5′非翻译区在丙型肝炎病毒基因诊断和基因治疗中的应用
作者：李勇年 斯崇文 刘芳华
单位：100034 北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：
中华传染病杂志980421 全长的丙型肝炎病毒(HCV)基因组约9.4kb,5′非翻译区(5′UTR)仅占其中极少的一部分，约 324～341个bp。对该区的结构分析提示，HCV 5′UTR可能参与HCV的复制和表达调控。业已发现，5′UTR具有启动病毒多蛋白翻译的重要功能[1]，其一级及二级结构似乎均十分保守[2]。HCV 5′UTR的这些结构和功能特点，使之广泛用于HCV的基因诊断和基因治疗。
一、在基因诊断中的应用
随着对HCV基因组编码区结构了解的加深，用于HCV抗体检测的免疫学诊断方法日臻完善，不断有新一代的ELISA和RIBA试剂盒诞生。但是，由于血清中HCV滴度低，检测HCV RNA仍然是目前检测HCV最主要的手段。所有检测HCV RNA的方法几乎均与HCV 5′UTR结构密切相关。
, 百拇医药
(一)用于定性诊断 HCV RNA的定性诊断大致可分为两类，即PCR和杂交试验。PCR为其主要方法，已广泛应用于临床血清标本的常规检测。所采用的引物几乎全来源于HCV 5′UTR序列，理由是该区在HCV基因组结构中最为保守，可以最大限度地避免对HCV所有型别和变异株的漏检。有文献报道，除了C区引物外，用HCV基因组其它区引物所做PCR的检出率，均明显低于5′UTR引物[3]。即使如此，比较了基因库中众多的HCV 5′UTR序列后发现，在这一极为保守的区域内仍有两个变异较多的区域[4]。显然，用于检测HCV RNA的引物应避开所有这些易变异的部位。同时也应避免使用与瘟病毒属病毒高度同源区的引物，以防止因可能存在其它的人瘟病毒属病毒样致病因子所引起的交叉反应[5]。目前，HCV RNA检测中存在的最大问题在于，国内外用于检测HCV RNA的PCR引物均由各公司及研究者自行设计，尽管普遍采用了5′UTR引物，但引物序列多不相同，即所获得的扩增产物的长度和在5′UTR中的相应位置均不相同，因而彼此间检测结果差异较大。欧洲病毒性肝炎专家组曾将22份HCV RNA阳性及阴性标准血清分送到世界各地的31个实验室，结果显示，仅有10个(32%)实验室检测结果完全正确，有11个(35%)实验室未能检出经过稀释的弱阳性标本，还有10个实验室的检测结果完全错误[6]。分析其原因，除了RNA提取方法和操作中的污染等因素外，采用了不同的5′UTR引物可能是其主要原因。为了保证检测的敏感性和可比性，从引物角度对HCV RNA的PCR诊断试剂进行标化无疑是十分重要的。
, 百拇医药
HCV RNA杂交试验也多采用5′UTR做为标记样针[7，8]。但其应用受到HCV滴度低的限制，仅在组织标本检查等少数情况下使用。
(二)用于定量诊断 定量检测HCV RNA的方法有多种，但以竞争PCR法和分枝DNA(bDNA)检测法最为常见。前者需首先制备作为标准对照的HCV RNA或cDNA，如采用定点突变、体外转录内部形成EcoRI酶切位点的5′UTR RNA[9]，或者通过删除突变、合成内部缺少106个核苷酸的5′UTR cDNA[10]，然后采用上述的5′UTR区引物，在加入待测样品和标准对照的同一反应体系中比较两者扩增产物的相对含量。由于标准对照含量已知，因而可以推算出待测样品中的HCV RNA含量。竞争PCR法所能检出的HCV RNA最低含量为每毫升血清104～109.5个拷贝。由于该方法可以在常规的HCV RNA检测基础上进行，使用起来十分方便。bDNA检测法则是把捕捉HCV RNA的合成探针包被在固相载体上，当样品中的HCV RNA与之结合后，再用能结合酶类的分枝状DNA进行杂交，最后加入底物显色。用于捕捉和与酶结合的分枝状探针均针对HCV 5′UTR及部分C区序列[11]。bDNA法的敏感性低于PCR法，约为每毫升350 000mol。
, http://www.100md.com
(三)用于分型诊断
与编码区相比，5′UTR的变异十分有限。并且，研究发现这些变异并非随机发生。Ohba[12]采用毗邻连接方法建立了HCV 5′UTR核苷酸序列的种系发生树结构，该结构提示，按5′UTR可将HCV分为7个主要的基因型。归纳起来，目前依照5′UTR进行HCV基因分型的方法有三种。(1) 直接测序：即将所测得的HCV 5′UTR核苷酸序列与已知型别的HCV序列相比较，得出该序列HCV的基因型。O'brten[13] 采用这种方法，对64份HCV RNA阳性患者血清检测表明，存在3个型和5个亚型。(2)限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)：是根据HCV各型及亚型的序列特点，采用不同内切酶消化，从而得出不同长度酶切片段的分型方法。以5′UTR序列为基础，用这种方法可将HCV分为6个型和6个亚型，与其它编码区分型有良好的一致性[14，15]。(3)线探针分型法(LiPA)：是一种逆转录杂交方法，即首先逆转录扩增出HCV 5′UTR片段，然后用平行固定在膜上的5′UTR寡核苷酸探针与之杂交，因其结果为相互平行的线状条带而命名之。 Stuyver[16]用该方法在61份HCV RNA阳性血清中分出了4个型和4个亚型。
