乙型肝炎病毒核心区基因免疫小鼠细胞免疫应答研究
作者：邓涛 武珊珊 陈天宝 姚鹏 张晓红 陈乃玲 贾克明
单位：100700 北京军区总医院解放军肝病研究所
关键词：肝炎病毒，乙型；基因，免疫应答
中华传染病杂志980407 【摘要】 目的 观察小鼠对HBV核心区基因疫苗的免疫应答。方法 将经过基因修饰的乙型肝炎病毒核心区基因定向克隆于真核表达载体(pcDNA3)，构建成HBV核心区基因疫苗(pcDNA-HBV)，给Balb/c小鼠多点肌肉注射，2周后追加免疫一次，用竞争抑制酶联法及MTT法检测小鼠血清抗-HBc及脾细胞对HBcAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2周后小鼠血清抗-HBc均阳性，持续12周以上，脾细胞对HBcAg的刺激指数明显高于对照组(P<0.05)。结论 pcDNA-HBV在Balb/c小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答。
, http://www.100md.com The immune response in Balb/c mice immunized with hepatitis B virus core DNA-based vaccine Deng Tao,Wu Shanshan,Cheng Tianbao,et al. Institute of Liver Diseases,PLA,Beijing 100700
【Abstract】 Objective To study immune response in mice against the HBV core DNA-based vaccine.Methods The modificated HBc gene with its stem and loopstructure was inserted into the eukaryotic expression vector (pcDNA-HBV).The Balb/c mice were immunized by multiple sites intramuscular injection with pcDNA-HBV and pcDNA3 respectively.Each mouse was boosted after 2 weeks.The anti-HBc Ab was detected by ELISA,meanwhile,the stimulation index of spleencytes to HBcAg were measured by MTT method.Results The anti-HBc in mice immunized with pcDNA-HBV became and maintained to be positive for at least 12 weeks.The stimulation index of spleencytes to HBcAg were significantly higher than that of mice injected with pcDNA3.Conclusion The investigation demonstrated that pcDNA-HBV could generated humoral and cellular immune response in Balb/c mice.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Virus Gene,immune response
慢性乙型病毒性肝炎患者HBV难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫功能障碍，尤其是针对HBV主要靶抗原即核心抗原(HBcAg)的特异性细胞毒T细胞(CTL)功能低下[1]。基因免疫是近几年发展起来的新的生物技术，不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫应答。这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要意义，而且对慢性病毒感染具有治疗作用[2～5]。为了探求慢性乙型肝炎(乙肝)防治新策略，我们在原实验基础上对HBV核心区基因疫苗的细胞免疫应答进行了实验研究。
材料和方法
一、pcDNA-HBV的构建及鉴定
从含HBV(ayw型)核心基因片断的原核表达质粒pUC19(中国预防医学科学院病毒研究所詹美云教授赠)经BamHI及HindⅢ双酶切，电泳回收其中1kb的含有ATG和TAG的核心基因片段，定向克隆于已预先用HindⅢ和BamHI双酶消化好的真核表达载体pcDNA3的CMV启动子下游，称之为pcDNA-HBV。经HindⅢ和BamHI双酶切电泳分析鉴定，并通过PCR检测构建的pcDNA-HBV中有无HBV核心区基因片断，PCR试剂盒购自美国Biogene公司。
, http://www.100md.com
二、pcDNA-HBV大量制备
pcDNA-HBV质粒转化工程菌JM109，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，按碱裂解方法提取质粒，通过紫外分光光度计测定其浓度，按1μg/μl溶于无菌PBS，-20℃储存备用。
