佛山市庚型肝炎病毒检测和部分基因序列分析
作者：罗红涛 钟锐兴 吕凌 傅涌水 张瑞娴 许炜
单位：528000 广东省佛山市第一人民医院(罗红涛、钟锐兴、张瑞娴、许炜)；中山医科大学分子医学中心(吕凌、傅涌水)
关键词：肝炎病毒，庚型；克隆，分子；序列分析
中华传染病杂志980408 【摘要】 目的 了解佛山庚型肝炎病毒(HGV)感染状况，分析HGV非结构基因(NS)3区部分核苷酸序列。方法 采用逆转录聚合酶链反应检测血清HGV RNA，对一例肝炎患者的HGV(HGVC-FS)NS3区818bp片段作克隆及序列分析。结果 80例非甲-戊型肝炎患者和105例静脉吸毒者HGV RNA检出率分别为6.3%(5/80)和23.8%(25/105),HGV C-FSNS3区片段核苷酸序列与HGV-U44402、U45966、U36380及HGV C964相同区段同源性为85.5%、85.6%、88.0%、89.2%。结论 佛山存在HGV感染，静脉吸毒者感染率较高，HGV可能不是非甲-戊型肝炎主要致病因素。HGV C-FS与HGV C964同源性最高。
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Detection of hepatitis G virus infection and sequencing its partial gene in Foshan district Luo Hongtao,Zhong Ruixing,Lu Ling,et al. The first people′s Hospitol of Foshan,Foshan 528000
【Abstract】 Objective To investigate the HGV infection in Foshan and analyse partial nucleotide sequence of the putative nonstructural 3 (NS3) region of HGV (HGVC-FS) isolated form a patient with post-transfusion non-A-E hepatitis in Foshan.Methods HGV RNA in the sera of 80 patients with non-A-E hepatitis and 105 intravenous drug abusers (IVDU) was detected by reverse transcription polymerase chain reaction.A 818bp fragment from NS3 region of HGV isolated from the serum of a patient with post-transfusion non-A-E hepatitis was cloned and sequenced.After molecular cloning,it was sequenced by Sanger′s method and compared with those of the HGVU44402 U45966 U36380 reported in America and HGVC964 reported in China.Results The positive rates of HGV RNA in 80 patients with non-A-E hepatitis and 105 IVDUs were 6.3%(5/80) and 23.8%(25/105) respectively.The nucleotide homology between HGVC-FS and HGVU44402,U45966,U36380,HGVC964 were 85.5%,85.6%,88.0% and 89.2% respectively.Conclusion There are hepatitis G virus infection in Foshan district.The infection rate was higher in IVDU.HGV may be not the dominate pathogen of non-A-E hepatitis.HGVC-FS is highest homologous to HGVC964.
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【Key words】 Hepatitis G virus Cloning,Molecular Sequence analysis
近年来，约有10%～20%病毒性肝炎的甲-戊5型肝炎病毒标志均为阴性，提示存在新的肝炎病毒。1995年美国Kim等[1]首先报道发现HGV，1996年Linnen等[2]报道了HGV基因全序列，我国亦迅速开展了对HGV的研究。为了解本地区HGV感染状况及分子生物学特征，我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对本地区80例非甲-戊型肝炎患者及105例静脉吸毒者血清标本进行HGV RNA检测，并对其中一例输血后非甲-戊型肝炎患者的HGV NS3区片段进行分子克隆与核苷酸序列测定。
材料与方法
一、标本来源
1995年8月～1996年12月在本科住院的非甲-戊型肝炎患者血清80份及1996年8月～1996年12月佛山市戒毒所提供的静脉吸毒者血清105份，全部-70℃保存。
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二、检测试剂
AMV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶Taq I，EcoRV购自Promega公司，Klenow酶及T4 DNA连接酶为Boehringer Mannheim公司产品。质粒pUC19和宿主菌E.coli DH5α由中山医科大学分子医学中心提供，QIAamp Viral RNA Kit购自QIAGEN公司。
三、引物