, 百拇医药
如上所述，5′UTR是目前全球检测HCV RNA的通用区域。因而，采用5′UTR进行HCV基因分型，无疑是十分简便的。此外，各HCV型及亚型在该区的差异相对较少，减少了实际工作中 的难度。更为重要的是，这些与HCV基因分型戚戚相关的核苷酸变异均位于该区的-170至-155和-132至-117两个区域，并呈现共突变特性[5]，提示这些变异与HCV RNA二极结构的形成有关。在人工模拟的HCV RNA二级结构中，这两个变异区也恰好位于对HCV RNA有效启动病毒多蛋白翻译至关重要的结构域Ⅲ[1]。因此，采用5′UTR进行HCV基因分型，可能更具有进化和生物学意义。值得指出，5′UTR所能区别的HCV基因型毕竟有限，仅适合在以下情况使用。(1)初步分型。(2)已大致明确HCV基因型分布的地域。(3)与HCV编码区分型配合使用。
二、在基因治疗中的应用
借助基因治疗进行抗HCV的研究报道尚不多见，其根本原因在于缺乏理想的敏感细胞系和容易获得的动物模型。最近，随着对HCV基因组各区功能的了解，尤其是HCV 5′UTR翻译启动功能的阐明，这一领域的工作才骤然活跃起来。作为基因治疗的靶区首推5′UTR。Wakita[17]用包含HCV 5′UTR、C区和E区的cDNA片段插入到质粒PUC 19，构成表达载体，继之， 在体外转录为RNA，作为体外翻译的模板。与此同时，作者合成了27个正义和反义脱氧寡核苷酸(Oligo)，这些Oligo分别针对HCV 5′UTR及毗邻启始密码AUG的C区。在体外翻译之前，将它们分别与HCV RNA模板相混合。结果发现，互补于5′UTR 38～65、134～175、312～339位和C区341～327位的Oligo能够有效地阻断C、E区蛋白的表达，其余正、反义Oligo均无此作用。这种阻断作用的机制可能是抑制了核糖体5′UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)的结合或者妨碍了其它与核糖体复合物形成有关的RNA结合蛋白的结合。在细胞水平，如果将上述4种反义Oligo直接加入到细胞培养液中，却未观察到与体外翻译类似的作用。只有将它们与脱唾液酸糖蛋白混合，借助靶细胞膜表面的脱唾液酸糖蛋白受体导入细胞才显示出明显的封闭作用[18]。
, 百拇医药
采用反义RNA抗HCV的研究也已见诸报道。有人[19]将针对HCV 5′UTR及部分C区的反义RNA与上述类似的HCV表达载体混合，进行体外翻译。发现反义RNA对HCV RNA的翻译抑制率大于90%，两者共转染肝癌细胞系Huh-7后，抑制率也达到50%，为构建反义的逆转录病毒或腺病毒载体进行抗HCV转基因治疗奠定了基础。Sakamoto[20]则合成了两个针对5′UTR和一个针对C区的锤头状Ribozyme。尽管这些Ribozyme在细胞外均可定点切割HCV RNA，但只有针对5′UTR中翻译启始密码上游的一个Ribozyme具有明显地抑制HCV RNA表达的作用。最近，Lieber[21]又构建了多个腺病毒Ribozyme表达载体，剪切靶区选择在HCV正链或负链的5′UTR和C区。用这些重组病毒感染能够稳定表达HCV RNA的CHO细胞和丙型肝炎患者的肝组织培养细胞后发现，HCV RNA的含量较对照明显减少。并且，无论是将几种针对不同剪切位点的Ri-bozyme重组病毒混合使用抑或将它们串联在一个载体感染靶细胞，均可使其抑制HCV RNA的作用明显加强，表明针对HCV不同链和不同位点的Ribozyme具有协同作用。由于HCV具有多基因型和易发生变异的特点，这种多靶位Ribozyme引入策略，可能更有利于提高Ribozyme剪切靶RNA效率，防止Ribozyme抗性病毒株的产生。从理论个讲，Ribozyme与反义寡核酸的不同点在于，除能结合靶基因外，还可以特异性地剪切靶基因，具有更高的抗病毒效率，但前提是Ribozyme必须始终保持其对剪切至关重要的酶活性中心的二级结构，同时要求被Ribozyme作用的靶位在靶基因表面有良好的暴露。借助病毒载体将Ribozyme导入靶细胞则要考虑其表达的强度和时相。所有这些环节都还有待进一步加以研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Tsukiyama-Kohara K, Liauka N, Kohara H, et al. Internal Ribosome entry site within hepatitis C virus RNA. J Virol, 1992, 66:1476-1483.
