中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白2基因的分子克隆及序列分析
作者：边中启 宋关鸿 郑兆鑫
单位：200433 上海，第二军医大学寄生虫学教研室(边中启，宋关鸿)，复旦大学遗传学研究所(郑兆鑫)
关键词：疟疾，脑型；疟疾，恶性；克隆，分子；序列分析
中华医学杂志980519
【摘要】 目的 为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供科学依据。方法 应用多聚酶链反应(PCR)对5例中国脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕(CMH/YN)分离株和云南省盈江县农场(CYJ/YN)分离株基因组裂殖子表面蛋白2(MSP2)基因进行扩增，将扩增产物分别经BamHI和Hind Ⅲ双酶切后，回收的MSP2基因分子定向克隆M13mp18和M13mp19载体，按Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并与恶性疟原虫株FC27、K1、IC1和CAMP株进行同源性分析比较。结果 5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽序列，与FC27、K1株之间核苷酸同源性为98.8%，而与IC1、CAMP株之间核苷酸同源性为28.2%。结论 中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因突变及其表达的异常可能是导致脑型疟昏迷的一种重要的分子病因。
, http://www.100md.com
Molecular cloning and sequencing of genes encoding MSP2 isolates strains from two of Plasmodium falciparum from Chinese patients with cerebral malaria. Bian Zhongqi, Song Guanhong, Zheng Zhaoxin. Department of Parasitology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract 】 Objective To provide the scientific evidence for designing safe and effective vaccines of human cerebral malaria. Methods Genomic DNA samples of two isolated Plasmodium falciparum isolate strains prepared directly from 5 cases of cerebral malaria patients′ blood in mengla County, Yunnan Province (CMH/YN) and in Yingjiang County, Yunnan Province (CYJ/YN) were used for polymerase chain reaction (PCR) amplification and the two pairs of oligonucleotides for the highly conserved genes encoding FC27 merozoite surface protein 2 (MSP2) of Papua New Guinea strain of Plasmodium falciparum were used as primers. The PCR products were digested with BamH1 and Hind Ⅲ respectively, and the generated fragment MSP2 were cloned into M13mp18 and M13mp19 vectors and their DNA was analyzed as the templates for DNA sequencing by the dideoxy chain-termination method. Results Compared with the published findings, FC27, K1, IC1 and CAMP sequences, DNA sequences of MSP2 from two isolated CMH/YN and CYJ/YN of Plasmodium falciparum strains from Chinese patients with cerebral malaria contained identical genes composed of 800 bp, encoding 264 amino acid, which were highly homologous up to 98.8% with that of FC27, K1 strain other than the IC1, CAMP strain. Conclusion It is the first record of DNA sequencing of MSP2 determined from two isolated CMH/YN and CYJ/YN of Plasmodium falciparum strains from Chinese patients with cerebral malaria, MSP2 mutation may be one factor leading to the localized cerebral damage which causes clinical coma of human cerebral malaria.
, 百拇医药
【Key words 】 Malaria, cerebral Malaria, falciparum Cloning, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78：375-378)
全世界每年疟疾临床发病人数约3～5亿，死亡人数约150～270万，其中有100万的儿童死于脑型疟[1]。因此 ，研究开发安全有效的人脑型疟疫苗控制和消灭疟疾有着重要意义。我们曾报道中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(MSP1)第16～17区基因的分子克隆及序列分析对研究人脑型疟疫苗、阐明脑型疟发病分子机制及其基因诊断和治疗的意义[2]。鉴此，我们进一步报道中国脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕(CMH/YN)分离株和云南省盈江县农场(CYJ/YN)分离株裂殖子表面蛋白2(MSP2)基因的分子克隆及序列测定分析。
, 百拇医药
对象和方法
一、对象
5例中国脑型疟患者来自我国流行区。
1.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP1第13～17区基因的电泳分析；2.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP2基因的电泳分析；3.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP1第13～17区基因的电泳分析；4.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP2基因的电泳分析；5.λDNA/HindⅢ+pUC19/Hae Ⅲ标准分子量23 130～174bp；6.为正常人对照
图1 PCR扩增产物
, 百拇医药
1.λDNA/Hind Ⅲ+pUC19/Hae Ⅲ标准分子量(同图1)；2.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP1第13～17区基因经EcoRI酶切鉴定；3.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP2基因经XbaⅠ酶切鉴定；4.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP1第13～17区基因经EcoRI酶切鉴定；5.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP2基因经XbaⅠ酶切鉴定 图2 PCR产物酶切鉴定
图3 中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因DNA序列分析及其推导的氨基酸序列
二、方法
1.标本采集方法参见文献[1～3]。
2.PCR引物设计合成按文献[1～4]方法。
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3.基因组DNA抽提、PCR扩增和分子克隆及DNA序列测定：按文献[1～4]方法。
4.分子克隆及鉴定：以重组子DNA作为PCR模板，采用MSP2基因原始PCR产物作为对照，参照文献[1，2，4]，应用PCR鉴定阳性分子克隆可获同样结果。
结果
一、PCR产物及酶切鉴定
图4 FC27、K1、IC1和CAMP株与中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2编码基因推导氨基酸序列分析的比较
5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳分析结果见图1；PCR产物经含单一酶切位点XbaⅠ酶切鉴定，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳分析，结果各产生0.62 kb和0.18 kb 2条特定基因带，与预计的MSP2基因大小相一致。这些结果证实PCR产物为中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因(图2)。