随机引物购自BRL公司。HGV引物：经Internet查Genbank获得三株美国报道的HGV全序列，其Accession number为U44402，U45966，U36380，以DNA SIS 7.21版本软件进行同源性比较，选完全相同序列设计引物，然后委托GIBCO/BRL公司人工合成，其序列和位置见附表。G1/G2为外引物，G3/G4为内引物，G1-G4扩增5′非翻译区(5′-UTR)238bp片段，G5/G6扩增NS3区818bp片段。
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附表 HGV引物表 引物名称
核苷酸
位置*
极性
序列(5′-3′)
G1
112-136
+
5′-GGTGGACGGGTGATGACAGGGTTGG-3′
G2
452-476
-
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5′-GGAGCTGGGTGGCCCCATGCATTTC-3′
G3
161-185
+
5′-GGTAGCCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
G4
376-398
-
5′-CACTGGTCCTTGTGAACTCGCCT-3′
G5
4536-4554
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+
5′-GAGGTGACCCTTGATCCCA-3′
G6
5336-5354
-
5′-ACCGCATCTGTCACTGTCT-3′
* 以HGVU44402为准
四、RT-PCR
用QIAamp Viral RNA Kit提取血清中总RNA，加入随机引物，以AMV逆转录酶逆转录为cDNA，取2μl cDNA加入含G1 G2的PCR-1系统中，进行第一次PCR，取2μl PCR-1产物加入含G3 G4的PCR-2系统中(PCR-1与PCR-2系统的体积和成分除引物外均相同)，进行第二次PCR，扩增5′UTR片段。条件均为：94℃50秒，57℃40秒，72℃60秒，循环30次。取10μl PCR产物在含溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量对照，在紫外灯下观察结果。对5′UTR HGV RNA阳性的1例输血后非甲-戊型肝炎患者血清用引物G5/G6进行NS3区片段扩增，方法同上。
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五、PCR产物克隆
取上述NS3区PCR产物纯化后，以Klenow酶补平末端，经低溶点琼脂糖电泳回收，然后与用SmaI酶切的载体pUC19共沉淀，水溶后加入T4 DNA连接酶进行连接，连接物转化感受态E.coli DH 5α，然后在含IPTG/X-gal的LBA平板上筛选白色菌落作PCR和限制性内切酶酶切鉴定。
六、核苷酸序列测定
选取阳性克隆，用碱裂解法提取质粒DNA，PEG 8000沉淀纯化，采用通用引物，以ABI 377A型全自动测序仪采用双脱氧链末端终止法对克隆的目的基因进行正反双向测序，采用DNA SIS 7.21软件与国内外代表株进行同源性比较。结果
一、HGV RNA检测
用5′UTR引物作RT-PCR检测80例非甲-戊型肝炎患者血清，5例在238bp处出现明亮条带，阳性率6.3%(5/80)。检测105例静脉吸毒者血清，25例阳性，阳性率23.6%(25/105)。1例输血后非甲-戊型肝炎患者血清用NS3区引物作RT-PCR，扩增出818bp片段，结果见图1。
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1.SPPI/EcoR I分子量标准；2.NS3区扩增产物；3.5′UTR扩增产物；4.阴性对照；5.5′UTR扩增产物；6.PCR分子量标准；(pBR322被6种内切酶消化产物)
图1 PCR产物电泳
二、克隆鉴定
用G5/G6作PCR筛选阳性克隆，用EcoR V酶切得一线性质粒。用Taq I酶切得1444bp、760bp、730bp、476bp、73bp 5个片段，用1.8%的琼脂糖电泳，73bp片段条带较模糊，730bp与760bp重叠，只能观察到四条带，和计算机推导结果一致，见图2。
三、核苷酸序列测定及同源性比较
佛山株HGV(HGVC-FS)NS3区818bp片段核苷酸序列与美国报道的HGVU44402、HGV U45966、HGV U36380及周育森等[3]报道的中国株HGVC964相应区段比较，同源性分别为：85.5%,85.6%,88.0%,89.2%。
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1.PBR322/Hinf I分子量标准；2.重组体经EcoR V酶切；3.重组体经Taq I酶切；4.SPPI/EcoR I分子量标准
图2 重组质粒酶切鉴定
讨论
HGV与GBV-C同属黄病毒科[4，5]，为单股正链RNA病毒：基因全长约9300bp，5′端及3′端各有一个非翻译区，中间有一个长开放读码框，分为结构蛋白编码区及非结构蛋白编码区。据已有资料分析，黄病毒5′UTR及NS3区保守性均较好，变异相对较小，可用于设计PCR引物。我们在5′UTR设计两对引物，用RT-PCR法检测80例非甲-戊型肝炎患者和105例静脉吸毒者血清，HGV RNA阳性率分别为6.3%和23.6%，再在NS3区设计一对引物，对一例5′UTR HGV RNA阳性的输血后非甲-戊型肝炎患者血清进行RT-PCR扩增，把获取的HGV NS3区818bp片段进行分子克隆及核苷酸序列分析，并与美国报道HGV U44402、HGV U45966、HGV U36389及中国株HGV C964核苷酸序列相应区段比较，同源性分别为85.5%，85.6%,88.0%,89.2%，表明佛山株HGV与上述四株HGV同属一种病毒，本地区存在HGV感染。静脉吸毒者感染率较高，而非甲-戊型肝炎患者感染率较低，说明HGV可能不是非甲-戊型肝炎的主要致病因素。