2 Brown EA, Zhang H, Ping LH, et al. Secondary structure of the 5′nontranslated region of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs. Nucleic Acids Res, 1992, 20:5041-5045.
3 Okamoto H, Okada S, Sugivama Y, et al. The 5′-terminal sequence of the hepatitis C virus genome. Jpn J Exp Med, 1990, 60:167-177.
, 百拇医药
4 Kleter GE, van Doorn LJ, Browwer JT, et al. Sequences analysis of the 5′untranslated region in isolates of at least four genotypes of hepatitis C virus in the nether lands. J Clin Microbiol, 1994, 32:306-310.
5 Houghton MA, Weiner A, Han J, et al. Molecular biology of the hepatitis C virus: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991,14: 381-388.
6 Zaaijer HL, Cuypers HT, Reesink HW, et al. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet, 1993, 341: 722-724.
, 百拇医药
7 Hu KQ, Yu CH, Vierling JM. Direct detection of circulating hepatitis C virus RNA using probes from the 5′untranslated region. J Clin Invest, 1992, 89:2040-2045.
8 Lau JYN, Davis GL. Detection of hepatitis C virus RNA
genome in liver tissue by nonisotopic in site hybridization. J Med Virol, 1994, 42:268-271.
9 Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al. Quantitation of hepatitis C virus RNA in serum of asymptomatic blood donors and patients with type C chronic liver disease. Hepatology, 1993, 17:545-550.
, http://www.100md.com
10 Kaneko S, Murakami S, Unoura M, et al. Quantitation of hepatitis C virus RNA by competitive polymerase chain reaction. J Med Virol, 1992, 37:278-282.
11 Vrdea MS. Synthesis and characterization of branch DNA
(bDNA) for the direct and quantititative detection of CMV. HBV, HCV and HIV. Clin Chem, 1993, 39:725-726.
12 Ohba K, Mizokami M, Ohno T, et al. Classification of hepatitis C virus into major types and subtypes based on molecular evolutionary analysis. Virus Res, 1995, 36:201-214.
, 百拇医药
13 O'Briev CB, Henzel B, Wolfe. DNA sequencing of 5′-UTR to determing genotypes in patients with chronic HCV. Hepatology, 1995, 22:359A.
14 Murphy D, Willems B, Delage G. Use of the 5′noncoding region for genotyping hepatitis C virus. J Infect Dis, 1994, 169:473-475.
15 Davidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5′non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204.
, http://www.100md.com
16 Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J Gen Virol, 1993, 74:1093-1102.
17 Wakita T, Wang JR. Specific inhibition of hepatitis C virus expression by antisense oligodeoxynucleotides. J Biol Chem, 1994, 269:14205-14210.
18 Wu CH, Siddigui A, Wu GY. Target inhibition of HCV promoter activity using HCV specific antisense DNA. Hepatology, 1995, 22:330A.
, 百拇医药
19 Wakita T, Moradpour D, Tokushige K, et al. Specific inhibition of hepatitis C virus core antigen production by antisense RNA constructs. Hepatology, 1995, 22:330A.
20 Sakamoto N, Wu CH, Wu GY, et al. Intracellular inhibition of HCV protein synthesis by hammerhead ribosome expression vector. Hepatology, 1996, 24:357A.