三、基因免疫接种
选用4～6周龄的Balb/c小鼠，用1ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，每只总量100μg，2周后追加免疫一次。实验中分别设实验组(注射pcDNA-HBV、n=5)及对照组(注射空载pcDNA3、n=4)组。
四、T细胞抗原特异性增殖反应测定
免疫4周后，制备小鼠脾细胞悬液，细胞浓度为1×106/ml，加入96孔板，每孔100μl，平行三孔，分别加入HBcAg5μg/孔及1∶300植物血凝素(PHA)，37℃、5%CO2，温育72小时，加四甲基偶氮唑盐(MTT)10μl，37℃、6小时，加盐酸异丙醇100μl，混匀，静置15分钟，测各孔A570值，计算增殖指数。增殖指数=实验组A值/对照组A值。
, 百拇医药
五、血清抗体检测
采用竞争抑制酶联免疫试验动态观测小鼠血清抗-HBc变化，试剂盒购自珠海亚利公司，按试剂盒说明检测，抑制率>50%为阳性，<50%为阴性。
结果
一、pcDNA-HBV的构建及鉴定
真核表达载体pcDNA3带有巨细胞病毒启动子(PCMV)和poly A序列，可保证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。插入的HBc基因已通过基因修饰，将位于核心基因起始信号上游障碍其表达的环茎状结构(约30bp)剪切掉，再化学合成一段包含起始信号的人工接头与其拼接，继而被定向克隆于pcDNA3 CMV启动子的下游，称其为pcDNA3 HBV。将pcDNA HBV用HindⅢ和BamHI双酶切，可获得5.4kb及1kb两条带，而pcDNA3双酶切分析仅见5.4kb的一条带，证明1kb的HBc基因已被插入。为进一步证明其特异性，将pcDNA3 HBV通过PCR检测HBV核心区基因，结果显示可获得一510bp的HBc条带，而空载pcDNA则无此条带，pcDNA HBV结构图及鉴定见文献[6]。
, 百拇医药
二、T细胞抗原特异性增殖反应结果
附表 小鼠脾细胞对HBcAg的增殖反应指数 组别
只数
HBcAg
HBcAg+PHA
pcDNA-HBV
5
1.532
1.651
pcDNA对照组
5
0.991
, 百拇医药
1.181
P值
<0.05
<0.05
三、小鼠血清抗-HBc-IgG检测结果
追加免疫1周后基因免疫组(n=5)均出现了抗-HBc抗体，其抑制率的动态改变见图1，而空载质粒pcDNA3对照组(n=5)及未经免疫的正常鼠(n=5)血清抗-HBc抗体均阴性。
No.1,No.2,No.3,No.4,No.5为免疫鼠编号，Normal为对照组
图1 小鼠血清抗-HBc抗体动态水平
, 百拇医药
讨论
许多实验证明慢性乙肝患者HBV难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫功能低下，尤其是针对HBV主要靶抗原(HBcAg)的特异性细胞毒性T细胞功能低下。基因免疫既可诱导机体体液免疫应答，又可诱导机体细胞免疫应答，这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要作用，而且对慢性病毒感染具有治疗作用。Tokushige、Wang等[4，7]已分别进行了HCV、HIV核心区基因免疫实验研究，并在小鼠体内获得了特异性的细胞及体液免疫应答。为了探求慢性乙肝新的免疫治疗措施，此前作者已构建了HBV核心区基因疫苗，并在Balb/c小鼠体内获得了体液免疫应答，本实验在此基础上进行了细胞免疫应答研究。结果显示pcDNA-HBV免疫组小鼠脾细胞对HBcAg的增殖反应指数明显高于对照组，提示pcDNA-HBV在Balb/c小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答，与Kuh
ber研究结果类似。而且，Kuhber等[8]还研究发现单用HBcAg不能诱导细胞免疫应答，而用表达HBcAg的质粒免疫小鼠则可获得MHCI限制的特异性的CTL应答，并认为这种特异性的CTL应答对慢性病毒感染具有治疗作用，是一种新的有希望的免疫治疗策略。
, 百拇医药
基因免疫的抗原加工及呈递过程可能存在以下三种途径：(1) 肌纤维细胞被质粒DNA转染，表达的抗原蛋白在肌纤维细胞内被加工后形成小分子抗原多肽，继而与肌纤维细胞内的MHC-I分子结合，激活T淋巴细胞。肌纤维丰富而独特的T小管系统有助于质粒DNA的吸收；(2) 肌肉组织中的抗原呈递细胞如树突状细胞(dendritic cells)在免疫接种过程中可能被质粒DNA转染而进行抗原呈递；(3) 抗原蛋白从肌细胞分泌出来后，被树突状细胞吞噬处理，然后与MHC-Ⅱ分子结合，激活T细胞、B细胞，进而诱导机体细胞及体液免疫应答，但HBcAg不能从细胞内分泌至细胞外，这可能是HBV核心区基因免疫体液免疫应答较弱的原因之一[2，3]。
本课题受国家自然科学基金资助(39770660)
参考文献
1 Lohr H,Weber W.Schlaak J,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
, 百拇医药
2 邓涛，陈乃玲，贾克明.病毒核酸疫苗的研究现状.国外医学病毒学分册，1996，3：88-92.
