去除外骨膜对引导性骨再生模型成骨过程的影响
作者：张浩 卢世璧 王继芳
单位：100853 北京，解放军总医院骨科(张浩现在第一军医大学南方医院骨科,510515)
关键词：骨膜；骨再生；动物，实验
中华外科杂志/980509 【摘要】 目的 研究去除外骨膜对引导性骨再生成骨过程的影响。方法 对24只新西兰兔双侧桡骨制作10 mm骨缺损，一侧保留外骨膜并用硅胶管连接，另一侧于缺损两端各去除外骨膜10 mm，其余手术方法相同，动物分别于术后3天和1、2、3、4、6、10、12周处死，标本行X线、非脱钙骨切片组织学检查。结果 (1)去除外骨膜后对于膜管内、膜管外成骨过程均无影响；(2)外骨膜生发层中的成骨细胞与哈弗系统中央管内及骨表面的成骨细胞相互联系；(3)外骨膜的两层结构分别来自于不同的组织：纤维层组织来自于外周的软组织，生发层中的成骨细胞来自于骨表面及哈弗系统。结论 去除外骨膜对引导性骨再生模型的成骨过程无影响。
, http://www.100md.com
Influence of stripping periosteum on bone formation in guided tissue regeneration Zhang Hao, Lu Shibi, Wang Jifang.Department of Othopedics,General Hostipal of Chinese People′s Liberation Army, Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To analyze the role of periosteum in guided bone regeneration by means of undecalcified sections and X-ray films. Method 10 mm long segmental defects were created in the diaphyses of both radii in 24 New Zealand rabbits. The defect on the control side was covered with a silicone membrane shaped as a tube. On the experimental side,10 mm periosteum of both sides of the defect was stripped and the defect was covered with a silcone tube. The animals were killed at the 3rd day and the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th weeks. Samples were treated for radiologic and histologic examinations. Result (1) periosteal stripping exerts no effect on callus formation in or out of the tube. (2) osteoblasts in the cambium layer of the perioteumcome from bone surface, endosteum or the Haversian envelopes. (3) the tissue in the two layers of the periosteum has different origins, the fibrous layer comes from soft tissue and osteoblasts in the cambium from bone surface or Haversian envelopes. Conclusion Stripping periosteum has no influence on bone formation in guided tissue regeneration.
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【Key words】 Periosteum Bone regeneration Animals,laboratory
