人胰腺癌基质金属蛋白酶及其抑制因子基因mRNA表达
作者：龚涌灵△ 许国铭 李兆申 黄伟达▲
单位：
关键词：基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制因子；基因表达
第二军医大学学报980514 摘要 目的: 观察胰腺组织及其癌变标本中基质金属蛋白酶(MMPs)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)基因的表达，以探讨MMPs及TIMPs在肿瘤侵袭和转移过程中的作用。方法：采用cDNA探针(MMP2、MMP9、TIMP1)对两株胰腺癌细胞(PaTu8988、PaTu8902)、15例胰腺癌手术切除标本和8例正常胰腺组织标本进行Northern杂交。结果：胰腺癌组织和PaTu胰腺癌细胞MMP2、MMP9和TIMP1的基因表达水平明显高于正常胰腺组织，其趋势为：MMP2≈MMP9
中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human pancreatic cancer
Gong Yongling, Xu Guoming, Li Zhaoshen, Huang Weida (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To evaluate the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic tissue and pancreatic cancer specimens in order to explore the role of MMPs and TIMPs in the neoplastic transformation and invasiveness. Methods: Two pancreatic cancer cell lines (PaTu8988, PaTu8902), 15 cases of surgical pancreatic cancer specimens and 8 normal pancreatic tissue specimens were tested by Northern blot with cDNA probes (MMP2, MMP9 and TIMP1). Results: The expression of MMP2, MMP9 and TIMP1 genes in pancreatic cancer tissue and PaTu pancreatic cancer cell line was significantly higher than that in normal pancreatic tissue and its trend was MMP2≈MMP9
Key words matrix metalloproteinases; tissue inhibitors of metalloproteinases; gene expression
人胰腺癌早期出现侵袭和转移的生物学特性严重影响了胰腺癌临床治疗本可取得的效果，影响了胰腺癌患者生存率的提高[1]。细胞外基质(ECM)蛋白参与肿瘤的转移和侵袭过程[2]，影响肿瘤ECM蛋白降解代谢因素的研究已成为近年来的热点。基质金属蛋白酶(MMPs)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)在ECM的降解代谢中有重要作用[3]。MMPs和TIMPs的基因表达失衡，在大多数的肿瘤中，与其侵袭、转移有关[4]。本实验就胰腺组织及其癌变标本中MMPs及ITMPs mRNA表达的变化关系作些探讨。
1 材料和方法
1.1 试剂 小牛血清(FBS)、 DMEM培养基、 EDTA胰蛋白酶均购于上海华美生物制品公司； Taq酶、 α-32P-dATP(1.11×1014 Bq/mol)由复旦大学遗传所提供； 其他分子生物学实验材料均由复旦大学生命科学院生物化学系实验室提供。
, http://www.100md.com
1.2 细胞株 人胰腺癌细胞株PaTu8902和PaTu8988， 由德国Phillips大学分子生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。 细胞用含10% FBS和1%双抗的DMEM培养基， 在37℃， 5% CO2孵箱中进行培养。 扩增完全的癌细胞经纯化后， 经液氮冷冻， 贮存于-70℃冰箱供RNA分析用。
1.3 胰腺标本 正常胰腺标本为8例意外死亡者； 胰腺癌标本由长海医院普通外科提供。
1.4 探针的制备 所有cDNA探针均以质粒形式保存， 转化的宿主细胞为大肠杆菌XL1-blue菌株， 碱裂解法制备质粒DNA。 含MMP2(pH3a)、 MMP9(pHG-1)及TIMP1(ATCC59666)质粒， 由美国国家癌症研究中心WG Stetle-Stevenson博士提供。 多聚寡核苷酸引物， 由复旦大学生物化学系实验室用391型DNA合成仪(美国帕金-埃尔默公司制造)制备， 用α-32P-dATP进行延伸法PCR标记。
, 百拇医药
1.5 Northern杂交 异硫氰酸胍一步法抽提标本RNA， 每孔加样20 μg， 经变性琼脂糖凝胶电泳分离后转膜， 放入聚乙烯杂交袋中， 加入预杂交液： 20×SSPE (含氯化钠， 磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠盐)， 50%去离子甲酰胺， 100×Denhardt液(含聚蔗糖， 聚乙烯吡咯烷酮， 牛血清清蛋白)， 10% SDS， 变性鲑精DNA， 弃气泡， 置42℃水浴24 h； 加入32P标记的DNA探针(2.38～4.76)×106 Bq/μg， 42℃水浴继续杂交12 h以上。 洗膜： 用2×SSPE、 0.1% SDS， 42℃轻轻振动15 min 2次， 1×SSPE、 0.1% SDS， 42℃轻轻振动30 min， 0.1×SSPE、 0.1% SDS， 室温15 min 2次。 -70℃放射自显影1周。