3 Michel ML,Davis H,Schleef M,et al.DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice:Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans.Pro Natl Acad Sci USA,1995,92:5307-5311.
4 Tokushige K,Wakita T,Pachul C,et al.Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs.Hepatology,1996,24:14-20.
, 百拇医药
5 Davis HL,Schirmbeck R,Reimann J,et al.DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lympho-cyte response to the hepatitis B envelope protein.Human Gene Therapy,1995,6:1447-1456.
6 邓涛，陈乃玲，陈天宝，等.乙肝病毒核心区基因免疫小鼠初步研究.中国公共卫生学报，1998，17：13-14.
7 Wang B,Ugen KE,Srickantan V,et al.Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1.Pro Natl Acad Sci USA,1993,90:4156-4160.
8 Kuhber A,Pudollek HP,Reifenberg K et al.DNA Immunization Induces Antibody and Cytotoxic T Cell Responses to Hepatitis B Core Antigen in H-2b Mice.J Immunology,1996,156:3687-3695.
(收稿：1997-10-20 修回：1998-05-19), 百拇医药
单位：100700 北京军区总医院解放军肝病研究所
关键词：肝炎病毒，乙型；基因，免疫应答
中华传染病杂志980407 【摘要】 目的 观察小鼠对HBV核心区基因疫苗的免疫应答。方法 将经过基因修饰的乙型肝炎病毒核心区基因定向克隆于真核表达载体(pcDNA3)，构建成HBV核心区基因疫苗(pcDNA-HBV)，给Balb/c小鼠多点肌肉注射，2周后追加免疫一次，用竞争抑制酶联法及MTT法检测小鼠血清抗-HBc及脾细胞对HBcAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2周后小鼠血清抗-HBc均阳性，持续12周以上，脾细胞对HBcAg的刺激指数明显高于对照组(P<0.05)。结论 pcDNA-HBV在Balb/c小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答。
, http://www.100md.com The immune response in Balb/c mice immunized with hepatitis B virus core DNA-based vaccine Deng Tao,Wu Shanshan,Cheng Tianbao,et al. Institute of Liver Diseases,PLA,Beijing 100700
【Abstract】 Objective To study immune response in mice against the HBV core DNA-based vaccine.Methods The modificated HBc gene with its stem and loopstructure was inserted into the eukaryotic expression vector (pcDNA-HBV).The Balb/c mice were immunized by multiple sites intramuscular injection with pcDNA-HBV and pcDNA3 respectively.Each mouse was boosted after 2 weeks.The anti-HBc Ab was detected by ELISA,meanwhile,the stimulation index of spleencytes to HBcAg were measured by MTT method.Results The anti-HBc in mice immunized with pcDNA-HBV became and maintained to be positive for at least 12 weeks.The stimulation index of spleencytes to HBcAg were significantly higher than that of mice injected with pcDNA3.Conclusion The investigation demonstrated that pcDNA-HBV could generated humoral and cellular immune response in Balb/c mice.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Virus Gene,immune response
