用核糖体DNA鉴别PCR区分中华按蚊和嗜人按蚊
作者：马雅军△ 瞿逢伊 徐建农 郑哲民△
单位：
关键词：中华按蚊；嗜人按蚊；DNA；核糖体；聚合酶链反应
摘要 目的摘要 目的： 探讨一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对大鼠液压脑损伤后神经行为的影响。方法：大鼠在液压脑创伤后给予不同剂量的L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)和L-精氨酸后，检测脑组织中NOS的活性，并观察大鼠神经行为的变化。结果： L- NAME(8 mg/kg)延迟神经行为的恢复，L-NAME(40 mg/kg)可明显抑制NOS活性、降低皮质血流量，加重神经行为的损害。结论： NOS在液压脑损伤后的继发性病理改变中起重要作用。
中国图书资料分类法分类号 R651.15
L-Nitro-arginine methyl ester does damage to rat neural behavior after brain traumaQian Hongsong, Zhang Guangji, Zhu Cheng (Department Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the effect of nitric oxide synthase inhibitors L-nitro-arginine methyl ester (L-NAME) on the neural behavior deficit of rats after fluid percussion brain injury. Methods: The rats neural behavior deficit was observed after various doses of L-NAME and L-arginine (300 mg/kg) were given to rats following fluid percussion brain injury. The activity of nitric oxide synthase was also assayed. Results: L-Arginine did not alter the neural behavior deficit. L-NAME (8 mg/kg) delayed the recovery of rat neural behavior, L-NAME (40 mg/kg) significantly inhibited the activity of nitric oxide synthase and did damage to rat neural behavior compared to the control group. Conclusion: Nitric oxide synthase plays an important role in rat secondary injuries following fluid percussion brain trauma.
, 百拇医药
Key words brain injury; neural behavior; L-nitro-arginine methyl ester
目前，大量的研究资料表明，一氧化氮(NO)参与脑缺血病理生理过程,但有关 NO在脑缺血损害中的确切作用仍未明了。本实验通过给予NO合酶(NOS)的抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)或底物L-精氨酸(L-Arg)间接改变NO的生成量，观察其对创伤大鼠神经行为的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 SD大鼠60只，雄性，体质量为250～320 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。大鼠随机分成4组(其中每组5只,用以测定酶的活性)：第1组：对照组，注射生理盐水；第2组：注射L-Arg 300 mg/kg; 第3组：注射L-NAME 8 mg/kg；第4组：注射L-NAME 40 mg/kg。L-NAME及L-Arg均购自美国Sigma公司。各实验组所用的药物均溶于0.5 ml的生理盐水，在10 min内从大鼠尾静脉注入。
, 百拇医药
1.2 动物模型复制 按文献方法建立大鼠液压脑创伤模型[1]，予以152～172 kPa压力打击,致大鼠中型颅脑伤。
1.3 NOS的活性测定 大鼠脑组织中NOS的活性测定参照Bredt等[2]的方法建立。大鼠在给药后30min处死，取创伤脑皮层组织进行测定。
1.4 脑皮质血流量的监测 应用激光多普勒血流仪(LDF-1)监测创伤脑皮层的血流量变化。
1.5 评分标准 按Dixon等[1]建立的方法，即平衡试验、行走试验和吊绳试验进行神经行为损害的评价。平衡试验的积分是根据大鼠在实验木条上平衡站立60 s的情况来评定的。积分：1分，60 s内处于稳定的平衡姿势；2分，抱住木条或用肢体勾住木条持续60 s以上；3分，没有能力平衡，立即从木条上摔下来。行走试验的积分是根据大鼠在实验木条上逃离噪声和白亮光刺激的时间来判定的。吊绳试验是根据大鼠用前爪抓住实验用的麻绳悬吊躯体观察10 s的情况来评定的，积分：1分，后肢也抓住麻绳并爬上；2分，在观察的10 s期间用前爪抓住麻绳没有掉下；3分，不到10 s即从麻绳上掉下。
, 百拇医药
1.6 统计学处理 血流量值及行走实验数据用t检验，平衡试验及吊绳实验用F检验。
2 结 果
2.1 体质量变化 L-Arg 300 mg/kg组及L-NAME 8 mg/kg组与对照组相当，在液压打击致中型闭合性颅脑伤后3～4 d，大鼠体质量降至最低点，至伤后7 d基本恢复正常。而L-NAME 40 mg/kg组与对照组相比，大鼠体质量下降更为明显，且恢复明显减慢。
2.2 对脑皮质血流量的影响 大鼠液压脑创伤后应用L-Arg及L-NAME对创伤脑皮层血流量的影响见表1。
