胚胎肢芽提取物对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元的保护作用
作者：刘红光 洪光祥 王发斌 何善述
单位：刘红光 洪光祥 王发斌 430022 武汉,同济医科大学附属协和医院手外科；何善述 同济医科大学生化教研室
关键词：酶；胚胎肢芽提取物；神经元；神经损伤
中华创伤杂志980410 【摘要】 目的 研究周围神经损伤后脊髓前角运动神经元内酶学的变化,并探索从大鼠胚胎肢芽中提取的活性物质(ELBE)对神经元的保护作用。方法 切断大鼠坐骨神经,在近端套接单盲端硅胶管囊,单纯损伤组囊内注满等渗盐水,保护组内注满ELBE。分别于术后1、4天,1、2、3、4周定量测量每克脊髓组织内乙酰胆碱脂酶(AchE)和酸性磷酸酶(ACP)的含量。结果 AchE于损伤后1天开始下降,2周降至最低,以后逐渐回升;ACP于损伤后1天开始升高,1周升至最高,以后逐渐下降;用ELBE处理的动物上述两种酶变化的幅度较小,整个过程也比较平稳。结论 ELBE能通过缓冲神经损伤后神经元内酶学的变化,起到保护神经元的作用,从而减轻神经元损伤的程度,减少神经元死亡的数量,有利于神经再生。
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Protective Effect of Embryonic Limb Buds Extract on Motor Neurons in Anterior Horn of Spinal Cord After Sciatic Nerve Injury LIU Hong-guang, HONG Guang-xiang, WANG Fa-bin, et al. Dept. of Handsurgery, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Aim To study the enzymic change and protection with embryonic limb buds extract (ELBE) of the motor neurons in anterior horn of spinal cord after the sciatic nerve injury. Methods Sixty-eight SD rats were freely divided into 2 groups, then transected the sciatic nerve with a single blind silicone tube which was filled with normal saline (N/S) in the single injury group, and with ELBE in the protection group which could be locally applied to the proximal nerve stump lasting 4 weeks. Activities of acetylcholinesterase (AchE) and acid phosphatase (ACP) in ventral spinal cord of SD rats were quantitatively measured in 1st day, 4th day, 1st week, 2nd week, 3rd week and 4th week after the sciatic nerve injury. Results The rats treated with N/S showed AchE decreased 1 day after the nerve transection, reached its lowest point in 2 weeks, then recovered gradually; ACP increased 1 day after the nerve injury, and reached peak in 1 week, then recovered gradually; The rats protected with ELBE showed relatively smooth change of the two kinds of enzymes. Conclusion ELBE can protect the motor neurons in anterior horn of spinal cord through resisting the change of AchE and ACP.
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【Key words】 Enzyme Embryonic limb buds extract Neurons Nerve injury
周围神经损伤后,不仅远端神经发生变性反应,而且中枢相关神经元也出现变性反应,使一定数量的神经元发生损伤性死亡[1]。如坐骨神经横断常致脊髓前角运动神经元发生轴突反应,形态上表现为尼氏体溶解,核偏位等改变[2]。笔者从测定显示脊髓前角运动神经元活性的标志酶乙酰胆碱脂酶(AchE)和发生损伤性反应的标志酶酸性磷酸酶(ACP)出发,研究周围神经损伤后相关神经元内酶学的变化,并探索从大鼠胚胎肢芽中提取的活性物质(embryonic limb buds extract, ELBE)对神经元的保护作用。
材料与方法
1.ELBE的制备:剖腹取胚龄为10～15天的SD大鼠胚胎68只,将其肢芽剪下,按照笔者等[3]报道的方法制备ELBE。
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2.实验动物及手术方法:选用雌性SD大鼠36只,体重(200±20)g。1%的戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔麻醉成功后,随机切除一侧坐骨神经约1cm的神经段,然后在神经的近侧端用9-0线缝合两针套接一容积约31μl的单盲端硅胶管囊,囊内注满等渗盐水,此组动物为单纯损伤组;另取上述大鼠36只,按同样的手术方法套接相同的硅胶管囊,其内注满ELBE,此组动物为ELBE保护组;再准备上述大鼠6只,不手术,只供取材作正常对照。
