胰腺癌组织CD44v mRNA的表达
作者：方友文△ 许国铭 张洪富 李兆申
单位：第二军医大学长海医院消化内科，上海，200433 姚银珍，女，1964年2月生，主管护师
关键词：胰腺肿瘤；粘附分子；转移；预后
第二军医大学学报980512 摘要 目的：观察CD44拼接变异体(CD44v)mRNA在胰腺癌组织中的表达及其意义。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Southern杂交技术对7例正常胰腺组织及27例胰腺癌标本中的CD44v mRNA表达进行研究。结果：7例正常胰腺组织无1例表达CD44v mRNA，胰腺癌组织CD44v mRNA表达率为77.78%(21/27)。统计学分析显示，CD44v mRNA表达与胰腺癌伴随局部淋巴结转移及临床分期呈非常显著相关(P<0.01)，与胰腺癌病理分级呈显著相关(P<0.05)。结论：CD44v mRNA表达可作为胰腺癌预后不良的生物学指标之一。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of metastasis-associated splice variants of CD44 mRNA in pancreatic adenocarcinoma
Fang Youwen, Xu Guoming, Zhang Hongfu, Li Zhaoshen (Department of Gastroen- terology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the expression of metastasis-associated splice variants of CD44 (CD44v) mRNA in pancreatic adenocarcinoma and to analyse the relations between expression of CD44v and clinical manifestation in pancreatic adenocarcinoma. Methods: Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Southern blot technique, we studied the CD44v mRNA expression in normal pancreatic tissues and pancreatic adenocarcinomas. Results： We found that there was no CD44v mRNA expression in normal pancreatic tissues, whereas 21 of 27 (77.78%) pancreatic adenocarcinomas showed expression of CD44v mRNA. Statistical analysis showed that CD44v mRNA expression in pancreatic adenocarcinoma was related to lymph node metastasis (P<0.01) and to TNM staging (P<0.01), and that the expression was negatively correlated with the extent of histological differentiation (P<0.05). Conclusion： These results suggest that CD44v mRNA expression can be regarded as one of the prognosis factors for the patients with pancreatic adenocarcinoma.
, 百拇医药
Key words pancreatic neoplasms; adhesion molecules; metastasis; prognosis
CD44是细胞表面的粘附分子,具有广泛的生物学功能。近年来的研究表明，CD44拼接变异体(CD44v)与恶性肿瘤的转移关系密切[1]。有关CD44v mRNA在消化道肿瘤中的表达已有不少报道[2],但在恶性程度高、早期诊断困难、预后差的人胰腺癌组织中的表达研究尚少见。我们应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对人胰腺癌组织中CD44v mRNA表达进行研究，以观察CD44v mRNA表达与人胰腺癌转移及预后的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 27例胰腺癌标本，取自长海医院普外科1991年8月至1994年10月住院手术治疗的胰腺癌患者，其中男性21例，女性6例，年龄31～75岁，诊断由病理学证实。7例正常对照胰腺组织取自意外死亡的个体尸检，其中男6例，女1例，年龄28～67岁。取材后立即放入液氮中保存备用。
, http://www.100md.com
1.2 引物、探针等 PCR引物根据人类CD44v cDNA资料[3]设计，并由中科院上海细胞研究所合成。上游引物为5 GACAGACACCTCAGTTT TTCTGGA 3，下游引物为5 TTCCTTCGT GTGTGGGTAATGAGA3,产物长度均为949 bp。CD44v质粒(中科院肿瘤研究所张权庚博士惠赠)常规扩增后EcoR Ⅰ酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳法纯化出1.0 kb片段，随机引物法标记。异硫氰酸胍(Serva)，Taq DNA聚合酶(Promega)，RT-PCR试剂盒(Promega)，DNA热循环仪(PE-Cetus)，α-32P-dCTP(北京亚辉公司)。
1.3 总RNA提取 取胰腺癌及正常胰腺组织标本1.0 g，按酸酚法抽提总RNA，检查其完整性、纯度及浓度，-70℃保存备用。
1.4 RT-PCR及Southern杂交分析 将提取的胰腺癌及正常胰腺组织标本总RNA 42℃逆转录1 h后行PCR扩增(94℃×1 min，55℃×1 min，72℃×1 min，共35个循环)。PCR产物按常规方法电泳、转膜、杂交、放射自显影、洗片及结果判定。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 CD44v mRNA的表达 胰腺癌组织CD44v mRNA表达率77.78%(21/27)；而7例正常对照组织无1例表达。图1示部分胰腺癌组织CD44v mRNA表达结果。
图 1 部分胰腺癌组织CD44v mRNA表达结果
