深圳地区HIV-1流行毒株的env基因序列测定和亚型分析
作者：冯铁建 邵一鸣 李良成 苏玲 张顺祥 邢辉
单位：518020 深圳市卫生防疫站(冯铁建，李良成，张顺祥)；中国预防医学科学院(邵一鸣，苏玲，邢辉)
关键词：人类免疫缺陷病毒-1；基因变异；序列分析
中华传染病杂志980403 【摘要】 目的 了解深圳地区HIV-1各亚型毒株的流行情况和传播方式。方法 用套式-聚合酶链反应(nested-PCR)对5份在深圳市发现的HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)中的HIV-1膜蛋白基因进行扩增，并对C2-V3及其邻区350-450个核苷酸序列进行测定和分析。结果 5份样品中存在B和E两种亚型的HIV-1毒株序列，其中B亚型2份，彼此间的基因离散率为10.2%；E亚型3份，彼此间的基因离散率为2.7%。B亚型株与欧美B亚型毒株序列十分接近，E亚型株与泰国E亚型共享序列非常相似。结论 深圳地区HIV-1 B亚型为经性途径由境外传入，HIV-1 E亚型经血途径在静脉吸毒者及部分献血员中传播。
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Subtype and sequence analysis of the C2-V3 region of gp120 genes among HIV-1 strains in Shenzhen Feng Tiejian,Shao Yiming,Li Liangcheng,et al. Shenzhen Health and Anti-epidemic Station,Shenzhen 518020
【Abstract】 Objective To study the prevalence status and transmission patterns of various subtypes of HIV-1 in Shenzhen.Methods HIV-1 env gene was amplified by PCR from uncultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 5 HIV-1 seropositive infectors of Shenzhen in 1996.The C2-V3 region (about 450bp) of them was sequenced.Results There are two HIV-1 subtypes,B and E with 10.2% and 2.7% gene divergence inside each subtype.The 2 subtypes were closely related to the type B in Europe and America.Meanwhile,the 3 subtypes of E strains were most close to the international subtype E.Conclusion This study and epidemiology references showed that the subtype B was transmitted by sex and the subtype E was transmitted by drug users as well as blood donors in Shenzhen.
, 百拇医药
【Key words】 HIV-1 Gene variation Sequence analysis
HIV是一种逆转录病毒，由于其逆转录酶在HIV复制过程中缺乏“自身校正”作用；以及同型或不同型毒株HIV间重组导致HIV基因高度变异，且随流行时间的延长和变异程度的不断增大而产生新的亚型。根据HIV基因组中变异性最大的膜蛋白(env)基因核苷酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定的HIV亚型至少有十个即从A～I和O亚型。不同亚型的生物学特性、经不同途径或在不同人群中的传播效率有所差异，并具有一定的地区性分布特点[1～4]。
为了掌握我市HIV-1毒株在不同人群中流行传播情况，分析其变异特点和传染来源，我们于1996年采集部分HIV-1感染者血样，对其env基因C2-V3区序列进行测定和分析。
材料和方法
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一、标本来源
5例均为深圳市HIV-1抗体阳性者，每例采集静脉血3～5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗两遍后，加入0.5ml裂解缓冲液(0.1mmol Tris HCl,pH8.3,10mmol EDTA,10mmol NaCl,0.5% SDS,200μg/ml蛋白酶-K)混匀，55℃温育2小时后，95℃15分钟灭活蛋白酶-K。用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀物经真空干燥后，加入100μl无菌去离子水溶解，-20℃保存。
二、聚合酶链反应