1.6 结果分析 用VIDAS图像处理仪对胶片上每个放射自显影点定量灰度扫描， 将各点的灰度值换算为可用参数， 计算并比较mRNA表达量。
, 百拇医药
2 结 果
8例正常胰腺组织标本中均检测不出MMP2和MMP9在RNA水平的表达， 而有4例TIMP1有低水平(RNA相对含量约10%)表达(图1)。
图 1 正常胰腺组织与TIMP1探针的Northern杂交结果
Fig 1 Northern blotting of normal pancreatic
specimens using TIMP1 cDNA probe
15例胰腺癌组织标本和2株PaTu细胞中， 均有高水平的MMP2、 MMP9和TIMP1 RNA表达(图2显示部分结果)； RNA相对含量分别约为55%， 55%和80%， 明显高于正常胰腺组织。
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图 2 体外培养胰腺癌细胞和人胰腺癌组织Northern杂交结果
Fig 2 Northern blotting of pancreatic adenocarcinoma
tissue as well as two cell lines
A: MMP2; B:MMP9; 1: PaTu8988; 2: PaTu8902;
3～18： Pancreatic adenocarcinoma tissue
3 讨 论
MMPs是ECM成分分解代谢的关键酶，根据酶解底物的不同，可分为MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等数种。MMP1(间质酶)降解Ⅰ～Ⅲ型胶原；MMP3(基溶素)的酶谱较广，可降解糖原、层粘素、纤粘素、明胶和Ⅲ～Ⅴ型胶原[3]。MMP2(72 000，Ⅳ型胶原酶)和MMP9(92 000，Ⅳ型胶原酶)，主要降解Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶蛋白[5]。肿瘤发生、发展过程中的侵袭性和转移性是影响预后的重要因素，而MMPs是此过程中的限速酶，在中性pH环境中，几乎能分解所有的大分子蛋白。MMPs活性与肿瘤的侵袭和转移有关，其基因表达与肿瘤的转移性能成正比[6]。MMPs转录水平受许多生长因子和癌基因的调节，在蛋白水平则受TIMPs的调节。MMPs和TIMPs主要在ECM的微环境平衡中起作用，许多疾病过程都伴随着MMPs和TIMPs的失衡[7]。TIMP1、TIMP2可抑制激活的MMP1、MMP3与MMP2、MMP9酶原的结合体，因TIMP1对MMP9具有较高的亲和性而TIMP2对MMP2具有较高的亲和性。TIMPs可通过MMPs调控ECM蛋白的降解[8]。
, 百拇医药
本实验用Northern杂交显示：在RNA水平，大多数胰腺癌组织中有MMP2、MMP9和TIMP1的表达，与正常胰腺组织有明显区别。提示MMPs和TIMPs的异常表达与胰腺癌细胞的侵袭转移特征有密切联系，MMPs和TIMPs是胰腺癌侵袭和转移过程中值得重视的生物学标志。
参 考 文 献
1 孙 燕，周际昌 主编. 临床肿瘤内科手册. 第3版. 北京: 人民卫生出版社, 1996. 218
2 龚涌灵, 许国铭. 胰腺癌中细胞外基质蛋白的分子生物学意义. 国外医学*肿瘤分册，1997， 增刊,24(7): 270
3 Chen WT. Membrane proteinases: roles in tissue remodeling and tumor invasion. Curr Opin Cell Biol， 1992, 4(2):802
, 百拇医药
4 Muller D, Wolf C, Abecassis J, et al. Increased stromelysin 3 gene expression is associated with increased local invasiveness in head and neck squamous cell carcinomas. Cancer Res, 1993, 53(4):165
5 Mauch C, Krieg T, Bauer EA, et al. Role of the extracellular matrix in the degration of connective tissue. Arch Dermatol Res， 1994， 287(3):107
6 McDonnel S, Fingleton B. Role of matrix metalloproteinases in invasion and metastasis: biology, diagnosis and inhibitors. Cytotechnology， 1993,12(1-3): 367
, http://www.100md.com
7 Reynoids JJ, Hembry RM, Meikle ML, et al. Connective tissue degration in health and periodontal disease and roles of matrix metalloproteinases and their natural inhibitors. Adv Dent Res， 1994， 8(2): 312
8 Galis ZS, Sukhova GK, Libby P, et al. Microscopic localization of active proteinases by in situ zymography: detection of matrix metalloproteinase activity in vascular tissue. FASEB J, 1995, 9(10): 974
(1998-03-20收稿， 1998-07-21修回), 百拇医药