普遍认为外骨膜由生发层和纤维层两层结构组成，其生发层内含有成骨细胞，对长骨骨修复有促进作用。但对于外骨膜的作用还有许多争论，有学者认为外骨膜在骨折愈合过程中无显著作用[1]，而另有学者认为外骨膜是有成骨能力的独立、复杂的器官[2]。既往对外骨膜成骨作用的研究都是在外骨膜与各种成骨因素混杂的情况下进行的。而借助引导性骨再生模型可以使我们独立地研究外骨膜的成骨作用。我们应用引导性骨再生的动物模型，以非脱钙骨组织切片技术，观察去除外骨膜后，对于引导性骨再生过程的影响，并且对外骨膜在骨修复中再生方式进行了观察。
材料与方法
1.动物模型：成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，体重1.5～2.0 kg。3%噻胺酮0.3 ml/kg，肌肉注射麻醉，双前肢常规方法脱毛、灭菌，于右桡骨中段隆起处行40 mm切口，沿肌肉间隙显露桡骨30 mm。
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对照侧：完整保留外骨膜，连同外骨膜截除10 mm桡骨，用1 mm厚的医用硅胶膜(16 mm×16 mm)，将两侧卷曲，缝合成管状，套于桡骨缺损两端的外骨膜外，远近端各套入3 mm。
实验侧：以利刀剥离并切除桡骨外骨膜30 mm，并刮除骨面上的残余组织，于其中间造成10 mm的骨缺损，其它手术步骤同对照侧。
2.观察方法：术后每周拍摄双前肢X线片。按处死时间将动物分为术后3天和1、2、3、4、6、10、12周共8组，每组3只。以缺损为中心，连同周围软组织截取30 mm桡骨标本，70%酒精固定3天，70%、80%、90%、95%酒精梯度脱水，无水丙酮脱水，采用甲基丙烯酸甲脂和丁脂包埋，以JUNGK型切骨机切出7 μm的非脱钙切片，Giemsa染色，光镜下观察。
结 果
根据成骨性质的不同，以隔膜为界将引导性骨再生过程分成膜管内骨修复过程和膜管外骨修复过程两部分。观察外骨膜时，按部位不同将外骨膜分成与膜管接触部分和外骨痂表面部分进行观察。与膜管接触部分分成膜管内与皮质骨接触部分和膜管外面与软组织接触部分。
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一、X线观察
实验侧和对照侧之膜管内、膜管外骨再生过程的X线表现无任何区别。
1.膜管内骨再生过程:术后1周，膜管内无骨痂。术后2周，缺损近端附近有少量骨痂。术后4周，膜管内远近端均出现骨痂并相对生长，形成两个成骨尖端，X线显示为外层一薄层骨皮质、中间为透亮区域的特殊征象。术后12周，两成骨尖端汇合，两侧透亮区域融合，髓腔连通。
2.膜管外骨再生过程:术后1周，在膜管边缘与肌肉交界处，出现外骨痂。术后2～5周，外骨痂逐渐增大。术后6周开始，外骨痂逐渐缩小。在第10～12周，大部分桡骨恢复原来的X线外形征象。
二、组织学观察
1.膜管内、外成骨过程:实验侧与对照侧膜管内、外的成骨过程组织学改变基本相似。
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膜管内骨修复方式的特点是成骨细胞直接成骨，即从髓腔来源的成骨细胞直接形成原始骨小梁，随后髓腔内组织不断吸收这些原始骨组织，并形成薄层成熟皮质骨。两个成骨尖端相对生长并汇合，随后两髓腔相通。
膜管外骨修复方式特点是有软骨组织参与的成骨过程，即来自皮质骨表面、哈弗系统中央管内或外骨膜的成骨细胞与周围软组织相互作用形成软骨组织、原始骨小梁。随后形成成熟骨组织。以后这些骨组织逐渐被吸收。
2.引导性骨再生中外骨膜的组织学改变:在正常桡骨表面, 哈弗系统中央管壁与外骨膜生发层相延续，两者的成骨细胞相混合(图1)。
外骨痂表面组织结构:术后1～2周，在对照侧外骨痂表面，外骨膜变化主要是生发层和纤维层细胞增生(图2,3)，骨痂内骨小梁管道与外骨膜生发层相延续，外骨膜生发层的成骨细胞与哈弗系统中央管内的成骨细胞及外骨痂骨表面的成骨细胞相混合。纤维层增生的细胞与周围软组织纤维细胞相混合。术后6周左右，随着外骨痂的成熟和吸收，外骨膜的两层增生细胞也相对静止。实验侧外骨痂表面在术后1周即形成两层细胞结构，组织结构与对照侧类似，内层为成骨细胞层，这些成骨细胞亦来自于外骨痂表面活跃的成骨细胞及哈弗系统中央管内的成骨细胞，外层为纤维细胞层，这些细胞来自于周围的软组织(图4)。