按nested-PCR方法，设计合成多对PCR引物(表1)，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧引物，进行第一次PCR反应，条件为：95℃1分钟变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，30个循环；72℃10分钟。取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第二次PCR，扩增env基因C2-V3区。
, 百拇医药
表1 PCR引物序列 引 物
序 列(5′-3′)
在env基因中的定位
env-L
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
, 百拇医药
1536
env-C
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
三、PCR产物的纯化
, http://www.100md.com PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与分子量标准对照判断无误后，切下特异扩增带，用Qiaegen公司的Qiaex试剂，按说明提纯扩增的HIV-1 DNA片段。回收得的DNA溶于10mmol Tris-HCl,pH8.7，经琼脂糖凝胶电泳与分子量标准比较估算核酸浓度。
四、核苷酸序列测定
分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
五、序列分析
测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括：
, 百拇医药
(一) 用pileup程序对样品及国际标准序列的排列和比较；
(二) 用Pretty程序计算一组序列的共享序列(consensus sequence)；
(三) 用distances计算一组序列间的基因离散率；
(四) 用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)分析。结果
一、深圳地区HIV-1毒株核酸序列与国际标准毒株的比较
经nested-PCR扩增后，从5份HIV-1感染者PBMC样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段。将env-D3和env-f2引物测序结果进行编辑整理后，测得C2-V3及其相邻区的核苷酸序列。应用pileup和pretty程序进行有关排列和比较并计算出其共享序列(见附图)，根据序列特征，5个毒株可分为两组，第一组2个毒株(sz3、sz4)均来自性乱人员；第二组3个毒株，包括2名静脉吸毒者(sz2、sz5)和1名献血员(szld3)。
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二、深圳地区HIV-1毒株与A～E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较
将两组毒株核苷酸序列与国际A～E5个亚型的共享序列(Acon-Econ)及国内部分B亚型代表株核苷酸序列进行比较，计算彼此间的基因离散率(见表2)，结果发现第一组2个毒株与A、C、D和E亚型共享序列间的离散率均在22%以上，与主要代表欧美B亚型的Bcon间仅为7.5%，而与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率分别为11.1%，12.0%，12.2%，11.5%；第二组3个毒株与A、B、C、D国际亚型共享序列间和与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率均在24%以上，与主要代表泰国E亚型的Econ间仅为6.2%。
表2 深圳HIV-1各亚型毒株与A～E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较 亚型
基因离散率(
%)
, 百拇医药
本型内
Acon
B
Ccon
Dcon
Econ
con
yn-B
hub-B
hen-B
sc-B
B
10.2
, 百拇医药
22.5±0.1
7.5±0,7
11.1±0.3
12.0±0.9
12.2±0.2
11.5±0.2
22.9±1.9
22.6±0.6
24.7±3.1
E
2.7
24.1±1.7
, 百拇医药
24.5±1.1
24.4±1.1
25.2±0.8
27.1±0.9
25.4±0.8
27.6±1.8
30.7±1.9
6.2±1.6
注：序列基因离散率是用GCG程序计算C2-V3区第165～450核苷酸序列得到
附图 深圳地区HIV-1毒株的核酸序列及与国际标准毒株的比较
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三、深圳地区HVI-1流行毒株的系统树分析
系统树分析显示，第一组2个毒株与Bcon及YN-b、Hub-b、Hen-b、Sc-b等聚集在一起而远离其他国际亚型毒株序列；第二组3个毒株则与国际标准E亚型聚集在一起，但远离其他国际亚型毒株。
讨论
