多重耐药大肠杆菌外膜屏障机制的研究
作者：张小林 汪复 朱德妹
单位：200040 上海医科大学华山医院抗生素研究所
关键词：大肠杆菌；抗药性；外膜蛋白
中华传染病杂志980401 【摘要】 目的 研究临床分离的多重耐药大肠杆菌耐药的外膜屏障机制。方法 用尿素-SDS-PAGE法对临床分离的大肠杆菌外膜孔蛋白进行分析，并用抽滤法测定大肠杆菌细胞内四环素浓度。结果 临床分离的多重耐药大肠杆菌R3、R4、R28、R30外膜孔蛋白中均缺失OmpF，R3、R30中同时缺失OmpC，R12缺失OmpA。敏感菌株中均不缺失OmpF，但敏感株S22缺失OmpA和OmpC。LM218(OmpF标准缺失株)、R28细胞中稳态四环素浓度分别为敏感株S36的80%和40%。结论 外膜通透性的改变是大肠杆菌产生多重耐药的机制之一。
The investigation of outer membrane barrier mechanism in multiple-antibiotic-resistant Escherichia coli Zhang Xiaolin,Wang Fu,Zhu Demei. Institute of Antibiotics,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To investigate the change of outer membrane permeability in multiple-antibiotic-resistant (Mar) strains of Escherichia coli.Methods The outer membrane proteins in clinical isolates of Escherichia coli were analyed using Urea-SDS-PAGE,and tetracycline concentration in bacterial cells were determined by filtration method.Results Mar strains of Escherichia coli R3,R4,R28 and R30 were OmpF-deficient,besides,R3 and R30 were also OmpC-deficient,and R12 was OmpA-deficient.However,all the susceptible strains were OmpF intact,while S22 were OmpA- and OmpC-deficient.In LM218 (OmpF-deficient strain) and R28,the steady concentration of tetracycline were 80% and 40% respectively of that in strain S36.Conclusion The change of outer membrane permeability in Mar strains of Escherichia coli plays an important role in multiple drug resistance.
, 百拇医药
【Key words】 Escherichia coli Drug resistance Outer membrane protein
大肠杆菌是引起临床感染最常见的革兰阴性杆菌，随着多重耐药菌株的日渐增多，治疗该菌引起的感染变得越来越困难。其耐药机制非常复杂，近年来的研究表明，大肠杆菌的外膜在耐药过程中起着重要作用[1，2]。大肠杆菌外膜对许多抗菌药物的通透性较低，形成一道天然屏障，阻碍抗菌药物进入细胞内发挥抗菌作用。然而，大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质(outer membrane proteins,Omps)，即孔蛋白(porin)，却对大多数水溶性的抗菌药物具有良好的通透性[3]。大肠杆菌外膜上的孔蛋白主要有OmpA、OmpF、OmpC。其中OmpF、OmpC，主要是OmpF与抗菌药物通透性有关[3，4]。显然，这些外膜孔蛋白的表达水平将影响细胞外膜抗菌药物的通透性与细菌的耐药性。我们对大肠杆菌多重耐药株和敏感株的外膜通透性进行了比较研究，现将结果报道如下。
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材料和方法
一、抗菌药物及试剂
氯霉素(Chl)、四环素(Tet)、哌拉西林(Pip)、庆大霉素(Gen)、诺氟沙星(Nor)、环丙沙星(Cip)(以上药品为卫生部药品生物制品检定所标准品)；N-十二酰肌氨酸钠(Sigma)；3H-四环素(0.77Ci/mmol DuPont)。
二、大肠杆菌标准株
大肠杆菌LM218(OmpF缺失株)由美国Tufts大学Levy SB博士赠送；大肠杆菌ATCC25922为药敏试验质控菌株。
三、最低抑菌浓度(MIC)测定
用琼脂稀释法测定抗菌药物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)，见表1。
, 百拇医药
表1 大肠杆菌耐药和敏感标准MIC(μg/ml)
抗 菌 药 物
Pip
Gen
Tet
Chl
Nor
Cip
耐 药
≥128
≥8
≥16
≥32
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≥16
≥4
敏 感
≤4
≤0.5
≤1
≤2
≤1
≤0.25
四、多重耐药株的选择标准