3.取材:手术组于术后1天,1,2,4,6周各取6只动物,麻醉后,剪开椎管,取坐骨神经进入的脊髓节段,将其腹侧朝上,沿前正中沟纵行切成两半,再切取腹侧部分,经分析天平称重后作AchE、ACP定量;正常对照组按上述同样方法处理。
4.酶学测量:将切取的脊髓组织立即投入-196℃的液氮中,加入1ml 0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液匀浆,然后用此缓冲液冲洗匀浆管3次,每次1ml;以5 000r/min4℃离心30分钟;取上清液用Sigma公司AchE试剂盒及上海波音特生物科技有限公司ACP试剂盒,分别测定AchE和ACP的含量,并计算出每克组织内的含量。
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5.统计学方法采用t检验。
结 果
1.坐骨神经损伤后大鼠腹侧脊髓内AchE含量的变化:正常情况下AchE含量为(1.64±0.13)U/g脊髓组织。坐骨神经损伤后1天开始下降,2周降至最低,以后逐渐回升;加ELBE处理后,AchE下降缓慢,且幅度较小,1周后即开始回升,整个过程比较平稳。两者差别有非常显著性意义(表1)。
表1 AchE含量的变化(U/g脊髓组织,
±s) 组别
术后时间
1天
4天
1周
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2周
4周
6周
ELBE保护组
1.49±0.10
1.31±0.08
1.26±0.08
1.27±0.09
1.32±0.08
1.37±0.10
单纯损伤组
1.20±0.09
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1.07±0.07
0.82±0.06
0.70±0.05
0.96±0.08
1.08±0.09
组间比较, P<0.01
2.坐骨神经损伤后大鼠腹侧脊髓内ACP含量的变化:正常情况下ACP的含量为(0.20±0.04)U/g脊髓组织。坐骨神经损伤后1天开始上升,1周升至最高,以后逐渐下降;加ELBE处理后,ACP上升缓慢,幅度变小,4天后即开始下降,整个过程波动不大。两者差别有非常显著性意义(表2)。表2 ACP含量的变化(U/g脊髓组织,±s) 组别
, 百拇医药
术后时间
1天
4天
1周
2周
4周
6周
ELBE保护组
0.23±0.02**
0.29±0.03*
0.27±0.02**
0.23±0.02**
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0.21±0.02**
0.19±0.02*
单纯损伤组
0.29±0.03
0.33±0.03
0.37±0.02
0.35±0.03
0.28±0.02
0.24±0.02
组间比较, * P<0.05, ** P<0.01
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讨 论
1.周围神经损伤后研究其神经元酶学变化的意义:AchE是胆碱能神经元递质乙酰胆碱(Ach)的降解酶,它在胆碱能神经元中的含量与Ach的合成呈平行关系,常利用检测AchE来显示神经元合成、分泌、降解Ach的活性[4]。ACP主要位于神经细胞的溶酶体内,它在组织细胞退变过程中活性增强,其活性的高低表示溶酶体膜通透性的高低,可用来显示神经元损伤的程度[5]。因此,测定神经元损伤后相关神经元内AchE和ACP含量的变化,就可以知晓神经元活性的高低和损伤的轻重,并为研究形态上的改变及探索神经元发生损伤性死亡的机制提供依据。同时,也为研究神经损伤后如何保护神经元,减轻其受损的程度和减少死亡的数量提供根据。而且笔者在半定量方法(即脊髓切片染色显示酶活性)的基础上首先在本领域内采用全定量的方法,准确、全面、直观地反映整个脊髓节段内酶分子含量的改变,使之更具有参考价值。
另外,从本实验的结果(表1,2)来看,AchE活性的降低和ACP活性的升高,在神经损伤后的第1天就开始出现,2周内达到高峰,以后处于缓慢的恢复期。因此,采取保护措施应在损伤的早期。这可能是因为神经横断后,胞体立即失去了靶器官对它的营养作用,同时损伤又会刺激其代谢加强,优先合成一些与轴突再生有关的结构蛋白和膜成份[6]。因此,需要更多的营养因子支持,这时如不外源性地补加神经营养活性物质,神经元便会因反应负荷过重而死亡。
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2.ELBE对脊髓前角运动神经元的保护作用:神经营养学说认为,神经元的存活、生长、发育及轴突的再生均离不开神经营养因子(NTFs)的作用。近年来,虽然从多种神经靶器官如骨胳肌、腺体以及雪旺细胞等处获取了多种神经营养因子,但仍有许多神经营养因子至今尚未发现,仍不能使损伤后功能恢复令人满意。胚胎肢芽阶段是周围神经发生的摇篮,因此其内必然含有多种促进轴突生长、维持神经元活性的因子。Henderson等[7]认为促进运动神经元存活的神经营养因子存在于肢芽内;Lundberg等认为胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)肢芽内的基因表达比脑组织还要多[8]。据研究认为,GDNF具有较强的运动性神经营养活性[9]。但系统研究用来治疗神经损伤的文献国内外尚未查见。为此,笔者在总结研究神经生长因子(NGF)经验的基础上,用本实验所述方法从大鼠胚胎肢芽中提取了ELBE,经细胞培养证实基本上保存了肢芽内的神经营养活性因子,除去了大分子杂蛋白和小分子物质[3],为研究ELBE对脊髓前角运动神经元的作用提供了保障。
, 百拇医药
本实验结果表明,ELBE能明显地缓冲神经元因神经损伤后出现AchE降低和ACP升高的变化,使AchE保持一定的活性水平,下降不至于过低,回升却相对较快;使ACP也不至于过高,下降也相对提前,从而减轻神经元损伤的程度,减少发生损伤性死亡的数量。本实验还证实,ELBE通过保护AchE和ACP两种酶的变化起到保护脊髓前角运动神经元的作用,从而有利于神经元再生。
本课题受卫生部科研基金和湖北省自然科学基金资助
参考文献
[1]Himes BT, Tessler A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. J Comp Neurol, 1989, 284∶215-220.