对5例HIV-1感染者PBMC中HIV-1 env C2-V3及其邻近区域序列进行分析比较后发现目前深圳至少存在B和E两种亚型的HIV-1毒株流行。根据流行病学资料，从感染时间上看，第一组两名欧美B亚型HIV-1感染者(sz3和sz4)的检出时间分别为3个月和62个月，二者间的基因散离率为10.2%，第二组3名E亚型感染者的检出时间约为3～5个月，彼此间的基因离散率为2.7%，其中2例静脉吸毒者间的核苷酸序列几乎完全相同。
从与国际及我国其他省份流行毒株比较结果看，深圳HIV-1 B亚型毒株与我国云南等地流行的属泰国B亚型毒株间的基因离散率较大，而与欧美B亚型毒株间关系密切。对毒株的gp120中最重要的中和抗体决定簇所在的V3环多肽序列进行比较也支持此结论，2个B亚型毒株均带有GPGG这一欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征，而不同于典型泰国B亚型V3环顶端所带有的GPGQ四肽序列特征[5～7]。E亚型毒株均为典型的泰国E亚型。
, 百拇医药
从感染者原籍地分布分析，5例感染者中仅1例(B亚型)为深圳居民，1992年在香港经性接触感染；另一例B亚型感染者为意大利人，1993年派驻中国工作，曾去过国内多个城市及马来西亚等东南亚国家，有复杂的性接触史。3名E亚型感染者均系外地流动人员，其中2名静脉吸毒者分别来自黑龙江省和陕西省，于1996年3～4月份因共用针具吸毒而感染；另一名为有职业献血史的河南人。根据以往的研究结果，E亚型毒株主要在性乱和静脉吸毒人群中流行[8～10]，我国献血员中流行的主要是B亚型HIV-1毒株，其次为C亚型，目前尚未有E亚型流行的报告，该献血员否认吸毒史、冶游史和重大疾病史，这是否预示着E亚型毒株已在我国部分地区的献血员中流行有待进一步调查。
我们的调查资料表明，欧美B亚型HIV-1毒株在较早以前即已通过性途径由归国人员和外国人传入我市。深圳因邻近HIV高流行区——泰国等东南亚国家，而泰国HIV-1的流行在经历了主要欧美B亚型向泰国B亚型的漂移后，近年又出现泰国E亚型在吸毒和性传播人群中流行的趋势，在我市吸毒的两名HIV-1型感染者全部为泰国E亚型，说明深圳吸毒人群中E亚型HIV-1流行株很可能是从泰国传入。
, 百拇医药
参考文献
1 Myers G, Korber S, Wain-Hobson RF,et al.Human Retroviruses and AIDS 1993.Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory;1993.
2 Weniger BG,Takebe Y,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia.AIDS,1994,8(suppl 2):S1-S14.
3 Janssons W.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa.AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:877-879.
, 百拇医药
4 邵一鸣，曾毅，陈筝，等.从云南艾滋病病毒(HIV)感染者分离HIV.中华流行病学杂志，1991，12：129-135.
5 邵一鸣，赵全壁，王斌，等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，4：291-299.
6 Shao YM,Zhao QB,Wang B,et al.Variation and shift of HIV-1 env gene found in IDUs of Dehong epidemic area in China.Tenth International Conference on AIDS,380A,Japan,1994,Aug.
7 邵一鸣，赵全壁，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，1：9-17.
, 百拇医药 8 Kalish ML,Baldwin A,Raktham S,et al.The evolving molecular epidemiology of HIV-1 envelope subtypes in IDU in Bangkok,Thailand:implications for HIV vaccine trials.AIDS,1995,9:851-857.
9 Wasi C,Herring B,Raktham S,et al.Determination of HIV-1 subtype in IDU in Bangkok,Thailand using peptide-binding enzyme immunoassay and heteroduplex mobility assay:evidence of increasing infection with HIV-1 subtype E.AIDS,1995,9:843-849.
10 Nerukar VR.HIV type I subtype E in commercial sex workers and IDU in southern Vietnam.AIDS Res Hum Retroviruses,1996,9:841-843.