从上海医科大学华山医院1994～1995年临床分离株中挑选对氯霉素、四环素、哌拉西林、庆大霉素、氟喹诺酮类均耐药者为多重耐药株(R)，对上述药物均敏感者为敏感野生株(S)。
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五、大肠杆菌外膜蛋白的分离、纯化以及尿素-SDS-PAGE法
参照Cohen等[5]的方法加以改进。电泳积层胶含聚丙烯酰胺5.4%，分离胶含聚丙烯酰胺7%并含8mol/L尿素，以考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R250染色。
六、大肠杆菌细胞内四环素浓度测定
按McMurry等[6]的方法加以改进。大肠杆菌悬浮于50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0，含1mmol/LMgSO4和0.2%葡萄糖)中，使其OD530=40，加入3H-四环素，终浓度为5μmol/L。结果
一、大肠杆菌对6种抗菌药物的敏感性
, 百拇医药
见表2。
表2 选择菌株对6种抗菌药物的敏感性(MICμg/ml) 菌 株
抗 菌 药 物
Pip
Gen
Tet
Chl
Nor
Cip
LM218
0.5
0.125
, 百拇医药
1
4
0.06
0.016
ATCC25922
1
1
0.5
2
0.03
0.008
R3
≥256
, 百拇医药
≥16
≥32
≥64
≥32
≥8
R4
≥256
≥16
≥32
≥64
≥32
≥8
R12
, 百拇医药
≥256
≥16
≥32
≥64
≥32
≥8
R28
≥256
≥16
≥32
≥64
≥32
≥8
, http://www.100md.com
R30
≥256
≥16
≥32
≥64
≥32
≥8
S22
≤4
≤0.5
≤1
≤2
≤1
, 百拇医药 ≤0.25
S36
≤4
≤0.5
≤1
≤2
≤1
≤0.25
S47
≤4
≤0.5
≤1
≤2
, 百拇医药 ≤1
≤0.25
从大肠杆菌临床分离株中筛选出多重耐药株R3、R4、R12、R28、R30和敏感株S22、S36、S47。
二、大肠杆菌外膜蛋白的电泳分析
见图1，与敏感株及标准株LM218相比，临床分离的多重耐药株R3、R28、R30缺失OmpF，R3、R30同时缺失OmpC，但却出现了一条未知功能的蛋白带。
临床分离的多重耐药株R4、R28均缺失OmpF，但R12并不缺失OmpF，却缺失OmpA；敏感株S36及ATCC25922均具有OmpA、OmpF、OmpC，S22缺失OmpA及OmpC，见图2。
, 百拇医药
1.ATCC25922 2.S47 3.R3 4.R30 5.R28 6.LM218
图1 大肠杆菌外膜蛋白电泳分析
1.R28 2.R12 3.S22 4.R4 5.S36 6.ATCC25922
图2 大肠杆菌外膜蛋白电泳分析
三、四环素在大肠杆菌细胞内的浓度
见图3，在大肠杆菌悬液中加3H-四环素后约1分钟，大肠杆菌细胞中四环素浓度均达到稳态。LM218细胞内四环素稳态浓度约为临床分离敏感株S36的80%，多重耐药株R28的细胞内药物浓度大约为S36的40%。
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图3 四环素在大肠杆菌细胞内的浓度
讨论
抗菌药物必须通过大肠杆菌外膜才能进入细菌细胞内发挥抗菌作用。许多抗菌药物如β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、氨基糖苷类、亲水的氟喹诺酮类药物均主要通过大肠杆菌外膜孔蛋白(OmpF和OmpC，主要是OmpF)进入细胞内发挥抗菌作用[3，4]。因此，大肠杆菌外膜上这些孔蛋白表达水平的变化可对细菌耐药性产生影响。我们发现临床分离的大肠杆菌多重耐药株R3、R4、R28、R30均缺失OmpF，其中R3、R30同时缺失OmpC。这些孔蛋白的缺失使大肠杆菌外膜的通透性下降，抗菌药物难以进入细胞，是导致对这些抗菌药物的耐药机制之一。我们还发现敏感株S22的OmpA和OmpC均缺失，仅有OmpF，而其耐药性并未上升，说明OmpF在保持细菌外膜正常通透性中起着主要作用。但多重耐药株R12仅缺失OmpA，推测该菌株的耐药可能由其他机制所致，OmpA缺失的意义尚不清楚。
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我们测定了临床分离的大肠杆菌敏感株S36、多重耐药株R28以及标准OmpF缺失株LM218细胞内的四环素浓度。结果显示多重耐药株R28细胞内的四环素浓度为敏感株S36的40%，LM218为S36的80%，这与OmpF缺失引起对四环素通透性下降有关。R28中四环素稳态浓度明显低于LM218，表明可能尚有其他因素导致细胞内抗菌药物浓度下降。但是，细胞内抗菌药物浓度的改变与其MIC值的改变相差甚远(相差数倍甚至数十倍)。据报道，细菌细胞内抗菌药物浓度微小的变化就可能导致药物对细菌MIC的显著改变[8]。我们的结果亦是如此，但细菌细胞内抗菌药物浓度与MIC之间的确切关系尚不清楚。
在我们的实验中，两株多重耐药株在邻近OmpC处出现一条蛋白带。有的报道中也有某些多重耐药大肠杆菌近OmpC处出现一条附加蛋白带，并称之为Mrp(多重耐药相关蛋白)，其功能与mar表型有关[2]。我们发现的这一蛋白带是否为Mrp尚需进一步验证。
, 百拇医药 本课题为国家自然科学基金资助(39570832)
参考文献
1 Nikaido H.Prevention of drug access to bacterial targets:permeability barriers and active efflux.Science,1994,264:382-388.