, 百拇医药
[2]Lieberman AR. The axon reactionia review of the principle features of perikaryal response to axon injury. Int Rew Neurobiol, 1971, 14∶49-53.
[3]刘红光,洪光祥,王发斌.胚胎肢芽提取物对体外培养的背根神经节感觉神经元的作用.中华手外科杂志, 1997, 13∶238-241.
[4]Kledanoff ST. Oxygen metabolism and toxic properties of phagocytes. Aun Lut Med, 1980, 93∶480-484.
[5]Hayasaka S. Lysosomal enzyme in ocular tissue and disease. Sury Opthalmol, 1983, 27∶245-258.
, 百拇医药
[6]Tobias GS, Koening E. Axonal protein synthesizing activity during the early outgrowth period following neurotomy. Exp Neurol, 1975, 49∶221-234.
[7]Henderson CE, Camu W, Mettling C, et al. Neurotrophins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud. Nature, 1993, 363∶266-270.
[8]Choi Lundberg DL, Bohn MC. Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA in rat. Brain Res Dev Brain Res, 1995, 85∶80-88.
[9]Henderson CE, Philips HS, Pollock RA, et al. GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 1994, 266∶1062-1066.
(收稿:1997-05-08 修回:1998-04-21), 百拇医药
单位：刘红光 洪光祥 王发斌 430022 武汉,同济医科大学附属协和医院手外科；何善述 同济医科大学生化教研室
关键词：酶；胚胎肢芽提取物；神经元；神经损伤
中华创伤杂志980410 【摘要】 目的 研究周围神经损伤后脊髓前角运动神经元内酶学的变化,并探索从大鼠胚胎肢芽中提取的活性物质(ELBE)对神经元的保护作用。方法 切断大鼠坐骨神经,在近端套接单盲端硅胶管囊,单纯损伤组囊内注满等渗盐水,保护组内注满ELBE。分别于术后1、4天,1、2、3、4周定量测量每克脊髓组织内乙酰胆碱脂酶(AchE)和酸性磷酸酶(ACP)的含量。结果 AchE于损伤后1天开始下降,2周降至最低,以后逐渐回升;ACP于损伤后1天开始升高,1周升至最高,以后逐渐下降;用ELBE处理的动物上述两种酶变化的幅度较小,整个过程也比较平稳。结论 ELBE能通过缓冲神经损伤后神经元内酶学的变化,起到保护神经元的作用,从而减轻神经元损伤的程度,减少神经元死亡的数量,有利于神经再生。
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Protective Effect of Embryonic Limb Buds Extract on Motor Neurons in Anterior Horn of Spinal Cord After Sciatic Nerve Injury LIU Hong-guang, HONG Guang-xiang, WANG Fa-bin, et al. Dept. of Handsurgery, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Aim To study the enzymic change and protection with embryonic limb buds extract (ELBE) of the motor neurons in anterior horn of spinal cord after the sciatic nerve injury. Methods Sixty-eight SD rats were freely divided into 2 groups, then transected the sciatic nerve with a single blind silicone tube which was filled with normal saline (N/S) in the single injury group, and with ELBE in the protection group which could be locally applied to the proximal nerve stump lasting 4 weeks. Activities of acetylcholinesterase (AchE) and acid phosphatase (ACP) in ventral spinal cord of SD rats were quantitatively measured in 1st day, 4th day, 1st week, 2nd week, 3rd week and 4th week after the sciatic nerve injury. Results The rats treated with N/S showed AchE decreased 1 day after the nerve transection, reached its lowest point in 2 weeks, then recovered gradually; ACP increased 1 day after the nerve injury, and reached peak in 1 week, then recovered gradually; The rats protected with ELBE showed relatively smooth change of the two kinds of enzymes. Conclusion ELBE can protect the motor neurons in anterior horn of spinal cord through resisting the change of AchE and ACP.