(收稿：1997-07-15 修回：1998-02-12), 百拇医药
单位：518020 深圳市卫生防疫站(冯铁建，李良成，张顺祥)；中国预防医学科学院(邵一鸣，苏玲，邢辉)
关键词：人类免疫缺陷病毒-1；基因变异；序列分析
中华传染病杂志980403 【摘要】 目的 了解深圳地区HIV-1各亚型毒株的流行情况和传播方式。方法 用套式-聚合酶链反应(nested-PCR)对5份在深圳市发现的HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)中的HIV-1膜蛋白基因进行扩增，并对C2-V3及其邻区350-450个核苷酸序列进行测定和分析。结果 5份样品中存在B和E两种亚型的HIV-1毒株序列，其中B亚型2份，彼此间的基因离散率为10.2%；E亚型3份，彼此间的基因离散率为2.7%。B亚型株与欧美B亚型毒株序列十分接近，E亚型株与泰国E亚型共享序列非常相似。结论 深圳地区HIV-1 B亚型为经性途径由境外传入，HIV-1 E亚型经血途径在静脉吸毒者及部分献血员中传播。
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Subtype and sequence analysis of the C2-V3 region of gp120 genes among HIV-1 strains in Shenzhen Feng Tiejian,Shao Yiming,Li Liangcheng,et al. Shenzhen Health and Anti-epidemic Station,Shenzhen 518020
【Abstract】 Objective To study the prevalence status and transmission patterns of various subtypes of HIV-1 in Shenzhen.Methods HIV-1 env gene was amplified by PCR from uncultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 5 HIV-1 seropositive infectors of Shenzhen in 1996.The C2-V3 region (about 450bp) of them was sequenced.Results There are two HIV-1 subtypes,B and E with 10.2% and 2.7% gene divergence inside each subtype.The 2 subtypes were closely related to the type B in Europe and America.Meanwhile,the 3 subtypes of E strains were most close to the international subtype E.Conclusion This study and epidemiology references showed that the subtype B was transmitted by sex and the subtype E was transmitted by drug users as well as blood donors in Shenzhen.
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【Key words】 HIV-1 Gene variation Sequence analysis
HIV是一种逆转录病毒，由于其逆转录酶在HIV复制过程中缺乏“自身校正”作用；以及同型或不同型毒株HIV间重组导致HIV基因高度变异，且随流行时间的延长和变异程度的不断增大而产生新的亚型。根据HIV基因组中变异性最大的膜蛋白(env)基因核苷酸和氨基酸序列的同源性，目前已确定的HIV亚型至少有十个即从A～I和O亚型。不同亚型的生物学特性、经不同途径或在不同人群中的传播效率有所差异，并具有一定的地区性分布特点[1～4]。
为了掌握我市HIV-1毒株在不同人群中流行传播情况，分析其变异特点和传染来源，我们于1996年采集部分HIV-1感染者血样，对其env基因C2-V3区序列进行测定和分析。
材料和方法
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一、标本来源
5例均为深圳市HIV-1抗体阳性者，每例采集静脉血3～5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗两遍后，加入0.5ml裂解缓冲液(0.1mmol Tris HCl,pH8.3,10mmol EDTA,10mmol NaCl,0.5% SDS,200μg/ml蛋白酶-K)混匀，55℃温育2小时后，95℃15分钟灭活蛋白酶-K。用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀物经真空干燥后，加入100μl无菌去离子水溶解，-20℃保存。
二、聚合酶链反应