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二、DNA测序分析
5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp(图3)，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽序列，理论分子量为29 040，与FC27、K1株之间核苷酸同源性为98.8%，而与IC1、CAMP株之间核苷酸同源性为28.2%。表明脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因与FC27株高度同源性，并发现存在STNS和DTPTATE表位(图4)。应用PC/GENE计算机程序对中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因结构和功能进行分析，发现该基因DNA序列A+T含量为66%；二级结构α螺旋占6%，β折叠和无规则卷曲占93%；氨基酸倾向形成α螺旋和亲水性峰值增强。
讨论
本研究发现中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽。并发现该基因突变及其表达的蛋白质MSP2可能是导致脑型疟昏迷的一种重要的分子病因。通过对该基因同源性分析比较，我国脑型疟患者恶性疟原虫分离株异常基因与FC27株表现出高度同源性。应用PC/GENE计算机程序对该基因DNA序列分析，结果发现A+T含量为66%，与FC27株MSP2一级结构中A+T含量基本一致[5]，并发现存在STNS和DTPTATE表位。二级结构分析表明，氨基酸倾向于形成α螺旋，由于α螺旋构型是T细胞表位所必需的结构[2]，提示该区存在T细胞表位；该区氨基酸亲水性峰值增强，提示该区的抗原性可能具有保护性免疫作用。值得注意的是，恶性疟原虫MSP1分子为单拷贝基因定位第9号染色体，恶性疟原虫MSP2分子亦为单拷贝基因定位第2号染色体，抗MAD20株MSP1分子C端19 000片段的单克隆抗体和免疫血清以及抗FC27株MSP2分子中STNS和DTPTATE表位的单克隆抗体8G10/48和8F6/49，体外均可阻断裂殖子入侵红细胞并抑制其生长。我们已将脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因插入到PWR590质粒的β半乳糖苷酶基因中，构建成含Lac启动子的编码β半乳糖苷酶590个氨基酸残基和脑型疟恶性疟原虫分离株MSP2的重组质粒，并在大肠杆菌中进行了表达，通过Western Blot测定，结果表明获得的蛋白具有免疫原性。
, 百拇医药
本课题为国家教委归国留学人员科研基金资助项目
参考文献
1 边中启，宋关鸿，管惟滨，等.中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因和MSP2基因的分子克隆与鉴定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，1：1-6.
2 边中启，管惟滨，宋关鸿，等.中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因的分子克隆及序列分析.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15：69-75.
3 边中启，汪伟业，王功焯，等.红细胞膜蛋白分子在脑型疟发病中的作用.中华医学杂志，1997，77：618-620.
4 边中启，宋关鸿，张龙兴，等.中国恶性疟原虫MSP1第13—17区基因和MSP2基因的研究.中华传染病杂志，1996，14：214-217.
5 Fenton B, Clark JT, Khan CMA, et al. Structural and antigenic polymorphism of the 35 to 48 Kilodalton merozoite surface antigen (MSA2) of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Mol Cell Biol, 1991, 11:963-968.
(收稿：1997-12-12 修回：1998-02-10)
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单位：200433 上海，第二军医大学寄生虫学教研室(边中启，宋关鸿)，复旦大学遗传学研究所(郑兆鑫)
关键词：疟疾，脑型；疟疾，恶性；克隆，分子；序列分析
中华医学杂志980519
【摘要】 目的 为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供科学依据。方法 应用多聚酶链反应(PCR)对5例中国脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕(CMH/YN)分离株和云南省盈江县农场(CYJ/YN)分离株基因组裂殖子表面蛋白2(MSP2)基因进行扩增，将扩增产物分别经BamHI和Hind Ⅲ双酶切后，回收的MSP2基因分子定向克隆M13mp18和M13mp19载体，按Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并与恶性疟原虫株FC27、K1、IC1和CAMP株进行同源性分析比较。结果 5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽序列，与FC27、K1株之间核苷酸同源性为98.8%，而与IC1、CAMP株之间核苷酸同源性为28.2%。结论 中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因突变及其表达的异常可能是导致脑型疟昏迷的一种重要的分子病因。
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Molecular cloning and sequencing of genes encoding MSP2 isolates strains from two of Plasmodium falciparum from Chinese patients with cerebral malaria. Bian Zhongqi, Song Guanhong, Zheng Zhaoxin. Department of Parasitology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract 】 Objective To provide the scientific evidence for designing safe and effective vaccines of human cerebral malaria. Methods Genomic DNA samples of two isolated Plasmodium falciparum isolate strains prepared directly from 5 cases of cerebral malaria patients′ blood in mengla County, Yunnan Province (CMH/YN) and in Yingjiang County, Yunnan Province (CYJ/YN) were used for polymerase chain reaction (PCR) amplification and the two pairs of oligonucleotides for the highly conserved genes encoding FC27 merozoite surface protein 2 (MSP2) of Papua New Guinea strain of Plasmodium falciparum were used as primers. The PCR products were digested with BamH1 and Hind Ⅲ respectively, and the generated fragment MSP2 were cloned into M13mp18 and M13mp19 vectors and their DNA was analyzed as the templates for DNA sequencing by the dideoxy chain-termination method. Results Compared with the published findings, FC27, K1, IC1 and CAMP sequences, DNA sequences of MSP2 from two isolated CMH/YN and CYJ/YN of Plasmodium falciparum strains from Chinese patients with cerebral malaria contained identical genes composed of 800 bp, encoding 264 amino acid, which were highly homologous up to 98.8% with that of FC27, K1 strain other than the IC1, CAMP strain. Conclusion It is the first record of DNA sequencing of MSP2 determined from two isolated CMH/YN and CYJ/YN of Plasmodium falciparum strains from Chinese patients with cerebral malaria, MSP2 mutation may be one factor leading to the localized cerebral damage which causes clinical coma of human cerebral malaria.