(收稿：1996-09-03 修回：1997-04-20), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院感染疾病科
关键词：
中华传染病杂志980421 全长的丙型肝炎病毒(HCV)基因组约9.4kb,5′非翻译区(5′UTR)仅占其中极少的一部分，约 324～341个bp。对该区的结构分析提示，HCV 5′UTR可能参与HCV的复制和表达调控。业已发现，5′UTR具有启动病毒多蛋白翻译的重要功能[1]，其一级及二级结构似乎均十分保守[2]。HCV 5′UTR的这些结构和功能特点，使之广泛用于HCV的基因诊断和基因治疗。
一、在基因诊断中的应用
随着对HCV基因组编码区结构了解的加深，用于HCV抗体检测的免疫学诊断方法日臻完善，不断有新一代的ELISA和RIBA试剂盒诞生。但是，由于血清中HCV滴度低，检测HCV RNA仍然是目前检测HCV最主要的手段。所有检测HCV RNA的方法几乎均与HCV 5′UTR结构密切相关。
, 百拇医药
(一)用于定性诊断 HCV RNA的定性诊断大致可分为两类，即PCR和杂交试验。PCR为其主要方法，已广泛应用于临床血清标本的常规检测。所采用的引物几乎全来源于HCV 5′UTR序列，理由是该区在HCV基因组结构中最为保守，可以最大限度地避免对HCV所有型别和变异株的漏检。有文献报道，除了C区引物外，用HCV基因组其它区引物所做PCR的检出率，均明显低于5′UTR引物[3]。即使如此，比较了基因库中众多的HCV 5′UTR序列后发现，在这一极为保守的区域内仍有两个变异较多的区域[4]。显然，用于检测HCV RNA的引物应避开所有这些易变异的部位。同时也应避免使用与瘟病毒属病毒高度同源区的引物，以防止因可能存在其它的人瘟病毒属病毒样致病因子所引起的交叉反应[5]。目前，HCV RNA检测中存在的最大问题在于，国内外用于检测HCV RNA的PCR引物均由各公司及研究者自行设计，尽管普遍采用了5′UTR引物，但引物序列多不相同，即所获得的扩增产物的长度和在5′UTR中的相应位置均不相同，因而彼此间检测结果差异较大。欧洲病毒性肝炎专家组曾将22份HCV RNA阳性及阴性标准血清分送到世界各地的31个实验室，结果显示，仅有10个(32%)实验室检测结果完全正确，有11个(35%)实验室未能检出经过稀释的弱阳性标本，还有10个实验室的检测结果完全错误[6]。分析其原因，除了RNA提取方法和操作中的污染等因素外，采用了不同的5′UTR引物可能是其主要原因。为了保证检测的敏感性和可比性，从引物角度对HCV RNA的PCR诊断试剂进行标化无疑是十分重要的。
, 百拇医药
HCV RNA杂交试验也多采用5′UTR做为标记样针[7，8]。但其应用受到HCV滴度低的限制，仅在组织标本检查等少数情况下使用。
(二)用于定量诊断 定量检测HCV RNA的方法有多种，但以竞争PCR法和分枝DNA(bDNA)检测法最为常见。前者需首先制备作为标准对照的HCV RNA或cDNA，如采用定点突变、体外转录内部形成EcoRI酶切位点的5′UTR RNA[9]，或者通过删除突变、合成内部缺少106个核苷酸的5′UTR cDNA[10]，然后采用上述的5′UTR区引物，在加入待测样品和标准对照的同一反应体系中比较两者扩增产物的相对含量。由于标准对照含量已知，因而可以推算出待测样品中的HCV RNA含量。竞争PCR法所能检出的HCV RNA最低含量为每毫升血清104～109.5个拷贝。由于该方法可以在常规的HCV RNA检测基础上进行，使用起来十分方便。bDNA检测法则是把捕捉HCV RNA的合成探针包被在固相载体上，当样品中的HCV RNA与之结合后，再用能结合酶类的分枝状DNA进行杂交，最后加入底物显色。用于捕捉和与酶结合的分枝状探针均针对HCV 5′UTR及部分C区序列[11]。bDNA法的敏感性低于PCR法，约为每毫升350 000mol。
, http://www.100md.com
(三)用于分型诊断
与编码区相比，5′UTR的变异十分有限。并且，研究发现这些变异并非随机发生。Ohba[12]采用毗邻连接方法建立了HCV 5′UTR核苷酸序列的种系发生树结构，该结构提示，按5′UTR可将HCV分为7个主要的基因型。归纳起来，目前依照5′UTR进行HCV基因分型的方法有三种。(1) 直接测序：即将所测得的HCV 5′UTR核苷酸序列与已知型别的HCV序列相比较，得出该序列HCV的基因型。O'brten[13] 采用这种方法，对64份HCV RNA阳性患者血清检测表明，存在3个型和5个亚型。(2)限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)：是根据HCV各型及亚型的序列特点，采用不同内切酶消化，从而得出不同长度酶切片段的分型方法。以5′UTR序列为基础，用这种方法可将HCV分为6个型和6个亚型，与其它编码区分型有良好的一致性[14，15]。(3)线探针分型法(LiPA)：是一种逆转录杂交方法，即首先逆转录扩增出HCV 5′UTR片段，然后用平行固定在膜上的5′UTR寡核苷酸探针与之杂交，因其结果为相互平行的线状条带而命名之。 Stuyver[16]用该方法在61份HCV RNA阳性血清中分出了4个型和4个亚型。