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佛山株HGV NS3区片段与上述四株HGV相应区段的核苷酸序列比较，结果佛山株HGV与中国株HGV C964同源性最高，与美国报道的HGV同源性相比偏低，提示采用HGV C964基因序列设计引物，可提高本地区HGV感染的检出率。与HGV C964比较，佛山株HGV出现一些变异，其变异随机分布在不同位点上，说明中国不同区域的HGV株差异虽较小，但亦存在一些变异，这对于本地区HGV感染的基因诊断，分子流行病学调查，传染源追踪及变异的研究有重要意义。
本课题受广东省自然科学基金重点资助(9622032-02)
参考文献
1 Kim JP,Linnen J,Wages J,et al.Hepatitis G virus (HGV),a new hepatitis virus associated with human hepatitis.J Hepatol,1995,23(Suppl 1):78.
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2 Linnen J,Wages J,Zhang-Keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion transmissible agent.Science,1996,271:505-508.
3 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学院院刊，1996，20：249-254.
4 Simons JN,Leary TP,Dawson GJ,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nat Med,1995,1:564-569.
5 Leary TP,Muerhoff AS,Simon JN,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.J Med Virol,1996,48:60-67.
(收稿：1997-05-28 修回：1998-05-19), http://www.100md.com
单位：528000 广东省佛山市第一人民医院(罗红涛、钟锐兴、张瑞娴、许炜)；中山医科大学分子医学中心(吕凌、傅涌水)
关键词：肝炎病毒，庚型；克隆，分子；序列分析
中华传染病杂志980408 【摘要】 目的 了解佛山庚型肝炎病毒(HGV)感染状况，分析HGV非结构基因(NS)3区部分核苷酸序列。方法 采用逆转录聚合酶链反应检测血清HGV RNA，对一例肝炎患者的HGV(HGVC-FS)NS3区818bp片段作克隆及序列分析。结果 80例非甲-戊型肝炎患者和105例静脉吸毒者HGV RNA检出率分别为6.3%(5/80)和23.8%(25/105),HGV C-FSNS3区片段核苷酸序列与HGV-U44402、U45966、U36380及HGV C964相同区段同源性为85.5%、85.6%、88.0%、89.2%。结论 佛山存在HGV感染，静脉吸毒者感染率较高，HGV可能不是非甲-戊型肝炎主要致病因素。HGV C-FS与HGV C964同源性最高。
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Detection of hepatitis G virus infection and sequencing its partial gene in Foshan district Luo Hongtao,Zhong Ruixing,Lu Ling,et al. The first people′s Hospitol of Foshan,Foshan 528000
【Abstract】 Objective To investigate the HGV infection in Foshan and analyse partial nucleotide sequence of the putative nonstructural 3 (NS3) region of HGV (HGVC-FS) isolated form a patient with post-transfusion non-A-E hepatitis in Foshan.Methods HGV RNA in the sera of 80 patients with non-A-E hepatitis and 105 intravenous drug abusers (IVDU) was detected by reverse transcription polymerase chain reaction.A 818bp fragment from NS3 region of HGV isolated from the serum of a patient with post-transfusion non-A-E hepatitis was cloned and sequenced.After molecular cloning,it was sequenced by Sanger′s method and compared with those of the HGVU44402 U45966 U36380 reported in America and HGVC964 reported in China.Results The positive rates of HGV RNA in 80 patients with non-A-E hepatitis and 105 IVDUs were 6.3%(5/80) and 23.8%(25/105) respectively.The nucleotide homology between HGVC-FS and HGVU44402,U45966,U36380,HGVC964 were 85.5%,85.6%,88.0% and 89.2% respectively.Conclusion There are hepatitis G virus infection in Foshan district.The infection rate was higher in IVDU.HGV may be not the dominate pathogen of non-A-E hepatitis.HGVC-FS is highest homologous to HGVC964.