按nested-PCR方法，设计合成多对PCR引物(表1)，扩增HIV-1 env基因。以env-L/env-i为外侧引物，进行第一次PCR反应，条件为：95℃1分钟变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，30个循环；72℃10分钟。取十分之一PCR产物，以env-C/env-k为内侧引物，按上述条件进行第二次PCR，扩增env基因C2-V3区。
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表1 PCR引物序列 引 物
序 列(5′-3′)
在env基因中的定位
env-L
TGGGGTACCTGTGTGGAAA
192
env-i
TATCCCTGCCTAACTCTATT
2056
env-k
GCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC
, 百拇医药
1536
env-C
CCAATTCCCATACATTATTG
607
env-D3
CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG
782
env-f2
GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG
1109
三、PCR产物的纯化
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四、核苷酸序列测定
分别使用env-D3和env-f2为测序引物，以提纯的PCR产物为模板，用ABI公司荧光标记末端终止物循环测序试剂盒，在PE公司9600型PCR仪上进行测序反应，模板用量约1μg，引物用量为6pmol。反应产物经提纯后用自动DNA序列分析仪进行序列测定。
五、序列分析
测得的序列用SeqEd和DNA软件进行编辑校正，每个样品C2-V3区核苷酸的最终序列根据两个同向测序引物所测结果重叠校核后确定。序列的排列、比较和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司软件包完成，具体包括：
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(一) 用pileup程序对样品及国际标准序列的排列和比较；
(二) 用Pretty程序计算一组序列的共享序列(consensus sequence)；
(三) 用distances计算一组序列间的基因离散率；
(四) 用groutree程序做系统树(phylogenetic tree)分析。结果
一、深圳地区HIV-1毒株核酸序列与国际标准毒株的比较
经nested-PCR扩增后，从5份HIV-1感染者PBMC样品中获得可用于序列测定的HIV-1 env基因目的片段。将env-D3和env-f2引物测序结果进行编辑整理后，测得C2-V3及其相邻区的核苷酸序列。应用pileup和pretty程序进行有关排列和比较并计算出其共享序列(见附图)，根据序列特征，5个毒株可分为两组，第一组2个毒株(sz3、sz4)均来自性乱人员；第二组3个毒株，包括2名静脉吸毒者(sz2、sz5)和1名献血员(szld3)。
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二、深圳地区HIV-1毒株与A～E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较
将两组毒株核苷酸序列与国际A～E5个亚型的共享序列(Acon-Econ)及国内部分B亚型代表株核苷酸序列进行比较，计算彼此间的基因离散率(见表2)，结果发现第一组2个毒株与A、C、D和E亚型共享序列间的离散率均在22%以上，与主要代表欧美B亚型的Bcon间仅为7.5%，而与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率分别为11.1%，12.0%，12.2%，11.5%；第二组3个毒株与A、B、C、D国际亚型共享序列间和与属泰国B亚型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株间的离散率均在24%以上，与主要代表泰国E亚型的Econ间仅为6.2%。
表2 深圳HIV-1各亚型毒株与A～E国际亚型和部分参考毒株基因离散率比较 亚型
基因离散率(
%), 百拇医药
本型内
Acon
B
Ccon
Dcon
Econ
con
yn-B
hub-B
hen-B
sc-B
B
10.2
, 百拇医药
22.5±0.1
7.5±0,7
11.1±0.3
12.0±0.9
12.2±0.2
11.5±0.2
22.9±1.9
22.6±0.6
24.7±3.1
E
2.7
24.1±1.7
, 百拇医药
24.5±1.1
24.4±1.1
25.2±0.8
27.1±0.9
25.4±0.8
27.6±1.8
30.7±1.9
6.2±1.6
注：序列基因离散率是用GCG程序计算C2-V3区第165～450核苷酸序列得到
附图 深圳地区HIV-1毒株的核酸序列及与国际标准毒株的比较
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三、深圳地区HVI-1流行毒株的系统树分析
系统树分析显示，第一组2个毒株与Bcon及YN-b、Hub-b、Hen-b、Sc-b等聚集在一起而远离其他国际亚型毒株序列；第二组3个毒株则与国际标准E亚型聚集在一起，但远离其他国际亚型毒株。
讨论