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与膜管接触部分的组织结构：(1)膜管与软组织接触的部位：术后1周开始，对照侧在膜管外形成一层由大量纤维细胞组成的纤维层，类似于外骨膜的纤维层而无生发层，主要的成分为胶原纤维和成纤维细胞(图5)，随后的骨再生过程中，也无生发层出现。去除外骨膜后在膜管外也形成一层类似组织。(2)膜管与骨皮质接触的部位：对照侧原残留的外骨膜逐渐被吸收，术后2周开始，骨表面形成一类似于外骨膜生发层的成骨细胞层，这些成骨细胞与骨表面的成骨细胞及哈弗系统中央管腔内的成骨细胞联系紧密，而无纤维层结构(图6)。去除外骨膜后，术后2周在此部位仍形成一层类似组织。
讨 论
引导性骨再生模型的基础是隔膜干扰技术，由于隔膜的存在，将骨修复过程分隔成膜管内、膜管外的骨再生过程[3]。膜管内的骨再生过程特点是成骨细胞直接成骨，膜管外的成骨过程特点是有软骨组织参与。
骨通常被外骨膜、内骨膜和哈弗系统的内衬所包绕[4]。骨的外包膜即外骨膜，主要由两层组成：纤维的膜性结构和骨再生细胞层或称生发层，两者无明显的分界。在骨的内表面，内骨膜是由单层包绕骨髓组织和骨小梁的类似于生发层的成骨细胞组成。
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本实验中，我们观察到：(1)去除外骨膜后对于膜管内骨再生方式、骨再生进程无任何影响；(2)对照侧原外骨膜多被吸收，不参与膜管内骨修复过程，且膜管与皮质骨表面之间的成骨细胞(类似于外骨膜的生发层)与来自于皮质骨表面及哈弗系统管腔内的成骨细胞联系密切，而非来自原外骨膜成分。结果表明，去除外骨膜对引导性骨再生膜管内骨修复过程无影响。
在本模型中，由于膜管阻隔了外周软组织与皮质骨的接触，在膜管外表面再生出的膜性结构只有纤维组织，类似于外骨膜的纤维层；而膜管与皮质骨接触部位，骨表面再生出的组织只有生发层而无纤维层。这一观察结果与外骨膜是一独立的、复杂的成骨器官的观点有区别。在外骨膜的组成上，本实验观察结果显示，外骨膜的纤维层和生发层分别来自于不同的组织，因而它有着各自的细胞来源及生长方式。当它们停止增生时，组织学显示为正常外骨膜的两层不同细胞结构。
关于本实验观察到去除外骨膜后对外骨痂成骨过程无影响，我们认为可以从以下几个方面来解释：(1)除去外骨膜较少或没有全部除去桡骨外骨膜，外骨膜其他功能未完全丧失，如血供能力等；(2)虽然除去了外骨膜的生发层，但是由于外骨膜生发层的成骨细胞与哈弗系统中央管及骨痂内小梁管腔相通，外骨痂所需成骨细胞可来自于这些结构中的成骨细胞，其再生过程不受影响。
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本实验所得关于外骨膜的结论，是基于本实验初步的组织学观察。体内、体外实验中外骨膜具有成骨的能力，这一点是勿庸置疑的。本实验只对外骨膜生发层成骨细胞的来源进行了探讨，其理论基础及临床应用尚待更深入的研究。
图1 正常桡骨表面组织学观察：黑箭头示皮质骨内哈弗氏系统，白箭头示外骨膜生发层Giemsa×40
图2 术后1周对照组外骨痂表面增生组织：黑箭头示生发层增生，白箭头示纤维层增生Giemsa ×40
图3 术后2周对照侧外骨痂表面增生组织：黑箭头示增生的成骨细胞层，白箭头示增生的纤维层Giemsa ×100
图4 术后2周实验侧膜管外增生组织：黑箭头示生发层之成骨细胞，白箭头示纤维层Giemsa ×100
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图5 术后1周膜管外增生组织，由成纤维细胞组成 Giemsa ×100
图6 术后2周膜管与皮质骨接触部位增生组织：黑箭头示由成骨细胞组成，白前箭头示骨表面溶解 Giemsa ×100
参 考 文 献
1Macewen W.Osteogenic power of bone bereft of periosteum.Clin Orthop,1983,174:5-14.
2Brook AL.The periosteum:its function reassessed.Clin Orthop,1984,189:300-307.
3张子军,卢世璧,王继芳.引导性骨再生的实验研究.中华骨科杂志，1995,15:614-616.