单位：
关键词：基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制因子；基因表达
第二军医大学学报980514 摘要 目的: 观察胰腺组织及其癌变标本中基质金属蛋白酶(MMPs)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)基因的表达，以探讨MMPs及TIMPs在肿瘤侵袭和转移过程中的作用。方法：采用cDNA探针(MMP2、MMP9、TIMP1)对两株胰腺癌细胞(PaTu8988、PaTu8902)、15例胰腺癌手术切除标本和8例正常胰腺组织标本进行Northern杂交。结果：胰腺癌组织和PaTu胰腺癌细胞MMP2、MMP9和TIMP1的基因表达水平明显高于正常胰腺组织，其趋势为：MMP2≈MMP9
中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human pancreatic cancer
Gong Yongling, Xu Guoming, Li Zhaoshen, Huang Weida (Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To evaluate the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic tissue and pancreatic cancer specimens in order to explore the role of MMPs and TIMPs in the neoplastic transformation and invasiveness. Methods: Two pancreatic cancer cell lines (PaTu8988, PaTu8902), 15 cases of surgical pancreatic cancer specimens and 8 normal pancreatic tissue specimens were tested by Northern blot with cDNA probes (MMP2, MMP9 and TIMP1). Results: The expression of MMP2, MMP9 and TIMP1 genes in pancreatic cancer tissue and PaTu pancreatic cancer cell line was significantly higher than that in normal pancreatic tissue and its trend was MMP2≈MMP9
Key words matrix metalloproteinases; tissue inhibitors of metalloproteinases; gene expression
人胰腺癌早期出现侵袭和转移的生物学特性严重影响了胰腺癌临床治疗本可取得的效果，影响了胰腺癌患者生存率的提高[1]。细胞外基质(ECM)蛋白参与肿瘤的转移和侵袭过程[2]，影响肿瘤ECM蛋白降解代谢因素的研究已成为近年来的热点。基质金属蛋白酶(MMPs)及金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)在ECM的降解代谢中有重要作用[3]。MMPs和TIMPs的基因表达失衡，在大多数的肿瘤中，与其侵袭、转移有关[4]。本实验就胰腺组织及其癌变标本中MMPs及ITMPs mRNA表达的变化关系作些探讨。
1 材料和方法
1.1 试剂 小牛血清(FBS)、 DMEM培养基、 EDTA胰蛋白酶均购于上海华美生物制品公司； Taq酶、 α-32P-dATP(1.11×1014 Bq/mol)由复旦大学遗传所提供； 其他分子生物学实验材料均由复旦大学生命科学院生物化学系实验室提供。
, http://www.100md.com
1.2 细胞株 人胰腺癌细胞株PaTu8902和PaTu8988， 由德国Phillips大学分子生物学和分子病理学研究所Elsasser博士惠赠。 细胞用含10% FBS和1%双抗的DMEM培养基， 在37℃， 5% CO2孵箱中进行培养。 扩增完全的癌细胞经纯化后， 经液氮冷冻， 贮存于-70℃冰箱供RNA分析用。
1.3 胰腺标本 正常胰腺标本为8例意外死亡者； 胰腺癌标本由长海医院普通外科提供。
1.4 探针的制备 所有cDNA探针均以质粒形式保存， 转化的宿主细胞为大肠杆菌XL1-blue菌株， 碱裂解法制备质粒DNA。 含MMP2(pH3a)、 MMP9(pHG-1)及TIMP1(ATCC59666)质粒， 由美国国家癌症研究中心WG Stetle-Stevenson博士提供。 多聚寡核苷酸引物， 由复旦大学生物化学系实验室用391型DNA合成仪(美国帕金-埃尔默公司制造)制备， 用α-32P-dATP进行延伸法PCR标记。
, 百拇医药
1.5 Northern杂交 异硫氰酸胍一步法抽提标本RNA， 每孔加样20 μg， 经变性琼脂糖凝胶电泳分离后转膜， 放入聚乙烯杂交袋中， 加入预杂交液： 20×SSPE (含氯化钠， 磷酸二氢钠和乙二胺四乙酸二钠盐)， 50%去离子甲酰胺， 100×Denhardt液(含聚蔗糖， 聚乙烯吡咯烷酮， 牛血清清蛋白)， 10% SDS， 变性鲑精DNA， 弃气泡， 置42℃水浴24 h； 加入32P标记的DNA探针(2.38～4.76)×106 Bq/μg， 42℃水浴继续杂交12 h以上。 洗膜： 用2×SSPE、 0.1% SDS， 42℃轻轻振动15 min 2次， 1×SSPE、 0.1% SDS， 42℃轻轻振动30 min， 0.1×SSPE、 0.1% SDS， 室温15 min 2次。 -70℃放射自显影1周。
1.6 结果分析 用VIDAS图像处理仪对胶片上每个放射自显影点定量灰度扫描， 将各点的灰度值换算为可用参数， 计算并比较mRNA表达量。