对5例HIV-1感染者PBMC中HIV-1 env C2-V3及其邻近区域序列进行分析比较后发现目前深圳至少存在B和E两种亚型的HIV-1毒株流行。根据流行病学资料，从感染时间上看，第一组两名欧美B亚型HIV-1感染者(sz3和sz4)的检出时间分别为3个月和62个月，二者间的基因散离率为10.2%，第二组3名E亚型感染者的检出时间约为3～5个月，彼此间的基因离散率为2.7%，其中2例静脉吸毒者间的核苷酸序列几乎完全相同。
从与国际及我国其他省份流行毒株比较结果看，深圳HIV-1 B亚型毒株与我国云南等地流行的属泰国B亚型毒株间的基因离散率较大，而与欧美B亚型毒株间关系密切。对毒株的gp120中最重要的中和抗体决定簇所在的V3环多肽序列进行比较也支持此结论，2个B亚型毒株均带有GPGG这一欧美B亚型V3环顶端四肽序列特征，而不同于典型泰国B亚型V3环顶端所带有的GPGQ四肽序列特征[5～7]。E亚型毒株均为典型的泰国E亚型。
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从感染者原籍地分布分析，5例感染者中仅1例(B亚型)为深圳居民，1992年在香港经性接触感染；另一例B亚型感染者为意大利人，1993年派驻中国工作，曾去过国内多个城市及马来西亚等东南亚国家，有复杂的性接触史。3名E亚型感染者均系外地流动人员，其中2名静脉吸毒者分别来自黑龙江省和陕西省，于1996年3～4月份因共用针具吸毒而感染；另一名为有职业献血史的河南人。根据以往的研究结果，E亚型毒株主要在性乱和静脉吸毒人群中流行[8～10]，我国献血员中流行的主要是B亚型HIV-1毒株，其次为C亚型，目前尚未有E亚型流行的报告，该献血员否认吸毒史、冶游史和重大疾病史，这是否预示着E亚型毒株已在我国部分地区的献血员中流行有待进一步调查。
我们的调查资料表明，欧美B亚型HIV-1毒株在较早以前即已通过性途径由归国人员和外国人传入我市。深圳因邻近HIV高流行区——泰国等东南亚国家，而泰国HIV-1的流行在经历了主要欧美B亚型向泰国B亚型的漂移后，近年又出现泰国E亚型在吸毒和性传播人群中流行的趋势，在我市吸毒的两名HIV-1型感染者全部为泰国E亚型，说明深圳吸毒人群中E亚型HIV-1流行株很可能是从泰国传入。
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参考文献
1 Myers G, Korber S, Wain-Hobson RF,et al.Human Retroviruses and AIDS 1993.Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory;1993.
2 Weniger BG,Takebe Y,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia.AIDS,1994,8(suppl 2):S1-S14.
3 Janssons W.Genetic and phylogenetic analysis of env subtypes G and H in central Africa.AIDS Res Hum Retroviruses,1994,10:877-879.
, 百拇医药
4 邵一鸣，曾毅，陈筝，等.从云南艾滋病病毒(HIV)感染者分离HIV.中华流行病学杂志，1991，12：129-135.
5 邵一鸣，赵全壁，王斌，等.我国云南德宏地区HIV感染者HIV毒株膜蛋白基因的序列测定和分析.病毒学报，1994，4：291-299.
6 Shao YM,Zhao QB,Wang B,et al.Variation and shift of HIV-1 env gene found in IDUs of Dehong epidemic area in China.Tenth International Conference on AIDS,380A,Japan,1994,Aug.
7 邵一鸣，赵全壁，管永军.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，1：9-17.
, 百拇医药 8 Kalish ML,Baldwin A,Raktham S,et al.The evolving molecular epidemiology of HIV-1 envelope subtypes in IDU in Bangkok,Thailand:implications for HIV vaccine trials.AIDS,1995,9:851-857.
9 Wasi C,Herring B,Raktham S,et al.Determination of HIV-1 subtype in IDU in Bangkok,Thailand using peptide-binding enzyme immunoassay and heteroduplex mobility assay:evidence of increasing infection with HIV-1 subtype E.AIDS,1995,9:843-849.
10 Nerukar VR.HIV type I subtype E in commercial sex workers and IDU in southern Vietnam.AIDS Res Hum Retroviruses,1996,9:841-843.
(收稿：1997-07-15 修回：1998-02-12), 百拇医药