, 百拇医药
如上所述，5′UTR是目前全球检测HCV RNA的通用区域。因而，采用5′UTR进行HCV基因分型，无疑是十分简便的。此外，各HCV型及亚型在该区的差异相对较少，减少了实际工作中 的难度。更为重要的是，这些与HCV基因分型戚戚相关的核苷酸变异均位于该区的-170至-155和-132至-117两个区域，并呈现共突变特性[5]，提示这些变异与HCV RNA二极结构的形成有关。在人工模拟的HCV RNA二级结构中，这两个变异区也恰好位于对HCV RNA有效启动病毒多蛋白翻译至关重要的结构域Ⅲ[1]。因此，采用5′UTR进行HCV基因分型，可能更具有进化和生物学意义。值得指出，5′UTR所能区别的HCV基因型毕竟有限，仅适合在以下情况使用。(1)初步分型。(2)已大致明确HCV基因型分布的地域。(3)与HCV编码区分型配合使用。
二、在基因治疗中的应用
借助基因治疗进行抗HCV的研究报道尚不多见，其根本原因在于缺乏理想的敏感细胞系和容易获得的动物模型。最近，随着对HCV基因组各区功能的了解，尤其是HCV 5′UTR翻译启动功能的阐明，这一领域的工作才骤然活跃起来。作为基因治疗的靶区首推5′UTR。Wakita[17]用包含HCV 5′UTR、C区和E区的cDNA片段插入到质粒PUC 19，构成表达载体，继之， 在体外转录为RNA，作为体外翻译的模板。与此同时，作者合成了27个正义和反义脱氧寡核苷酸(Oligo)，这些Oligo分别针对HCV 5′UTR及毗邻启始密码AUG的C区。在体外翻译之前，将它们分别与HCV RNA模板相混合。结果发现，互补于5′UTR 38～65、134～175、312～339位和C区341～327位的Oligo能够有效地阻断C、E区蛋白的表达，其余正、反义Oligo均无此作用。这种阻断作用的机制可能是抑制了核糖体5′UTR中的内部核糖体进入位点(IRES)的结合或者妨碍了其它与核糖体复合物形成有关的RNA结合蛋白的结合。在细胞水平，如果将上述4种反义Oligo直接加入到细胞培养液中，却未观察到与体外翻译类似的作用。只有将它们与脱唾液酸糖蛋白混合，借助靶细胞膜表面的脱唾液酸糖蛋白受体导入细胞才显示出明显的封闭作用[18]。
, 百拇医药
采用反义RNA抗HCV的研究也已见诸报道。有人[19]将针对HCV 5′UTR及部分C区的反义RNA与上述类似的HCV表达载体混合，进行体外翻译。发现反义RNA对HCV RNA的翻译抑制率大于90%，两者共转染肝癌细胞系Huh-7后，抑制率也达到50%，为构建反义的逆转录病毒或腺病毒载体进行抗HCV转基因治疗奠定了基础。Sakamoto[20]则合成了两个针对5′UTR和一个针对C区的锤头状Ribozyme。尽管这些Ribozyme在细胞外均可定点切割HCV RNA，但只有针对5′UTR中翻译启始密码上游的一个Ribozyme具有明显地抑制HCV RNA表达的作用。最近，Lieber[21]又构建了多个腺病毒Ribozyme表达载体，剪切靶区选择在HCV正链或负链的5′UTR和C区。用这些重组病毒感染能够稳定表达HCV RNA的CHO细胞和丙型肝炎患者的肝组织培养细胞后发现，HCV RNA的含量较对照明显减少。并且，无论是将几种针对不同剪切位点的Ri-bozyme重组病毒混合使用抑或将它们串联在一个载体感染靶细胞，均可使其抑制HCV RNA的作用明显加强，表明针对HCV不同链和不同位点的Ribozyme具有协同作用。由于HCV具有多基因型和易发生变异的特点，这种多靶位Ribozyme引入策略，可能更有利于提高Ribozyme剪切靶RNA效率，防止Ribozyme抗性病毒株的产生。从理论个讲，Ribozyme与反义寡核酸的不同点在于，除能结合靶基因外，还可以特异性地剪切靶基因，具有更高的抗病毒效率，但前提是Ribozyme必须始终保持其对剪切至关重要的酶活性中心的二级结构，同时要求被Ribozyme作用的靶位在靶基因表面有良好的暴露。借助病毒载体将Ribozyme导入靶细胞则要考虑其表达的强度和时相。所有这些环节都还有待进一步加以研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Tsukiyama-Kohara K, Liauka N, Kohara H, et al. Internal Ribosome entry site within hepatitis C virus RNA. J Virol, 1992, 66:1476-1483.