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【Key words】 Hepatitis G virus Cloning,Molecular Sequence analysis
近年来，约有10%～20%病毒性肝炎的甲-戊5型肝炎病毒标志均为阴性，提示存在新的肝炎病毒。1995年美国Kim等[1]首先报道发现HGV，1996年Linnen等[2]报道了HGV基因全序列，我国亦迅速开展了对HGV的研究。为了解本地区HGV感染状况及分子生物学特征，我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对本地区80例非甲-戊型肝炎患者及105例静脉吸毒者血清标本进行HGV RNA检测，并对其中一例输血后非甲-戊型肝炎患者的HGV NS3区片段进行分子克隆与核苷酸序列测定。
材料与方法
一、标本来源
1995年8月～1996年12月在本科住院的非甲-戊型肝炎患者血清80份及1996年8月～1996年12月佛山市戒毒所提供的静脉吸毒者血清105份，全部-70℃保存。
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二、检测试剂
AMV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶Taq I，EcoRV购自Promega公司，Klenow酶及T4 DNA连接酶为Boehringer Mannheim公司产品。质粒pUC19和宿主菌E.coli DH5α由中山医科大学分子医学中心提供，QIAamp Viral RNA Kit购自QIAGEN公司。
三、引物
随机引物购自BRL公司。HGV引物：经Internet查Genbank获得三株美国报道的HGV全序列，其Accession number为U44402，U45966，U36380，以DNA SIS 7.21版本软件进行同源性比较，选完全相同序列设计引物，然后委托GIBCO/BRL公司人工合成，其序列和位置见附表。G1/G2为外引物，G3/G4为内引物，G1-G4扩增5′非翻译区(5′-UTR)238bp片段，G5/G6扩增NS3区818bp片段。
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附表 HGV引物表 引物名称
核苷酸
位置*
极性
序列(5′-3′)
G1
112-136
+
5′-GGTGGACGGGTGATGACAGGGTTGG-3′
G2
452-476
-
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5′-GGAGCTGGGTGGCCCCATGCATTTC-3′
G3
161-185
+
5′-GGTAGCCACTATAGGTGGGTCTTAA-3′
G4
376-398
-
5′-CACTGGTCCTTGTGAACTCGCCT-3′
G5
4536-4554
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5′-GAGGTGACCCTTGATCCCA-3′
G6
5336-5354
-
5′-ACCGCATCTGTCACTGTCT-3′
* 以HGVU44402为准
四、RT-PCR
用QIAamp Viral RNA Kit提取血清中总RNA，加入随机引物，以AMV逆转录酶逆转录为cDNA，取2μl cDNA加入含G1 G2的PCR-1系统中，进行第一次PCR，取2μl PCR-1产物加入含G3 G4的PCR-2系统中(PCR-1与PCR-2系统的体积和成分除引物外均相同)，进行第二次PCR，扩增5′UTR片段。条件均为：94℃50秒，57℃40秒，72℃60秒，循环30次。取10μl PCR产物在含溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量对照，在紫外灯下观察结果。对5′UTR HGV RNA阳性的1例输血后非甲-戊型肝炎患者血清用引物G5/G6进行NS3区片段扩增，方法同上。
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五、PCR产物克隆
取上述NS3区PCR产物纯化后，以Klenow酶补平末端，经低溶点琼脂糖电泳回收，然后与用SmaI酶切的载体pUC19共沉淀，水溶后加入T4 DNA连接酶进行连接，连接物转化感受态E.coli DH 5α，然后在含IPTG/X-gal的LBA平板上筛选白色菌落作PCR和限制性内切酶酶切鉴定。
六、核苷酸序列测定
选取阳性克隆，用碱裂解法提取质粒DNA，PEG 8000沉淀纯化，采用通用引物，以ABI 377A型全自动测序仪采用双脱氧链末端终止法对克隆的目的基因进行正反双向测序，采用DNA SIS 7.21软件与国内外代表株进行同源性比较。结果
一、HGV RNA检测