2.3 对NOS活性的影响 L-Arg不影响组织中NOS的活性，而L-NAME可明显抑制NOS的活性，并随剂量增大,抑制作用更明显；L-NAME 8 mg/kg可抑制同期酶的活性达(59.4±5.3)%, 而L-NAME 40 mg/kg则达(78.9±6.1)%,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。
, 百拇医药
表 1 L-NAME对创伤后不同时间与创伤前脑皮层血流量的比值的影响
Tab 1 Effect of L-NAME on the ratio of rCBF after brain trauma compared with before trauma(n=7)
Group
Before trauma
After trauma (t/min)
5
20
40
60
90
, 百拇医药
120
150
Control
1.00
0.60±0.07
0.59±0.06
0.67±0.05
0.72±0.10
0.69±0.09
0.67±0.08
0.62±0.06
L-Arg
, 百拇医药
(300 mg/kg)
1.00
0.63±0.06
0.51±0.04**
0.46±0.04**
0.64±0.07
0.68±0.08
0.62±0.04
0.60±0.05
L-NAME
(8 mg/kg)
, 百拇医药
1.00
0.67±0.07
0.60±0.07
0.41±0.05**
0.40±0.06**
0.35±0.04**
0.36±0.04**
0.39±0.06**
L-NAME
(40 mg/kg)
, 百拇医药
1.00
0.61±0.07
0.62±0.06
0.40±0.05**
0.37±0.04**
0.30±0.03**
0.32±0.04**
0.62±0.06
rCBF: regional cerebral blood flow; **P< 0.01 vs control
, http://www.100md.com
2.4 神经行为评价结果 大鼠液压脑创伤后1 d，各组行走功能、平衡功能及肌力协调功能降低最为明显，以后逐渐恢复。与对照组相比，L-Arg组的恢复情况与对照组无明显差异，而L-NAME 8 mg/
图 1 行走试验
Fig 1 Beam-walk test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg
图 2 平衡试验
, 百拇医药
Fig 2 Beam-balance test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg; *P<0.05,**P<0.01 vs control
kg组在伤后7 d功能恢复减慢，至伤后14 d才恢复正常；L-NAME 40 mg/kg伤后1 d损害比对照组更严重，且伤后各时期内恢复均明显减慢，部分损伤大鼠还出现肌肉萎缩(图1,2，3)。
图 3 吊绳试验
, 百拇医药
Fig 3 Rope-hang test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg; *P<0.05,**P<0.01 vs control
3 讨 论
本实验结果显示，在大鼠液压打击伤后10～20 min，静脉内给予NOS抑制剂L-NAME可明显抑制脑创伤皮层组织中NOS的活性,进一步降低皮层局部脑血流量，加重脑创伤后神经行为的损害，并延缓神经功能的恢复。这种损害作用在一定的范围内随剂量的增加而增大，而伤后10 min予以单剂量的L-Arg，与对照组相比对神经功能影响却无明显差异。这结果证实了创伤早期过度抑制NOS的活性，可产生细胞毒性作用。产生这种毒性作用的可能原因是:脑创伤后应用大剂量NOS抑制剂，可过度抑制NOS的活性，生成少量的NO,不足以维持血管的张力，脑血管功能调节紊乱，致伤后血液供应进一步减少。同时NO作为血小板聚集抑制因子的作用得不到发挥,而使血流动力学紊乱，进一步影响血液的供给。再者，NO是一种神经递质,神经组织内NO生成量的过度减少，可使神经信号传导受到影响，也可造成神经组织损害[3,4]。L-NAME又是一种非特异性NOS抑制剂，对心肺功能也可产生毒性作用，间接加重神经损害。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Dixon CE, Lyeth BG, Povlishock JT, et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J Neurosurg, 1987,67(1):110
2 Bredt DS, Synder SH. Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci USA， 1990,87(2):682
3 Zhang J, Benveniste H, Klitzman B, et al. Nitric oxide synthase inhibition and extracellular glutamate concentration after cerebral ischemia/reperfusion. Stroke, 1995,26(2):298
4 Christian M, Catherine V, Monique A, et al. Reduction of the neurological deficit in mice with traumatic brain injury by nitric oxide synthase inhibitors. J Neurotrauma, 1996,13(1):11
(1997-12-20收稿, 1998-05-26修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：中华按蚊；嗜人按蚊；DNA；核糖体；聚合酶链反应
摘要 目的摘要 目的： 探讨一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对大鼠液压脑损伤后神经行为的影响。方法：大鼠在液压脑创伤后给予不同剂量的L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)和L-精氨酸后，检测脑组织中NOS的活性，并观察大鼠神经行为的变化。结果： L- NAME(8 mg/kg)延迟神经行为的恢复，L-NAME(40 mg/kg)可明显抑制NOS活性、降低皮质血流量，加重神经行为的损害。结论： NOS在液压脑损伤后的继发性病理改变中起重要作用。