4McKibbin B. The biology of fracture healing in long boens.J Bone Joint Surg(Br),1978,60:150-162., 百拇医药
单位：100853 北京，解放军总医院骨科(张浩现在第一军医大学南方医院骨科,510515)
关键词：骨膜；骨再生；动物，实验
中华外科杂志/980509 【摘要】 目的 研究去除外骨膜对引导性骨再生成骨过程的影响。方法 对24只新西兰兔双侧桡骨制作10 mm骨缺损，一侧保留外骨膜并用硅胶管连接，另一侧于缺损两端各去除外骨膜10 mm，其余手术方法相同，动物分别于术后3天和1、2、3、4、6、10、12周处死，标本行X线、非脱钙骨切片组织学检查。结果 (1)去除外骨膜后对于膜管内、膜管外成骨过程均无影响；(2)外骨膜生发层中的成骨细胞与哈弗系统中央管内及骨表面的成骨细胞相互联系；(3)外骨膜的两层结构分别来自于不同的组织：纤维层组织来自于外周的软组织，生发层中的成骨细胞来自于骨表面及哈弗系统。结论 去除外骨膜对引导性骨再生模型的成骨过程无影响。
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Influence of stripping periosteum on bone formation in guided tissue regeneration Zhang Hao, Lu Shibi, Wang Jifang.Department of Othopedics,General Hostipal of Chinese People′s Liberation Army, Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To analyze the role of periosteum in guided bone regeneration by means of undecalcified sections and X-ray films. Method 10 mm long segmental defects were created in the diaphyses of both radii in 24 New Zealand rabbits. The defect on the control side was covered with a silicone membrane shaped as a tube. On the experimental side,10 mm periosteum of both sides of the defect was stripped and the defect was covered with a silcone tube. The animals were killed at the 3rd day and the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 10th, 12th weeks. Samples were treated for radiologic and histologic examinations. Result (1) periosteal stripping exerts no effect on callus formation in or out of the tube. (2) osteoblasts in the cambium layer of the perioteumcome from bone surface, endosteum or the Haversian envelopes. (3) the tissue in the two layers of the periosteum has different origins, the fibrous layer comes from soft tissue and osteoblasts in the cambium from bone surface or Haversian envelopes. Conclusion Stripping periosteum has no influence on bone formation in guided tissue regeneration.