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【Key words】 Enzyme Embryonic limb buds extract Neurons Nerve injury
周围神经损伤后,不仅远端神经发生变性反应,而且中枢相关神经元也出现变性反应,使一定数量的神经元发生损伤性死亡[1]。如坐骨神经横断常致脊髓前角运动神经元发生轴突反应,形态上表现为尼氏体溶解,核偏位等改变[2]。笔者从测定显示脊髓前角运动神经元活性的标志酶乙酰胆碱脂酶(AchE)和发生损伤性反应的标志酶酸性磷酸酶(ACP)出发,研究周围神经损伤后相关神经元内酶学的变化,并探索从大鼠胚胎肢芽中提取的活性物质(embryonic limb buds extract, ELBE)对神经元的保护作用。
材料与方法
1.ELBE的制备:剖腹取胚龄为10～15天的SD大鼠胚胎68只,将其肢芽剪下,按照笔者等[3]报道的方法制备ELBE。
, 百拇医药
2.实验动物及手术方法:选用雌性SD大鼠36只,体重(200±20)g。1%的戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔麻醉成功后,随机切除一侧坐骨神经约1cm的神经段,然后在神经的近侧端用9-0线缝合两针套接一容积约31μl的单盲端硅胶管囊,囊内注满等渗盐水,此组动物为单纯损伤组;另取上述大鼠36只,按同样的手术方法套接相同的硅胶管囊,其内注满ELBE,此组动物为ELBE保护组;再准备上述大鼠6只,不手术,只供取材作正常对照。
3.取材:手术组于术后1天,1,2,4,6周各取6只动物,麻醉后,剪开椎管,取坐骨神经进入的脊髓节段,将其腹侧朝上,沿前正中沟纵行切成两半,再切取腹侧部分,经分析天平称重后作AchE、ACP定量;正常对照组按上述同样方法处理。
4.酶学测量:将切取的脊髓组织立即投入-196℃的液氮中,加入1ml 0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液匀浆,然后用此缓冲液冲洗匀浆管3次,每次1ml;以5 000r/min4℃离心30分钟;取上清液用Sigma公司AchE试剂盒及上海波音特生物科技有限公司ACP试剂盒,分别测定AchE和ACP的含量,并计算出每克组织内的含量。
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5.统计学方法采用t检验。
结 果
1.坐骨神经损伤后大鼠腹侧脊髓内AchE含量的变化:正常情况下AchE含量为(1.64±0.13)U/g脊髓组织。坐骨神经损伤后1天开始下降,2周降至最低,以后逐渐回升;加ELBE处理后,AchE下降缓慢,且幅度较小,1周后即开始回升,整个过程比较平稳。两者差别有非常显著性意义(表1)。
表1 AchE含量的变化(U/g脊髓组织,
±s) 组别术后时间
1天
4天
1周
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2周
4周
6周
ELBE保护组
1.49±0.10
1.31±0.08
1.26±0.08
1.27±0.09
1.32±0.08
1.37±0.10
单纯损伤组
1.20±0.09
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1.07±0.07
0.82±0.06
0.70±0.05
0.96±0.08
1.08±0.09
组间比较, P<0.01
2.坐骨神经损伤后大鼠腹侧脊髓内ACP含量的变化:正常情况下ACP的含量为(0.20±0.04)U/g脊髓组织。坐骨神经损伤后1天开始上升,1周升至最高,以后逐渐下降;加ELBE处理后,ACP上升缓慢,幅度变小,4天后即开始下降,整个过程波动不大。两者差别有非常显著性意义(表2)。表2 ACP含量的变化(U/g脊髓组织,
±s) 组别, 百拇医药
术后时间
1天
4天
1周
2周
4周
6周
ELBE保护组
0.23±0.02**
0.29±0.03*
0.27±0.02**
0.23±0.02**
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0.21±0.02**
0.19±0.02*
单纯损伤组
0.29±0.03
0.33±0.03
0.37±0.02
0.35±0.03
0.28±0.02
0.24±0.02
组间比较, * P<0.05, ** P<0.01
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讨 论
1.周围神经损伤后研究其神经元酶学变化的意义:AchE是胆碱能神经元递质乙酰胆碱(Ach)的降解酶,它在胆碱能神经元中的含量与Ach的合成呈平行关系,常利用检测AchE来显示神经元合成、分泌、降解Ach的活性[4]。ACP主要位于神经细胞的溶酶体内,它在组织细胞退变过程中活性增强,其活性的高低表示溶酶体膜通透性的高低,可用来显示神经元损伤的程度[5]。因此,测定神经元损伤后相关神经元内AchE和ACP含量的变化,就可以知晓神经元活性的高低和损伤的轻重,并为研究形态上的改变及探索神经元发生损伤性死亡的机制提供依据。同时,也为研究神经损伤后如何保护神经元,减轻其受损的程度和减少死亡的数量提供根据。而且笔者在半定量方法(即脊髓切片染色显示酶活性)的基础上首先在本领域内采用全定量的方法,准确、全面、直观地反映整个脊髓节段内酶分子含量的改变,使之更具有参考价值。