2 Cohen SP,McMurry LM,Hooper DC,et al.Cross-resistance to fluroquinolones in multiple-antibiotic-resistant (Mar) Escherichia coli selected by tetracycline or chlorampheniol:decreased drug accumulation associate with membrane change in addition to OmpF reduction.Antimicrob Agents Chemother,1989,33:1318-1325.
, 百拇医药
3 张小林.大肠杆菌外膜屏障在耐药过程中的作用.临床荟萃，1996，11:392-394.
4 Nikaido H.Porins and specific channels of bacterial outer membrane.Mol Microbiol,1992,6:435-442.
5 Cohen SP,McMurry LM,Levy SB.MarA locus cause decreased expression of OmpF porin in multiple-antibiotic-resistant (Mar) mutants of Escherichia coli.J Bacteriol,1989,170:5416-5422.
6 McMurry LM,George AM,Levy SB.Active efflux of chlorampenicol in susceptible Escherichia coli strains and in multiple-antibiotic-resistant(Mar) mutants.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:542-546.
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7 Sugawara E,Nikaido H.OmpA protein of Escherichia coli outer membrane occurs in open and closed channel forms.J Bio Chem,1994,269:17981-17987.
8 Li XZ,Ma D,Livermore DM,et al.Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of pseudomonas aeruginosa:active efflux as a contributing factor to β-Lactams resistance.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:1742-1752.
(收稿：1998-03-19 修回：1998-07-15), 百拇医药
单位：200040 上海医科大学华山医院抗生素研究所
关键词：大肠杆菌；抗药性；外膜蛋白
中华传染病杂志980401 【摘要】 目的 研究临床分离的多重耐药大肠杆菌耐药的外膜屏障机制。方法 用尿素-SDS-PAGE法对临床分离的大肠杆菌外膜孔蛋白进行分析，并用抽滤法测定大肠杆菌细胞内四环素浓度。结果 临床分离的多重耐药大肠杆菌R3、R4、R28、R30外膜孔蛋白中均缺失OmpF，R3、R30中同时缺失OmpC，R12缺失OmpA。敏感菌株中均不缺失OmpF，但敏感株S22缺失OmpA和OmpC。LM218(OmpF标准缺失株)、R28细胞中稳态四环素浓度分别为敏感株S36的80%和40%。结论 外膜通透性的改变是大肠杆菌产生多重耐药的机制之一。
The investigation of outer membrane barrier mechanism in multiple-antibiotic-resistant Escherichia coli Zhang Xiaolin,Wang Fu,Zhu Demei. Institute of Antibiotics,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To investigate the change of outer membrane permeability in multiple-antibiotic-resistant (Mar) strains of Escherichia coli.Methods The outer membrane proteins in clinical isolates of Escherichia coli were analyed using Urea-SDS-PAGE,and tetracycline concentration in bacterial cells were determined by filtration method.Results Mar strains of Escherichia coli R3,R4,R28 and R30 were OmpF-deficient,besides,R3 and R30 were also OmpC-deficient,and R12 was OmpA-deficient.However,all the susceptible strains were OmpF intact,while S22 were OmpA- and OmpC-deficient.In LM218 (OmpF-deficient strain) and R28,the steady concentration of tetracycline were 80% and 40% respectively of that in strain S36.Conclusion The change of outer membrane permeability in Mar strains of Escherichia coli plays an important role in multiple drug resistance.