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【Key words】 Periosteum Bone regeneration Animals,laboratory
普遍认为外骨膜由生发层和纤维层两层结构组成，其生发层内含有成骨细胞，对长骨骨修复有促进作用。但对于外骨膜的作用还有许多争论，有学者认为外骨膜在骨折愈合过程中无显著作用[1]，而另有学者认为外骨膜是有成骨能力的独立、复杂的器官[2]。既往对外骨膜成骨作用的研究都是在外骨膜与各种成骨因素混杂的情况下进行的。而借助引导性骨再生模型可以使我们独立地研究外骨膜的成骨作用。我们应用引导性骨再生的动物模型，以非脱钙骨组织切片技术，观察去除外骨膜后，对于引导性骨再生过程的影响，并且对外骨膜在骨修复中再生方式进行了观察。
材料与方法
1.动物模型：成年新西兰大白兔24只，雌雄不限，体重1.5～2.0 kg。3%噻胺酮0.3 ml/kg，肌肉注射麻醉，双前肢常规方法脱毛、灭菌，于右桡骨中段隆起处行40 mm切口，沿肌肉间隙显露桡骨30 mm。
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对照侧：完整保留外骨膜，连同外骨膜截除10 mm桡骨，用1 mm厚的医用硅胶膜(16 mm×16 mm)，将两侧卷曲，缝合成管状，套于桡骨缺损两端的外骨膜外，远近端各套入3 mm。
实验侧：以利刀剥离并切除桡骨外骨膜30 mm，并刮除骨面上的残余组织，于其中间造成10 mm的骨缺损，其它手术步骤同对照侧。
2.观察方法：术后每周拍摄双前肢X线片。按处死时间将动物分为术后3天和1、2、3、4、6、10、12周共8组，每组3只。以缺损为中心，连同周围软组织截取30 mm桡骨标本，70%酒精固定3天，70%、80%、90%、95%酒精梯度脱水，无水丙酮脱水，采用甲基丙烯酸甲脂和丁脂包埋，以JUNGK型切骨机切出7 μm的非脱钙切片，Giemsa染色，光镜下观察。
结 果
根据成骨性质的不同，以隔膜为界将引导性骨再生过程分成膜管内骨修复过程和膜管外骨修复过程两部分。观察外骨膜时，按部位不同将外骨膜分成与膜管接触部分和外骨痂表面部分进行观察。与膜管接触部分分成膜管内与皮质骨接触部分和膜管外面与软组织接触部分。
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一、X线观察
实验侧和对照侧之膜管内、膜管外骨再生过程的X线表现无任何区别。
1.膜管内骨再生过程:术后1周，膜管内无骨痂。术后2周，缺损近端附近有少量骨痂。术后4周，膜管内远近端均出现骨痂并相对生长，形成两个成骨尖端，X线显示为外层一薄层骨皮质、中间为透亮区域的特殊征象。术后12周，两成骨尖端汇合，两侧透亮区域融合，髓腔连通。
2.膜管外骨再生过程:术后1周，在膜管边缘与肌肉交界处，出现外骨痂。术后2～5周，外骨痂逐渐增大。术后6周开始，外骨痂逐渐缩小。在第10～12周，大部分桡骨恢复原来的X线外形征象。
二、组织学观察
1.膜管内、外成骨过程:实验侧与对照侧膜管内、外的成骨过程组织学改变基本相似。
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膜管内骨修复方式的特点是成骨细胞直接成骨，即从髓腔来源的成骨细胞直接形成原始骨小梁，随后髓腔内组织不断吸收这些原始骨组织，并形成薄层成熟皮质骨。两个成骨尖端相对生长并汇合，随后两髓腔相通。
膜管外骨修复方式特点是有软骨组织参与的成骨过程，即来自皮质骨表面、哈弗系统中央管内或外骨膜的成骨细胞与周围软组织相互作用形成软骨组织、原始骨小梁。随后形成成熟骨组织。以后这些骨组织逐渐被吸收。
2.引导性骨再生中外骨膜的组织学改变:在正常桡骨表面, 哈弗系统中央管壁与外骨膜生发层相延续，两者的成骨细胞相混合(图1)。
外骨痂表面组织结构:术后1～2周，在对照侧外骨痂表面，外骨膜变化主要是生发层和纤维层细胞增生(图2,3)，骨痂内骨小梁管道与外骨膜生发层相延续，外骨膜生发层的成骨细胞与哈弗系统中央管内的成骨细胞及外骨痂骨表面的成骨细胞相混合。纤维层增生的细胞与周围软组织纤维细胞相混合。术后6周左右，随着外骨痂的成熟和吸收，外骨膜的两层增生细胞也相对静止。实验侧外骨痂表面在术后1周即形成两层细胞结构，组织结构与对照侧类似，内层为成骨细胞层，这些成骨细胞亦来自于外骨痂表面活跃的成骨细胞及哈弗系统中央管内的成骨细胞，外层为纤维细胞层，这些细胞来自于周围的软组织(图4)。