中国图书资料分类法分类号 R651.15
L-Nitro-arginine methyl ester does damage to rat neural behavior after brain traumaQian Hongsong, Zhang Guangji, Zhu Cheng (Department Neurosurgery, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200003)
, 百拇医药
Abstract Objective: To investigate the effect of nitric oxide synthase inhibitors L-nitro-arginine methyl ester (L-NAME) on the neural behavior deficit of rats after fluid percussion brain injury. Methods: The rats neural behavior deficit was observed after various doses of L-NAME and L-arginine (300 mg/kg) were given to rats following fluid percussion brain injury. The activity of nitric oxide synthase was also assayed. Results: L-Arginine did not alter the neural behavior deficit. L-NAME (8 mg/kg) delayed the recovery of rat neural behavior, L-NAME (40 mg/kg) significantly inhibited the activity of nitric oxide synthase and did damage to rat neural behavior compared to the control group. Conclusion: Nitric oxide synthase plays an important role in rat secondary injuries following fluid percussion brain trauma.
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Key words brain injury; neural behavior; L-nitro-arginine methyl ester
目前，大量的研究资料表明，一氧化氮(NO)参与脑缺血病理生理过程,但有关 NO在脑缺血损害中的确切作用仍未明了。本实验通过给予NO合酶(NOS)的抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)或底物L-精氨酸(L-Arg)间接改变NO的生成量，观察其对创伤大鼠神经行为的影响。
1 材料和方法
1.1 动物及分组 SD大鼠60只，雄性，体质量为250～320 g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。大鼠随机分成4组(其中每组5只,用以测定酶的活性)：第1组：对照组，注射生理盐水；第2组：注射L-Arg 300 mg/kg; 第3组：注射L-NAME 8 mg/kg；第4组：注射L-NAME 40 mg/kg。L-NAME及L-Arg均购自美国Sigma公司。各实验组所用的药物均溶于0.5 ml的生理盐水，在10 min内从大鼠尾静脉注入。
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1.2 动物模型复制 按文献方法建立大鼠液压脑创伤模型[1]，予以152～172 kPa压力打击,致大鼠中型颅脑伤。
1.3 NOS的活性测定 大鼠脑组织中NOS的活性测定参照Bredt等[2]的方法建立。大鼠在给药后30min处死，取创伤脑皮层组织进行测定。
1.4 脑皮质血流量的监测 应用激光多普勒血流仪(LDF-1)监测创伤脑皮层的血流量变化。
1.5 评分标准 按Dixon等[1]建立的方法，即平衡试验、行走试验和吊绳试验进行神经行为损害的评价。平衡试验的积分是根据大鼠在实验木条上平衡站立60 s的情况来评定的。积分：1分，60 s内处于稳定的平衡姿势；2分，抱住木条或用肢体勾住木条持续60 s以上；3分，没有能力平衡，立即从木条上摔下来。行走试验的积分是根据大鼠在实验木条上逃离噪声和白亮光刺激的时间来判定的。吊绳试验是根据大鼠用前爪抓住实验用的麻绳悬吊躯体观察10 s的情况来评定的，积分：1分，后肢也抓住麻绳并爬上；2分，在观察的10 s期间用前爪抓住麻绳没有掉下；3分，不到10 s即从麻绳上掉下。
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1.6 统计学处理 血流量值及行走实验数据用t检验，平衡试验及吊绳实验用F检验。
2 结 果
2.1 体质量变化 L-Arg 300 mg/kg组及L-NAME 8 mg/kg组与对照组相当，在液压打击致中型闭合性颅脑伤后3～4 d，大鼠体质量降至最低点，至伤后7 d基本恢复正常。而L-NAME 40 mg/kg组与对照组相比，大鼠体质量下降更为明显，且恢复明显减慢。
2.2 对脑皮质血流量的影响 大鼠液压脑创伤后应用L-Arg及L-NAME对创伤脑皮层血流量的影响见表1。
2.3 对NOS活性的影响 L-Arg不影响组织中NOS的活性，而L-NAME可明显抑制NOS的活性，并随剂量增大,抑制作用更明显；L-NAME 8 mg/kg可抑制同期酶的活性达(59.4±5.3)%, 而L-NAME 40 mg/kg则达(78.9±6.1)%,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。