2 Brown EA, Zhang H, Ping LH, et al. Secondary structure of the 5′nontranslated region of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs. Nucleic Acids Res, 1992, 20:5041-5045.
3 Okamoto H, Okada S, Sugivama Y, et al. The 5′-terminal sequence of the hepatitis C virus genome. Jpn J Exp Med, 1990, 60:167-177.
, 百拇医药
4 Kleter GE, van Doorn LJ, Browwer JT, et al. Sequences analysis of the 5′untranslated region in isolates of at least four genotypes of hepatitis C virus in the nether lands. J Clin Microbiol, 1994, 32:306-310.
5 Houghton MA, Weiner A, Han J, et al. Molecular biology of the hepatitis C virus: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology, 1991,14: 381-388.
6 Zaaijer HL, Cuypers HT, Reesink HW, et al. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet, 1993, 341: 722-724.
, 百拇医药
7 Hu KQ, Yu CH, Vierling JM. Direct detection of circulating hepatitis C virus RNA using probes from the 5′untranslated region. J Clin Invest, 1992, 89:2040-2045.
8 Lau JYN, Davis GL. Detection of hepatitis C virus RNA
genome in liver tissue by nonisotopic in site hybridization. J Med Virol, 1994, 42:268-271.
9 Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al. Quantitation of hepatitis C virus RNA in serum of asymptomatic blood donors and patients with type C chronic liver disease. Hepatology, 1993, 17:545-550.
, http://www.100md.com
10 Kaneko S, Murakami S, Unoura M, et al. Quantitation of hepatitis C virus RNA by competitive polymerase chain reaction. J Med Virol, 1992, 37:278-282.
11 Vrdea MS. Synthesis and characterization of branch DNA
(bDNA) for the direct and quantititative detection of CMV. HBV, HCV and HIV. Clin Chem, 1993, 39:725-726.
12 Ohba K, Mizokami M, Ohno T, et al. Classification of hepatitis C virus into major types and subtypes based on molecular evolutionary analysis. Virus Res, 1995, 36:201-214.
, 百拇医药
13 O'Briev CB, Henzel B, Wolfe. DNA sequencing of 5′-UTR to determing genotypes in patients with chronic HCV. Hepatology, 1995, 22:359A.
14 Murphy D, Willems B, Delage G. Use of the 5′noncoding region for genotyping hepatitis C virus. J Infect Dis, 1994, 169:473-475.
15 Davidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5′non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204.
, http://www.100md.com
16 Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J Gen Virol, 1993, 74:1093-1102.
17 Wakita T, Wang JR. Specific inhibition of hepatitis C virus expression by antisense oligodeoxynucleotides. J Biol Chem, 1994, 269:14205-14210.
18 Wu CH, Siddigui A, Wu GY. Target inhibition of HCV promoter activity using HCV specific antisense DNA. Hepatology, 1995, 22:330A.
, 百拇医药
19 Wakita T, Moradpour D, Tokushige K, et al. Specific inhibition of hepatitis C virus core antigen production by antisense RNA constructs. Hepatology, 1995, 22:330A.
20 Sakamoto N, Wu CH, Wu GY, et al. Intracellular inhibition of HCV protein synthesis by hammerhead ribosome expression vector. Hepatology, 1996, 24:357A.
(收稿：1996-09-03 修回：1997-04-20), 百拇医药