的干扰素栓剂与软膏的干扰素效价也基本一致；各组之间进行t值显著性测定，P值也均>0.05。
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表 1 空白栓剂和软膏对干扰素活性测定的影响
Tab.1 The effect of placebo suppository and ointment on the interferon activity 干扰素制剂
Interferon
preparation
实验次数
No.exp.
干扰素效价(log/ml)
Interferon titer
(log/ml) (x±s)
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同量干扰素(对照)
Interferon control
8
5.60±0.29
空白栓剂+干扰素
Placebo suppository
+interferon
4
5.46±0.12
干扰素栓剂(室温2周)
Interferon suppository
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(At room temperature for 2 weeks)
4
5.58±0.21
空白软膏+干扰素
Placebo ointment
+interferon
4
5.62±0.20
干扰素软膏(室温2周)
Inerferon ointment
(At room temperature for 2 weeks)
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4
5.33±0.15
2.4 黄芪-干扰素栓剂和软膏与单纯干扰素抗单纯疱疹病毒活性的比较 由表2可见，黄芪与干扰素栓剂和软膏联合应用可以提高干扰素的抗单纯疱疹病毒的活性。单纯干扰素组与黄芪-干扰素组比较，经t显著性测验表明，P<0.02。
3 讨论
本研究说明，研制复方干扰素抗病毒合剂的剂型-软膏和栓剂的辅形成分对干扰素的测定无明显影响；黄芪与干扰素联合应用组(干扰素栓剂和干扰素软膏)在人二倍体细胞上抑制单纯疱疹病毒繁殖的效价明显高于单纯干扰素
表 2 黄芪-干扰素栓剂和软膏与单纯干扰素抗单纯疱疹病毒活性的比较
Tab.2 Comparison of the anti-herpes virus activity of AM-IFN suppository and ointment with that of interferon alone 干扰素制剂
, http://www.100md.com
Interferon
preparation
实验次数
No.exp.
干扰素效价(log/ml)
Interferon titer
(log/ml) (x±s)
单纯干扰素
Interferon alone
2
4.416±0.115
, 百拇医药 黄芪加干扰素软膏
AM-IFN ointment
2
5.058±0.413
黄芪加干扰素栓剂
AM-IFN suppository
2
5.603±0.232
组，也说明黄芪与干扰素对抑制单纯疱疹病毒繁殖有明显的协同作用，这与前文报道一致〔5〕。复方干扰素栓剂便于在阴道内使用防治与人乳头瘤病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒相关的慢性宫颈炎。由于人乳头瘤病毒16、18型与宫颈癌关系密切，使用复方干扰素栓剂也可起到预防宫颈癌的目的。由此可见，复方抗病毒合剂可成为一种防治常见病的中西医结合的高技术常用药物。参 考 文 献
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1 钱止维，李玉英，毛淑娟，等.人αD型干扰素治疗慢性宫颈炎的疗效.中华妇产科杂志，1987，22(6)：335-339.
2 Hou Y D,Hu Y W,Jia K L,et al.Effect of Radix Astragali seu Hedysari on the interferon system.Chinese Med,J,1981,94(1):35-40.
3 钱止维，毛淑娟，蔡晓晨，等.人重组αD型干扰素与黄芪联合应用治疗宫颈糜烂.中西医结合杂志，1987，7(5)：268-271.
4 钱止维，毛淑娟，蔡晓晨，等.人宫颈乳头瘤病毒(HPV)对黄芪干扰素的治疗反应.中华实验和临床病毒学杂志，1987，1(1)：60-64.
5 张丽兰，吴德华，侯云德，等.黄芪对基因工程α2b型干扰素抗鼻病毒14型的协同作用.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(1)：77-81.
本研究受卫生部重点开发项目的支持
1997年12月9日收稿 1998年7月8日修回, 百拇医药