Fig 1 Expression of CD44v mRNA in partial
pancreatic adenocarcinoma tissues
1: CD44v3～8 cDNA; 2～12: Pancreatic adenocarcinoma tissue
, http://www.100md.com
2.1 CD44v mRNA表达与胰腺癌临床生物学行为的关系(表1) CD44v mRNA表达与局部淋巴结转移及临床分期呈非常显著相关(P<0.01)，与病理分级呈显著相关(P<0.05)，而与胰腺癌大小及血清CA19-9水平无显著相关(P>0.05)。
3 讨 论
CD44v是指在CD44基因序列的第782～783 bp之间插入外显子后编码的糖蛋白。不同的外显子单个或多个地插入能编码出许多不同的CD44v。体外实验证明,CD44v与肿瘤转移的关系密切,将CD44v基因导入非转移的肿瘤细胞,可使其出现转移特征,而注射CD44v蛋白特异性抗体,可阻止或延缓肿瘤的转移[4]。
表 1 27例胰腺癌组织CD44v mRNA表达情况及相关病理资料
Tab 1 Expression of CD44v mRNA of cancer tissue
, http://www.100md.com
in 27 patients with pancreatic adenocarcinoma
and their clinical pathological details Pathological details
n
CD44v mRNA(+)
P
Histological grade Ⅰ～Ⅱ
9
4
0.0141
Ⅲ～Ⅳ
, http://www.100md.com
18
17
Clinical stage Ⅰ～Ⅱ
10
5
0.006
Ⅲ～Ⅳ
17
16
Tumor size <5 cm
12
8
0.4244
, 百拇医药
>5 cm
15
13
CA19-9 <37 U/ml
5
2
0.0979
>37 U/ml
22
19
Lymph node metastasis (-)
10
, http://www.100md.com 5
0.006
(+)
17
16
CD44v基因表达与肿瘤转移及预后不良相关，Mulder等[5]证实CD44v6蛋白表达与结肠癌转移及预后不良相关,CD44v可作为结肠癌预后不良的标志物。Koopman[5]的研究表明，CD44v基因表达是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的恶性诊断指标。Christopher[6]报道应用RT-PCR方法检测CD44v mRNA在原发性胰腺癌及转移性胰腺癌表达情况,结果转移性胰腺癌表达率高,但统计学无显著意义;Castella等[7]研究显示CD44标准型(CD44s)蛋白在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌组织中均有表达,而CD44v6蛋白在正常胰腺、慢性胰腺炎组织中无表达,在胰腺癌组织中表达率却高达54%,作者认为CD44v的表达是胰腺癌的生物学标志之一。
, http://www.100md.com
本研究应用敏感的RT-PCR方法，检测胰腺癌及正常胰腺组织中CD44v mRNA表达。结果显示正常胰腺组织无CD44v mRNA表达，而胰腺癌组织中CD44v mRNA表达率高达77.78%(21/27)，说明CD44v在胰腺癌的形成过程中起一定作用，检测CD44v mRNA表达对早期诊断胰腺癌可能存在潜在意义。统计学分析显示，CD44v mRNA表达与胰腺癌病理分级呈显著相关(P<0.05)，与临床分期及伴随局部淋巴结转移呈非常显著相关(P<0.01)，说明CD44v mRNA表达与胰腺癌转移及预后有关，是胰腺癌转移及预后不良的指标之一。
参 考 文 献
1 Herrlich P, Zoller M, Donta H, et al. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today, 1993, 14(8):395
, 百拇医药
2 Mulder TWR, Kruyt PM, Sewnath M, et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon v6 containing CD44 proteins. Lancet, 1994, 344(8943):1470
3 Hofmann M, Rudy W, Zoller M, et al. CD44 splice variant con- fers metastatic behavior in rats: homologue sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res, 1991, 51(19):5292
4 Rudy W, Hofmann M, Albiez RS, et al. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variants: each one individually suffers to confer metastatic behavior. Cancer Res, 1993, 53(6):1226
, 百拇医药
5 Koopman G, Heider KH, Horst E, et al. Activated human lymphocytes and aggressive non-Hodgkins lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J Exp Med, 1993, 177(4):897
6 Rall CJ, Rustgi CK. CD44 isoform expression in primary and metastatic pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res, 1995, 55(9):1831
7 Castella EM, Ariza A, Ojanguren I, et al. Differential ex- pression of CD44v6 in adenocarcinoma of the pancreas: an immunohistochemical study. Virchows Arch, 1996, 429(4-5):191
(1998-03-15收稿，1998-07-16修回)
姚银珍，女，1964年2月生，主管护师, 百拇医药
单位：第二军医大学长海医院消化内科，上海，200433 姚银珍，女，1964年2月生，主管护师
关键词：胰腺肿瘤；粘附分子；转移；预后