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表 1 L-NAME对创伤后不同时间与创伤前脑皮层血流量的比值的影响
Tab 1 Effect of L-NAME on the ratio of rCBF after brain trauma compared with before trauma(n=7)
Group
Before trauma
After trauma (t/min)
5
20
40
60
90
, 百拇医药
120
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Control
1.00
0.60±0.07
0.59±0.06
0.67±0.05
0.72±0.10
0.69±0.09
0.67±0.08
0.62±0.06
L-Arg
, 百拇医药
(300 mg/kg)
1.00
0.63±0.06
0.51±0.04**
0.46±0.04**
0.64±0.07
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L-NAME
(8 mg/kg)
, 百拇医药
1.00
0.67±0.07
0.60±0.07
0.41±0.05**
0.40±0.06**
0.35±0.04**
0.36±0.04**
0.39±0.06**
L-NAME
(40 mg/kg)
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1.00
0.61±0.07
0.62±0.06
0.40±0.05**
0.37±0.04**
0.30±0.03**
0.32±0.04**
0.62±0.06
rCBF: regional cerebral blood flow; **P< 0.01 vs control
, http://www.100md.com
2.4 神经行为评价结果 大鼠液压脑创伤后1 d，各组行走功能、平衡功能及肌力协调功能降低最为明显，以后逐渐恢复。与对照组相比，L-Arg组的恢复情况与对照组无明显差异，而L-NAME 8 mg/
图 1 行走试验
Fig 1 Beam-walk test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg
图 2 平衡试验
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Fig 2 Beam-balance test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg; *P<0.05,**P<0.01 vs control
kg组在伤后7 d功能恢复减慢，至伤后14 d才恢复正常；L-NAME 40 mg/kg伤后1 d损害比对照组更严重，且伤后各时期内恢复均明显减慢，部分损伤大鼠还出现肌肉萎缩(图1,2，3)。
图 3 吊绳试验
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Fig 3 Rope-hang test
□: Control; □: L-Arg; □: L-NAME 8 mg/kg;
□: L-NAME 40 mg/kg; *P<0.05,**P<0.01 vs control
3 讨 论
本实验结果显示，在大鼠液压打击伤后10～20 min，静脉内给予NOS抑制剂L-NAME可明显抑制脑创伤皮层组织中NOS的活性,进一步降低皮层局部脑血流量，加重脑创伤后神经行为的损害，并延缓神经功能的恢复。这种损害作用在一定的范围内随剂量的增加而增大，而伤后10 min予以单剂量的L-Arg，与对照组相比对神经功能影响却无明显差异。这结果证实了创伤早期过度抑制NOS的活性，可产生细胞毒性作用。产生这种毒性作用的可能原因是:脑创伤后应用大剂量NOS抑制剂，可过度抑制NOS的活性，生成少量的NO,不足以维持血管的张力，脑血管功能调节紊乱，致伤后血液供应进一步减少。同时NO作为血小板聚集抑制因子的作用得不到发挥,而使血流动力学紊乱，进一步影响血液的供给。再者，NO是一种神经递质,神经组织内NO生成量的过度减少，可使神经信号传导受到影响，也可造成神经组织损害[3,4]。L-NAME又是一种非特异性NOS抑制剂，对心肺功能也可产生毒性作用，间接加重神经损害。
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参 考 文 献
1 Dixon CE, Lyeth BG, Povlishock JT, et al. A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat. J Neurosurg, 1987,67(1):110
2 Bredt DS, Synder SH. Isolation of nitric oxide synthase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci USA， 1990,87(2):682
3 Zhang J, Benveniste H, Klitzman B, et al. Nitric oxide synthase inhibition and extracellular glutamate concentration after cerebral ischemia/reperfusion. Stroke, 1995,26(2):298
4 Christian M, Catherine V, Monique A, et al. Reduction of the neurological deficit in mice with traumatic brain injury by nitric oxide synthase inhibitors. J Neurotrauma, 1996,13(1):11
(1997-12-20收稿, 1998-05-26修回)
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