慢性乙型病毒性肝炎患者HBV难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫功能障碍，尤其是针对HBV主要靶抗原即核心抗原(HBcAg)的特异性细胞毒T细胞(CTL)功能低下[1]。基因免疫是近几年发展起来的新的生物技术，不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫应答。这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要意义，而且对慢性病毒感染具有治疗作用[2～5]。为了探求慢性乙型肝炎(乙肝)防治新策略，我们在原实验基础上对HBV核心区基因疫苗的细胞免疫应答进行了实验研究。
材料和方法
一、pcDNA-HBV的构建及鉴定
从含HBV(ayw型)核心基因片断的原核表达质粒pUC19(中国预防医学科学院病毒研究所詹美云教授赠)经BamHI及HindⅢ双酶切，电泳回收其中1kb的含有ATG和TAG的核心基因片段，定向克隆于已预先用HindⅢ和BamHI双酶消化好的真核表达载体pcDNA3的CMV启动子下游，称之为pcDNA-HBV。经HindⅢ和BamHI双酶切电泳分析鉴定，并通过PCR检测构建的pcDNA-HBV中有无HBV核心区基因片断，PCR试剂盒购自美国Biogene公司。
, http://www.100md.com
二、pcDNA-HBV大量制备
pcDNA-HBV质粒转化工程菌JM109，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，按碱裂解方法提取质粒，通过紫外分光光度计测定其浓度，按1μg/μl溶于无菌PBS，-20℃储存备用。
三、基因免疫接种
选用4～6周龄的Balb/c小鼠，用1ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，每只总量100μg，2周后追加免疫一次。实验中分别设实验组(注射pcDNA-HBV、n=5)及对照组(注射空载pcDNA3、n=4)组。
四、T细胞抗原特异性增殖反应测定
免疫4周后，制备小鼠脾细胞悬液，细胞浓度为1×106/ml，加入96孔板，每孔100μl，平行三孔，分别加入HBcAg5μg/孔及1∶300植物血凝素(PHA)，37℃、5%CO2，温育72小时，加四甲基偶氮唑盐(MTT)10μl，37℃、6小时，加盐酸异丙醇100μl，混匀，静置15分钟，测各孔A570值，计算增殖指数。增殖指数=实验组A值/对照组A值。
, 百拇医药
五、血清抗体检测
采用竞争抑制酶联免疫试验动态观测小鼠血清抗-HBc变化，试剂盒购自珠海亚利公司，按试剂盒说明检测，抑制率>50%为阳性，<50%为阴性。
结果
一、pcDNA-HBV的构建及鉴定
真核表达载体pcDNA3带有巨细胞病毒启动子(PCMV)和poly A序列，可保证插入基因用自身起始密码在多种哺乳动物细胞内高效表达。插入的HBc基因已通过基因修饰，将位于核心基因起始信号上游障碍其表达的环茎状结构(约30bp)剪切掉，再化学合成一段包含起始信号的人工接头与其拼接，继而被定向克隆于pcDNA3 CMV启动子的下游，称其为pcDNA3 HBV。将pcDNA HBV用HindⅢ和BamHI双酶切，可获得5.4kb及1kb两条带，而pcDNA3双酶切分析仅见5.4kb的一条带，证明1kb的HBc基因已被插入。为进一步证明其特异性，将pcDNA3 HBV通过PCR检测HBV核心区基因，结果显示可获得一510bp的HBc条带，而空载pcDNA则无此条带，pcDNA HBV结构图及鉴定见文献[6]。
, 百拇医药
二、T细胞抗原特异性增殖反应结果
附表 小鼠脾细胞对HBcAg的增殖反应指数 组别
只数
HBcAg
HBcAg+PHA
pcDNA-HBV
5
1.532
1.651
pcDNA对照组
5
0.991
, 百拇医药
1.181
P值
<0.05
<0.05
三、小鼠血清抗-HBc-IgG检测结果
追加免疫1周后基因免疫组(n=5)均出现了抗-HBc抗体，其抑制率的动态改变见图1，而空载质粒pcDNA3对照组(n=5)及未经免疫的正常鼠(n=5)血清抗-HBc抗体均阴性。