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与膜管接触部分的组织结构：(1)膜管与软组织接触的部位：术后1周开始，对照侧在膜管外形成一层由大量纤维细胞组成的纤维层，类似于外骨膜的纤维层而无生发层，主要的成分为胶原纤维和成纤维细胞(图5)，随后的骨再生过程中，也无生发层出现。去除外骨膜后在膜管外也形成一层类似组织。(2)膜管与骨皮质接触的部位：对照侧原残留的外骨膜逐渐被吸收，术后2周开始，骨表面形成一类似于外骨膜生发层的成骨细胞层，这些成骨细胞与骨表面的成骨细胞及哈弗系统中央管腔内的成骨细胞联系紧密，而无纤维层结构(图6)。去除外骨膜后，术后2周在此部位仍形成一层类似组织。
讨 论
引导性骨再生模型的基础是隔膜干扰技术，由于隔膜的存在，将骨修复过程分隔成膜管内、膜管外的骨再生过程[3]。膜管内的骨再生过程特点是成骨细胞直接成骨，膜管外的成骨过程特点是有软骨组织参与。
骨通常被外骨膜、内骨膜和哈弗系统的内衬所包绕[4]。骨的外包膜即外骨膜，主要由两层组成：纤维的膜性结构和骨再生细胞层或称生发层，两者无明显的分界。在骨的内表面，内骨膜是由单层包绕骨髓组织和骨小梁的类似于生发层的成骨细胞组成。
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本实验中，我们观察到：(1)去除外骨膜后对于膜管内骨再生方式、骨再生进程无任何影响；(2)对照侧原外骨膜多被吸收，不参与膜管内骨修复过程，且膜管与皮质骨表面之间的成骨细胞(类似于外骨膜的生发层)与来自于皮质骨表面及哈弗系统管腔内的成骨细胞联系密切，而非来自原外骨膜成分。结果表明，去除外骨膜对引导性骨再生膜管内骨修复过程无影响。
在本模型中，由于膜管阻隔了外周软组织与皮质骨的接触，在膜管外表面再生出的膜性结构只有纤维组织，类似于外骨膜的纤维层；而膜管与皮质骨接触部位，骨表面再生出的组织只有生发层而无纤维层。这一观察结果与外骨膜是一独立的、复杂的成骨器官的观点有区别。在外骨膜的组成上，本实验观察结果显示，外骨膜的纤维层和生发层分别来自于不同的组织，因而它有着各自的细胞来源及生长方式。当它们停止增生时，组织学显示为正常外骨膜的两层不同细胞结构。
关于本实验观察到去除外骨膜后对外骨痂成骨过程无影响，我们认为可以从以下几个方面来解释：(1)除去外骨膜较少或没有全部除去桡骨外骨膜，外骨膜其他功能未完全丧失，如血供能力等；(2)虽然除去了外骨膜的生发层，但是由于外骨膜生发层的成骨细胞与哈弗系统中央管及骨痂内小梁管腔相通，外骨痂所需成骨细胞可来自于这些结构中的成骨细胞，其再生过程不受影响。
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本实验所得关于外骨膜的结论，是基于本实验初步的组织学观察。体内、体外实验中外骨膜具有成骨的能力，这一点是勿庸置疑的。本实验只对外骨膜生发层成骨细胞的来源进行了探讨，其理论基础及临床应用尚待更深入的研究。
图1 正常桡骨表面组织学观察：黑箭头示皮质骨内哈弗氏系统，白箭头示外骨膜生发层Giemsa×40
图2 术后1周对照组外骨痂表面增生组织：黑箭头示生发层增生，白箭头示纤维层增生Giemsa ×40
图3 术后2周对照侧外骨痂表面增生组织：黑箭头示增生的成骨细胞层，白箭头示增生的纤维层Giemsa ×100
图4 术后2周实验侧膜管外增生组织：黑箭头示生发层之成骨细胞，白箭头示纤维层Giemsa ×100
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图5 术后1周膜管外增生组织，由成纤维细胞组成 Giemsa ×100
图6 术后2周膜管与皮质骨接触部位增生组织：黑箭头示由成骨细胞组成，白前箭头示骨表面溶解 Giemsa ×100
参 考 文 献
1Macewen W.Osteogenic power of bone bereft of periosteum.Clin Orthop,1983,174:5-14.
2Brook AL.The periosteum:its function reassessed.Clin Orthop,1984,189:300-307.
3张子军,卢世璧,王继芳.引导性骨再生的实验研究.中华骨科杂志，1995,15:614-616.
4McKibbin B. The biology of fracture healing in long boens.J Bone Joint Surg(Br),1978,60:150-162., 百拇医药