第二军医大学学报980512 摘要 目的：观察CD44拼接变异体(CD44v)mRNA在胰腺癌组织中的表达及其意义。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Southern杂交技术对7例正常胰腺组织及27例胰腺癌标本中的CD44v mRNA表达进行研究。结果：7例正常胰腺组织无1例表达CD44v mRNA，胰腺癌组织CD44v mRNA表达率为77.78%(21/27)。统计学分析显示，CD44v mRNA表达与胰腺癌伴随局部淋巴结转移及临床分期呈非常显著相关(P<0.01)，与胰腺癌病理分级呈显著相关(P<0.05)。结论：CD44v mRNA表达可作为胰腺癌预后不良的生物学指标之一。
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中国图书资料分类法分类号 R735.9
Expression of metastasis-associated splice variants of CD44 mRNA in pancreatic adenocarcinoma
Fang Youwen, Xu Guoming, Zhang Hongfu, Li Zhaoshen (Department of Gastroen- terology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To observe the expression of metastasis-associated splice variants of CD44 (CD44v) mRNA in pancreatic adenocarcinoma and to analyse the relations between expression of CD44v and clinical manifestation in pancreatic adenocarcinoma. Methods: Using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Southern blot technique, we studied the CD44v mRNA expression in normal pancreatic tissues and pancreatic adenocarcinomas. Results： We found that there was no CD44v mRNA expression in normal pancreatic tissues, whereas 21 of 27 (77.78%) pancreatic adenocarcinomas showed expression of CD44v mRNA. Statistical analysis showed that CD44v mRNA expression in pancreatic adenocarcinoma was related to lymph node metastasis (P<0.01) and to TNM staging (P<0.01), and that the expression was negatively correlated with the extent of histological differentiation (P<0.05). Conclusion： These results suggest that CD44v mRNA expression can be regarded as one of the prognosis factors for the patients with pancreatic adenocarcinoma.
, 百拇医药
Key words pancreatic neoplasms; adhesion molecules; metastasis; prognosis
CD44是细胞表面的粘附分子,具有广泛的生物学功能。近年来的研究表明，CD44拼接变异体(CD44v)与恶性肿瘤的转移关系密切[1]。有关CD44v mRNA在消化道肿瘤中的表达已有不少报道[2],但在恶性程度高、早期诊断困难、预后差的人胰腺癌组织中的表达研究尚少见。我们应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对人胰腺癌组织中CD44v mRNA表达进行研究，以观察CD44v mRNA表达与人胰腺癌转移及预后的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 27例胰腺癌标本，取自长海医院普外科1991年8月至1994年10月住院手术治疗的胰腺癌患者，其中男性21例，女性6例，年龄31～75岁，诊断由病理学证实。7例正常对照胰腺组织取自意外死亡的个体尸检，其中男6例，女1例，年龄28～67岁。取材后立即放入液氮中保存备用。
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1.2 引物、探针等 PCR引物根据人类CD44v cDNA资料[3]设计，并由中科院上海细胞研究所合成。上游引物为5 GACAGACACCTCAGTTT TTCTGGA 3，下游引物为5 TTCCTTCGT GTGTGGGTAATGAGA3,产物长度均为949 bp。CD44v质粒(中科院肿瘤研究所张权庚博士惠赠)常规扩增后EcoR Ⅰ酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳法纯化出1.0 kb片段，随机引物法标记。异硫氰酸胍(Serva)，Taq DNA聚合酶(Promega)，RT-PCR试剂盒(Promega)，DNA热循环仪(PE-Cetus)，α-32P-dCTP(北京亚辉公司)。
1.3 总RNA提取 取胰腺癌及正常胰腺组织标本1.0 g，按酸酚法抽提总RNA，检查其完整性、纯度及浓度，-70℃保存备用。
1.4 RT-PCR及Southern杂交分析 将提取的胰腺癌及正常胰腺组织标本总RNA 42℃逆转录1 h后行PCR扩增(94℃×1 min，55℃×1 min，72℃×1 min，共35个循环)。PCR产物按常规方法电泳、转膜、杂交、放射自显影、洗片及结果判定。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 CD44v mRNA的表达 胰腺癌组织CD44v mRNA表达率77.78%(21/27)；而7例正常对照组织无1例表达。图1示部分胰腺癌组织CD44v mRNA表达结果。
图 1 部分胰腺癌组织CD44v mRNA表达结果
Fig 1 Expression of CD44v mRNA in partial
pancreatic adenocarcinoma tissues