用5′UTR引物作RT-PCR检测80例非甲-戊型肝炎患者血清，5例在238bp处出现明亮条带，阳性率6.3%(5/80)。检测105例静脉吸毒者血清，25例阳性，阳性率23.6%(25/105)。1例输血后非甲-戊型肝炎患者血清用NS3区引物作RT-PCR，扩增出818bp片段，结果见图1。
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1.SPPI/EcoR I分子量标准；2.NS3区扩增产物；3.5′UTR扩增产物；4.阴性对照；5.5′UTR扩增产物；6.PCR分子量标准；(pBR322被6种内切酶消化产物)
图1 PCR产物电泳
二、克隆鉴定
用G5/G6作PCR筛选阳性克隆，用EcoR V酶切得一线性质粒。用Taq I酶切得1444bp、760bp、730bp、476bp、73bp 5个片段，用1.8%的琼脂糖电泳，73bp片段条带较模糊，730bp与760bp重叠，只能观察到四条带，和计算机推导结果一致，见图2。
三、核苷酸序列测定及同源性比较
佛山株HGV(HGVC-FS)NS3区818bp片段核苷酸序列与美国报道的HGVU44402、HGV U45966、HGV U36380及周育森等[3]报道的中国株HGVC964相应区段比较，同源性分别为：85.5%,85.6%,88.0%,89.2%。
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1.PBR322/Hinf I分子量标准；2.重组体经EcoR V酶切；3.重组体经Taq I酶切；4.SPPI/EcoR I分子量标准
图2 重组质粒酶切鉴定
讨论
HGV与GBV-C同属黄病毒科[4，5]，为单股正链RNA病毒：基因全长约9300bp，5′端及3′端各有一个非翻译区，中间有一个长开放读码框，分为结构蛋白编码区及非结构蛋白编码区。据已有资料分析，黄病毒5′UTR及NS3区保守性均较好，变异相对较小，可用于设计PCR引物。我们在5′UTR设计两对引物，用RT-PCR法检测80例非甲-戊型肝炎患者和105例静脉吸毒者血清，HGV RNA阳性率分别为6.3%和23.6%，再在NS3区设计一对引物，对一例5′UTR HGV RNA阳性的输血后非甲-戊型肝炎患者血清进行RT-PCR扩增，把获取的HGV NS3区818bp片段进行分子克隆及核苷酸序列分析，并与美国报道HGV U44402、HGV U45966、HGV U36389及中国株HGV C964核苷酸序列相应区段比较，同源性分别为85.5%，85.6%,88.0%,89.2%，表明佛山株HGV与上述四株HGV同属一种病毒，本地区存在HGV感染。静脉吸毒者感染率较高，而非甲-戊型肝炎患者感染率较低，说明HGV可能不是非甲-戊型肝炎的主要致病因素。
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佛山株HGV NS3区片段与上述四株HGV相应区段的核苷酸序列比较，结果佛山株HGV与中国株HGV C964同源性最高，与美国报道的HGV同源性相比偏低，提示采用HGV C964基因序列设计引物，可提高本地区HGV感染的检出率。与HGV C964比较，佛山株HGV出现一些变异，其变异随机分布在不同位点上，说明中国不同区域的HGV株差异虽较小，但亦存在一些变异，这对于本地区HGV感染的基因诊断，分子流行病学调查，传染源追踪及变异的研究有重要意义。
本课题受广东省自然科学基金重点资助(9622032-02)
参考文献
1 Kim JP,Linnen J,Wages J,et al.Hepatitis G virus (HGV),a new hepatitis virus associated with human hepatitis.J Hepatol,1995,23(Suppl 1):78.
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2 Linnen J,Wages J,Zhang-Keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion transmissible agent.Science,1996,271:505-508.
3 周育森，陈薇，赵秋敏，等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事医学院院刊，1996，20：249-254.
4 Simons JN,Leary TP,Dawson GJ,et al.Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis.Nat Med,1995,1:564-569.
5 Leary TP,Muerhoff AS,Simon JN,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.J Med Virol,1996,48:60-67.
(收稿：1997-05-28 修回：1998-05-19), http://www.100md.com