, 百拇医药
【Key words】 Escherichia coli Drug resistance Outer membrane protein
大肠杆菌是引起临床感染最常见的革兰阴性杆菌，随着多重耐药菌株的日渐增多，治疗该菌引起的感染变得越来越困难。其耐药机制非常复杂，近年来的研究表明，大肠杆菌的外膜在耐药过程中起着重要作用[1，2]。大肠杆菌外膜对许多抗菌药物的通透性较低，形成一道天然屏障，阻碍抗菌药物进入细胞内发挥抗菌作用。然而，大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质(outer membrane proteins,Omps)，即孔蛋白(porin)，却对大多数水溶性的抗菌药物具有良好的通透性[3]。大肠杆菌外膜上的孔蛋白主要有OmpA、OmpF、OmpC。其中OmpF、OmpC，主要是OmpF与抗菌药物通透性有关[3，4]。显然，这些外膜孔蛋白的表达水平将影响细胞外膜抗菌药物的通透性与细菌的耐药性。我们对大肠杆菌多重耐药株和敏感株的外膜通透性进行了比较研究，现将结果报道如下。
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材料和方法
一、抗菌药物及试剂
氯霉素(Chl)、四环素(Tet)、哌拉西林(Pip)、庆大霉素(Gen)、诺氟沙星(Nor)、环丙沙星(Cip)(以上药品为卫生部药品生物制品检定所标准品)；N-十二酰肌氨酸钠(Sigma)；3H-四环素(0.77Ci/mmol DuPont)。
二、大肠杆菌标准株
大肠杆菌LM218(OmpF缺失株)由美国Tufts大学Levy SB博士赠送；大肠杆菌ATCC25922为药敏试验质控菌株。
三、最低抑菌浓度(MIC)测定
用琼脂稀释法测定抗菌药物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)，见表1。
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表1 大肠杆菌耐药和敏感标准MIC(μg/ml)
抗 菌 药 物
Pip
Gen
Tet
Chl
Nor
Cip
耐 药
≥128
≥8
≥16
≥32
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≥16
≥4
敏 感
≤4
≤0.5
≤1
≤2
≤1
≤0.25
四、多重耐药株的选择标准
从上海医科大学华山医院1994～1995年临床分离株中挑选对氯霉素、四环素、哌拉西林、庆大霉素、氟喹诺酮类均耐药者为多重耐药株(R)，对上述药物均敏感者为敏感野生株(S)。
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五、大肠杆菌外膜蛋白的分离、纯化以及尿素-SDS-PAGE法
参照Cohen等[5]的方法加以改进。电泳积层胶含聚丙烯酰胺5.4%，分离胶含聚丙烯酰胺7%并含8mol/L尿素，以考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)R250染色。
六、大肠杆菌细胞内四环素浓度测定
按McMurry等[6]的方法加以改进。大肠杆菌悬浮于50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0，含1mmol/LMgSO4和0.2%葡萄糖)中，使其OD530=40，加入3H-四环素，终浓度为5μmol/L。结果
一、大肠杆菌对6种抗菌药物的敏感性
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见表2。
表2 选择菌株对6种抗菌药物的敏感性(MICμg/ml) 菌 株
抗 菌 药 物
Pip
Gen
Tet
Chl
Nor
Cip
LM218
0.5
0.125
, 百拇医药
1
4
0.06
0.016
ATCC25922
1
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0.5
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0.03
0.008
R3
≥256
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R4
≥256
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R12
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≥256
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R28
≥256
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R30
≥256
≥16
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S22
≤4
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S36
≤4
≤0.5
≤1
≤2
≤1
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S47
≤4
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≤1
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从大肠杆菌临床分离株中筛选出多重耐药株R3、R4、R12、R28、R30和敏感株S22、S36、S47。
二、大肠杆菌外膜蛋白的电泳分析
见图1，与敏感株及标准株LM218相比，临床分离的多重耐药株R3、R28、R30缺失OmpF，R3、R30同时缺失OmpC，但却出现了一条未知功能的蛋白带。
临床分离的多重耐药株R4、R28均缺失OmpF，但R12并不缺失OmpF，却缺失OmpA；敏感株S36及ATCC25922均具有OmpA、OmpF、OmpC，S22缺失OmpA及OmpC，见图2。