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2 结 果
8例正常胰腺组织标本中均检测不出MMP2和MMP9在RNA水平的表达， 而有4例TIMP1有低水平(RNA相对含量约10%)表达(图1)。
图 1 正常胰腺组织与TIMP1探针的Northern杂交结果
Fig 1 Northern blotting of normal pancreatic
specimens using TIMP1 cDNA probe
15例胰腺癌组织标本和2株PaTu细胞中， 均有高水平的MMP2、 MMP9和TIMP1 RNA表达(图2显示部分结果)； RNA相对含量分别约为55%， 55%和80%， 明显高于正常胰腺组织。
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图 2 体外培养胰腺癌细胞和人胰腺癌组织Northern杂交结果
Fig 2 Northern blotting of pancreatic adenocarcinoma
tissue as well as two cell lines
A: MMP2; B:MMP9; 1: PaTu8988; 2: PaTu8902;
3～18： Pancreatic adenocarcinoma tissue
3 讨 论
MMPs是ECM成分分解代谢的关键酶，根据酶解底物的不同，可分为MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等数种。MMP1(间质酶)降解Ⅰ～Ⅲ型胶原；MMP3(基溶素)的酶谱较广，可降解糖原、层粘素、纤粘素、明胶和Ⅲ～Ⅴ型胶原[3]。MMP2(72 000，Ⅳ型胶原酶)和MMP9(92 000，Ⅳ型胶原酶)，主要降解Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶蛋白[5]。肿瘤发生、发展过程中的侵袭性和转移性是影响预后的重要因素，而MMPs是此过程中的限速酶，在中性pH环境中，几乎能分解所有的大分子蛋白。MMPs活性与肿瘤的侵袭和转移有关，其基因表达与肿瘤的转移性能成正比[6]。MMPs转录水平受许多生长因子和癌基因的调节，在蛋白水平则受TIMPs的调节。MMPs和TIMPs主要在ECM的微环境平衡中起作用，许多疾病过程都伴随着MMPs和TIMPs的失衡[7]。TIMP1、TIMP2可抑制激活的MMP1、MMP3与MMP2、MMP9酶原的结合体，因TIMP1对MMP9具有较高的亲和性而TIMP2对MMP2具有较高的亲和性。TIMPs可通过MMPs调控ECM蛋白的降解[8]。
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本实验用Northern杂交显示：在RNA水平，大多数胰腺癌组织中有MMP2、MMP9和TIMP1的表达，与正常胰腺组织有明显区别。提示MMPs和TIMPs的异常表达与胰腺癌细胞的侵袭转移特征有密切联系，MMPs和TIMPs是胰腺癌侵袭和转移过程中值得重视的生物学标志。
参 考 文 献
1 孙 燕，周际昌 主编. 临床肿瘤内科手册. 第3版. 北京: 人民卫生出版社, 1996. 218
2 龚涌灵, 许国铭. 胰腺癌中细胞外基质蛋白的分子生物学意义. 国外医学*肿瘤分册，1997， 增刊,24(7): 270
3 Chen WT. Membrane proteinases: roles in tissue remodeling and tumor invasion. Curr Opin Cell Biol， 1992, 4(2):802
, 百拇医药
4 Muller D, Wolf C, Abecassis J, et al. Increased stromelysin 3 gene expression is associated with increased local invasiveness in head and neck squamous cell carcinomas. Cancer Res, 1993, 53(4):165
5 Mauch C, Krieg T, Bauer EA, et al. Role of the extracellular matrix in the degration of connective tissue. Arch Dermatol Res， 1994， 287(3):107
6 McDonnel S, Fingleton B. Role of matrix metalloproteinases in invasion and metastasis: biology, diagnosis and inhibitors. Cytotechnology， 1993,12(1-3): 367
, http://www.100md.com
7 Reynoids JJ, Hembry RM, Meikle ML, et al. Connective tissue degration in health and periodontal disease and roles of matrix metalloproteinases and their natural inhibitors. Adv Dent Res， 1994， 8(2): 312
8 Galis ZS, Sukhova GK, Libby P, et al. Microscopic localization of active proteinases by in situ zymography: detection of matrix metalloproteinase activity in vascular tissue. FASEB J, 1995, 9(10): 974
(1998-03-20收稿， 1998-07-21修回), 百拇医药