1: CD44v3～8 cDNA; 2～12: Pancreatic adenocarcinoma tissue
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2.1 CD44v mRNA表达与胰腺癌临床生物学行为的关系(表1) CD44v mRNA表达与局部淋巴结转移及临床分期呈非常显著相关(P<0.01)，与病理分级呈显著相关(P<0.05)，而与胰腺癌大小及血清CA19-9水平无显著相关(P>0.05)。
3 讨 论
CD44v是指在CD44基因序列的第782～783 bp之间插入外显子后编码的糖蛋白。不同的外显子单个或多个地插入能编码出许多不同的CD44v。体外实验证明,CD44v与肿瘤转移的关系密切,将CD44v基因导入非转移的肿瘤细胞,可使其出现转移特征,而注射CD44v蛋白特异性抗体,可阻止或延缓肿瘤的转移[4]。
表 1 27例胰腺癌组织CD44v mRNA表达情况及相关病理资料
Tab 1 Expression of CD44v mRNA of cancer tissue
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in 27 patients with pancreatic adenocarcinoma
and their clinical pathological details Pathological details
n
CD44v mRNA(+)
P
Histological grade Ⅰ～Ⅱ
9
4
0.0141
Ⅲ～Ⅳ
, http://www.100md.com
18
17
Clinical stage Ⅰ～Ⅱ
10
5
0.006
Ⅲ～Ⅳ
17
16
Tumor size <5 cm
12
8
0.4244
, 百拇医药
>5 cm
15
13
CA19-9 <37 U/ml
5
2
0.0979
>37 U/ml
22
19
Lymph node metastasis (-)
10
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0.006
(+)
17
16
CD44v基因表达与肿瘤转移及预后不良相关，Mulder等[5]证实CD44v6蛋白表达与结肠癌转移及预后不良相关,CD44v可作为结肠癌预后不良的标志物。Koopman[5]的研究表明，CD44v基因表达是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的恶性诊断指标。Christopher[6]报道应用RT-PCR方法检测CD44v mRNA在原发性胰腺癌及转移性胰腺癌表达情况,结果转移性胰腺癌表达率高,但统计学无显著意义;Castella等[7]研究显示CD44标准型(CD44s)蛋白在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌组织中均有表达,而CD44v6蛋白在正常胰腺、慢性胰腺炎组织中无表达,在胰腺癌组织中表达率却高达54%,作者认为CD44v的表达是胰腺癌的生物学标志之一。
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本研究应用敏感的RT-PCR方法，检测胰腺癌及正常胰腺组织中CD44v mRNA表达。结果显示正常胰腺组织无CD44v mRNA表达，而胰腺癌组织中CD44v mRNA表达率高达77.78%(21/27)，说明CD44v在胰腺癌的形成过程中起一定作用，检测CD44v mRNA表达对早期诊断胰腺癌可能存在潜在意义。统计学分析显示，CD44v mRNA表达与胰腺癌病理分级呈显著相关(P<0.05)，与临床分期及伴随局部淋巴结转移呈非常显著相关(P<0.01)，说明CD44v mRNA表达与胰腺癌转移及预后有关，是胰腺癌转移及预后不良的指标之一。
参 考 文 献
1 Herrlich P, Zoller M, Donta H, et al. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today, 1993, 14(8):395
, 百拇医药
2 Mulder TWR, Kruyt PM, Sewnath M, et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon v6 containing CD44 proteins. Lancet, 1994, 344(8943):1470
3 Hofmann M, Rudy W, Zoller M, et al. CD44 splice variant con- fers metastatic behavior in rats: homologue sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res, 1991, 51(19):5292
4 Rudy W, Hofmann M, Albiez RS, et al. The two major CD44 proteins expressed on a metastatic rat tumor cell line are derived from different splice variants: each one individually suffers to confer metastatic behavior. Cancer Res, 1993, 53(6):1226
, 百拇医药
5 Koopman G, Heider KH, Horst E, et al. Activated human lymphocytes and aggressive non-Hodgkins lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J Exp Med, 1993, 177(4):897
6 Rall CJ, Rustgi CK. CD44 isoform expression in primary and metastatic pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res, 1995, 55(9):1831
7 Castella EM, Ariza A, Ojanguren I, et al. Differential ex- pression of CD44v6 in adenocarcinoma of the pancreas: an immunohistochemical study. Virchows Arch, 1996, 429(4-5):191
(1998-03-15收稿，1998-07-16修回)
姚银珍，女，1964年2月生，主管护师, 百拇医药