No.1,No.2,No.3,No.4,No.5为免疫鼠编号，Normal为对照组
图1 小鼠血清抗-HBc抗体动态水平
, 百拇医药
讨论
许多实验证明慢性乙肝患者HBV难以清除的重要原因之一是机体细胞免疫功能低下，尤其是针对HBV主要靶抗原(HBcAg)的特异性细胞毒性T细胞功能低下。基因免疫既可诱导机体体液免疫应答，又可诱导机体细胞免疫应答，这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的病毒感染具有重要作用，而且对慢性病毒感染具有治疗作用。Tokushige、Wang等[4，7]已分别进行了HCV、HIV核心区基因免疫实验研究，并在小鼠体内获得了特异性的细胞及体液免疫应答。为了探求慢性乙肝新的免疫治疗措施，此前作者已构建了HBV核心区基因疫苗，并在Balb/c小鼠体内获得了体液免疫应答，本实验在此基础上进行了细胞免疫应答研究。结果显示pcDNA-HBV免疫组小鼠脾细胞对HBcAg的增殖反应指数明显高于对照组，提示pcDNA-HBV在Balb/c小鼠体内既可诱导体液免疫应答，又可诱导特异性的细胞免疫应答，与Kuh
ber研究结果类似。而且，Kuhber等[8]还研究发现单用HBcAg不能诱导细胞免疫应答，而用表达HBcAg的质粒免疫小鼠则可获得MHCI限制的特异性的CTL应答，并认为这种特异性的CTL应答对慢性病毒感染具有治疗作用，是一种新的有希望的免疫治疗策略。, 百拇医药
基因免疫的抗原加工及呈递过程可能存在以下三种途径：(1) 肌纤维细胞被质粒DNA转染，表达的抗原蛋白在肌纤维细胞内被加工后形成小分子抗原多肽，继而与肌纤维细胞内的MHC-I分子结合，激活T淋巴细胞。肌纤维丰富而独特的T小管系统有助于质粒DNA的吸收；(2) 肌肉组织中的抗原呈递细胞如树突状细胞(dendritic cells)在免疫接种过程中可能被质粒DNA转染而进行抗原呈递；(3) 抗原蛋白从肌细胞分泌出来后，被树突状细胞吞噬处理，然后与MHC-Ⅱ分子结合，激活T细胞、B细胞，进而诱导机体细胞及体液免疫应答，但HBcAg不能从细胞内分泌至细胞外，这可能是HBV核心区基因免疫体液免疫应答较弱的原因之一[2，3]。
本课题受国家自然科学基金资助(39770660)
参考文献
1 Lohr H,Weber W.Schlaak J,et al.Proliferative response of CD4+T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
, 百拇医药
2 邓涛，陈乃玲，贾克明.病毒核酸疫苗的研究现状.国外医学病毒学分册，1996，3：88-92.
3 Michel ML,Davis H,Schleef M,et al.DNA-mediated immunization to the hepatitis B surface antigen in mice:Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans.Pro Natl Acad Sci USA,1995,92:5307-5311.
4 Tokushige K,Wakita T,Pachul C,et al.Expression and immune response to hepatitis C virus core DNA-based vaccine constructs.Hepatology,1996,24:14-20.
, 百拇医药
5 Davis HL,Schirmbeck R,Reimann J,et al.DNA-mediated immunization in mice induces a potent MHC class I-restricted cytotoxic T lympho-cyte response to the hepatitis B envelope protein.Human Gene Therapy,1995,6:1447-1456.
6 邓涛，陈乃玲，陈天宝，等.乙肝病毒核心区基因免疫小鼠初步研究.中国公共卫生学报，1998，17：13-14.
7 Wang B,Ugen KE,Srickantan V,et al.Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1.Pro Natl Acad Sci USA,1993,90:4156-4160.
8 Kuh
ber A,Pudollek HP,Reifenberg K et al.DNA Immunization Induces Antibody and Cytotoxic T Cell Responses to Hepatitis B Core Antigen in H-2b Mice.J Immunology,1996,156:3687-3695.(收稿：1997-10-20 修回：1998-05-19), 百拇医药