另外,从本实验的结果(表1,2)来看,AchE活性的降低和ACP活性的升高,在神经损伤后的第1天就开始出现,2周内达到高峰,以后处于缓慢的恢复期。因此,采取保护措施应在损伤的早期。这可能是因为神经横断后,胞体立即失去了靶器官对它的营养作用,同时损伤又会刺激其代谢加强,优先合成一些与轴突再生有关的结构蛋白和膜成份[6]。因此,需要更多的营养因子支持,这时如不外源性地补加神经营养活性物质,神经元便会因反应负荷过重而死亡。
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2.ELBE对脊髓前角运动神经元的保护作用:神经营养学说认为,神经元的存活、生长、发育及轴突的再生均离不开神经营养因子(NTFs)的作用。近年来,虽然从多种神经靶器官如骨胳肌、腺体以及雪旺细胞等处获取了多种神经营养因子,但仍有许多神经营养因子至今尚未发现,仍不能使损伤后功能恢复令人满意。胚胎肢芽阶段是周围神经发生的摇篮,因此其内必然含有多种促进轴突生长、维持神经元活性的因子。Henderson等[7]认为促进运动神经元存活的神经营养因子存在于肢芽内;Lundberg等认为胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)肢芽内的基因表达比脑组织还要多[8]。据研究认为,GDNF具有较强的运动性神经营养活性[9]。但系统研究用来治疗神经损伤的文献国内外尚未查见。为此,笔者在总结研究神经生长因子(NGF)经验的基础上,用本实验所述方法从大鼠胚胎肢芽中提取了ELBE,经细胞培养证实基本上保存了肢芽内的神经营养活性因子,除去了大分子杂蛋白和小分子物质[3],为研究ELBE对脊髓前角运动神经元的作用提供了保障。
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本实验结果表明,ELBE能明显地缓冲神经元因神经损伤后出现AchE降低和ACP升高的变化,使AchE保持一定的活性水平,下降不至于过低,回升却相对较快;使ACP也不至于过高,下降也相对提前,从而减轻神经元损伤的程度,减少发生损伤性死亡的数量。本实验还证实,ELBE通过保护AchE和ACP两种酶的变化起到保护脊髓前角运动神经元的作用,从而有利于神经元再生。
本课题受卫生部科研基金和湖北省自然科学基金资助
参考文献
[1]Himes BT, Tessler A. Death of some dorsal root ganglion neurons and plasticity of others following sciatic nerve section in adult and neonatal rats. J Comp Neurol, 1989, 284∶215-220.
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[2]Lieberman AR. The axon reactionia review of the principle features of perikaryal response to axon injury. Int Rew Neurobiol, 1971, 14∶49-53.
[3]刘红光,洪光祥,王发斌.胚胎肢芽提取物对体外培养的背根神经节感觉神经元的作用.中华手外科杂志, 1997, 13∶238-241.
[4]Kledanoff ST. Oxygen metabolism and toxic properties of phagocytes. Aun Lut Med, 1980, 93∶480-484.
[5]Hayasaka S. Lysosomal enzyme in ocular tissue and disease. Sury Opthalmol, 1983, 27∶245-258.
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[6]Tobias GS, Koening E. Axonal protein synthesizing activity during the early outgrowth period following neurotomy. Exp Neurol, 1975, 49∶221-234.
[7]Henderson CE, Camu W, Mettling C, et al. Neurotrophins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud. Nature, 1993, 363∶266-270.
[8]Choi Lundberg DL, Bohn MC. Ontogeny and distribution of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA in rat. Brain Res Dev Brain Res, 1995, 85∶80-88.
[9]Henderson CE, Philips HS, Pollock RA, et al. GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science, 1994, 266∶1062-1066.
(收稿:1997-05-08 修回:1998-04-21), 百拇医药