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1.ATCC25922 2.S47 3.R3 4.R30 5.R28 6.LM218
图1 大肠杆菌外膜蛋白电泳分析
1.R28 2.R12 3.S22 4.R4 5.S36 6.ATCC25922
图2 大肠杆菌外膜蛋白电泳分析
三、四环素在大肠杆菌细胞内的浓度
见图3，在大肠杆菌悬液中加3H-四环素后约1分钟，大肠杆菌细胞中四环素浓度均达到稳态。LM218细胞内四环素稳态浓度约为临床分离敏感株S36的80%，多重耐药株R28的细胞内药物浓度大约为S36的40%。
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图3 四环素在大肠杆菌细胞内的浓度
讨论
抗菌药物必须通过大肠杆菌外膜才能进入细菌细胞内发挥抗菌作用。许多抗菌药物如β-内酰胺类、四环素类、氯霉素、氨基糖苷类、亲水的氟喹诺酮类药物均主要通过大肠杆菌外膜孔蛋白(OmpF和OmpC，主要是OmpF)进入细胞内发挥抗菌作用[3，4]。因此，大肠杆菌外膜上这些孔蛋白表达水平的变化可对细菌耐药性产生影响。我们发现临床分离的大肠杆菌多重耐药株R3、R4、R28、R30均缺失OmpF，其中R3、R30同时缺失OmpC。这些孔蛋白的缺失使大肠杆菌外膜的通透性下降，抗菌药物难以进入细胞，是导致对这些抗菌药物的耐药机制之一。我们还发现敏感株S22的OmpA和OmpC均缺失，仅有OmpF，而其耐药性并未上升，说明OmpF在保持细菌外膜正常通透性中起着主要作用。但多重耐药株R12仅缺失OmpA，推测该菌株的耐药可能由其他机制所致，OmpA缺失的意义尚不清楚。
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我们测定了临床分离的大肠杆菌敏感株S36、多重耐药株R28以及标准OmpF缺失株LM218细胞内的四环素浓度。结果显示多重耐药株R28细胞内的四环素浓度为敏感株S36的40%，LM218为S36的80%，这与OmpF缺失引起对四环素通透性下降有关。R28中四环素稳态浓度明显低于LM218，表明可能尚有其他因素导致细胞内抗菌药物浓度下降。但是，细胞内抗菌药物浓度的改变与其MIC值的改变相差甚远(相差数倍甚至数十倍)。据报道，细菌细胞内抗菌药物浓度微小的变化就可能导致药物对细菌MIC的显著改变[8]。我们的结果亦是如此，但细菌细胞内抗菌药物浓度与MIC之间的确切关系尚不清楚。
在我们的实验中，两株多重耐药株在邻近OmpC处出现一条蛋白带。有的报道中也有某些多重耐药大肠杆菌近OmpC处出现一条附加蛋白带，并称之为Mrp(多重耐药相关蛋白)，其功能与mar表型有关[2]。我们发现的这一蛋白带是否为Mrp尚需进一步验证。
, 百拇医药 本课题为国家自然科学基金资助(39570832)
参考文献
1 Nikaido H.Prevention of drug access to bacterial targets:permeability barriers and active efflux.Science,1994,264:382-388.
2 Cohen SP,McMurry LM,Hooper DC,et al.Cross-resistance to fluroquinolones in multiple-antibiotic-resistant (Mar) Escherichia coli selected by tetracycline or chlorampheniol:decreased drug accumulation associate with membrane change in addition to OmpF reduction.Antimicrob Agents Chemother,1989,33:1318-1325.
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3 张小林.大肠杆菌外膜屏障在耐药过程中的作用.临床荟萃，1996，11:392-394.
4 Nikaido H.Porins and specific channels of bacterial outer membrane.Mol Microbiol,1992,6:435-442.
5 Cohen SP,McMurry LM,Levy SB.MarA locus cause decreased expression of OmpF porin in multiple-antibiotic-resistant (Mar) mutants of Escherichia coli.J Bacteriol,1989,170:5416-5422.
6 McMurry LM,George AM,Levy SB.Active efflux of chlorampenicol in susceptible Escherichia coli strains and in multiple-antibiotic-resistant(Mar) mutants.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:542-546.
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7 Sugawara E,Nikaido H.OmpA protein of Escherichia coli outer membrane occurs in open and closed channel forms.J Bio Chem,1994,269:17981-17987.
8 Li XZ,Ma D,Livermore DM,et al.Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of pseudomonas aeruginosa:active efflux as a contributing factor to β-Lactams resistance.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:1742-1752.
(收稿：1998-03-19 修回：1998-07-15), 百拇医药