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【Key words 】 Malaria, cerebral Malaria, falciparum Cloning, molecular Sequence analysis
(Natl Med J China, 1998, 78：375-378)
全世界每年疟疾临床发病人数约3～5亿，死亡人数约150～270万，其中有100万的儿童死于脑型疟[1]。因此 ，研究开发安全有效的人脑型疟疫苗控制和消灭疟疾有着重要意义。我们曾报道中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(MSP1)第16～17区基因的分子克隆及序列分析对研究人脑型疟疫苗、阐明脑型疟发病分子机制及其基因诊断和治疗的意义[2]。鉴此，我们进一步报道中国脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕(CMH/YN)分离株和云南省盈江县农场(CYJ/YN)分离株裂殖子表面蛋白2(MSP2)基因的分子克隆及序列测定分析。
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对象和方法
一、对象
5例中国脑型疟患者来自我国流行区。
1.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP1第13～17区基因的电泳分析；2.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP2基因的电泳分析；3.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP1第13～17区基因的电泳分析；4.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP2基因的电泳分析；5.λDNA/HindⅢ+pUC19/Hae Ⅲ标准分子量23 130～174bp；6.为正常人对照
图1 PCR扩增产物
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1.λDNA/Hind Ⅲ+pUC19/Hae Ⅲ标准分子量(同图1)；2.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP1第13～17区基因经EcoRI酶切鉴定；3.中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN分离株MSP2基因经XbaⅠ酶切鉴定；4.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP1第13～17区基因经EcoRI酶切鉴定；5.中国脑型疟患者恶性疟原虫CYJ/YN分离株MSP2基因经XbaⅠ酶切鉴定 图2 PCR产物酶切鉴定
图3 中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因DNA序列分析及其推导的氨基酸序列
二、方法
1.标本采集方法参见文献[1～3]。
2.PCR引物设计合成按文献[1～4]方法。
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3.基因组DNA抽提、PCR扩增和分子克隆及DNA序列测定：按文献[1～4]方法。
4.分子克隆及鉴定：以重组子DNA作为PCR模板，采用MSP2基因原始PCR产物作为对照，参照文献[1，2，4]，应用PCR鉴定阳性分子克隆可获同样结果。
结果
一、PCR产物及酶切鉴定
图4 FC27、K1、IC1和CAMP株与中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2编码基因推导氨基酸序列分析的比较
5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳分析结果见图1；PCR产物经含单一酶切位点XbaⅠ酶切鉴定，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳分析，结果各产生0.62 kb和0.18 kb 2条特定基因带，与预计的MSP2基因大小相一致。这些结果证实PCR产物为中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因(图2)。
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二、DNA测序分析
5例中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp(图3)，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽序列，理论分子量为29 040，与FC27、K1株之间核苷酸同源性为98.8%，而与IC1、CAMP株之间核苷酸同源性为28.2%。表明脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因与FC27株高度同源性，并发现存在STNS和DTPTATE表位(图4)。应用PC/GENE计算机程序对中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因结构和功能进行分析，发现该基因DNA序列A+T含量为66%；二级结构α螺旋占6%，β折叠和无规则卷曲占93%；氨基酸倾向形成α螺旋和亲水性峰值增强。
讨论
本研究发现中国脑型疟患者恶性疟原虫CMH/YN和CYJ/YN分离株MSP2基因之间序列完全相同，全长为800 bp，编码264个氨基酸，中央的串联重复序列含2×32肽。并发现该基因突变及其表达的蛋白质MSP2可能是导致脑型疟昏迷的一种重要的分子病因。通过对该基因同源性分析比较，我国脑型疟患者恶性疟原虫分离株异常基因与FC27株表现出高度同源性。应用PC/GENE计算机程序对该基因DNA序列分析，结果发现A+T含量为66%，与FC27株MSP2一级结构中A+T含量基本一致[5]，并发现存在STNS和DTPTATE表位。二级结构分析表明，氨基酸倾向于形成α螺旋，由于α螺旋构型是T细胞表位所必需的结构[2]，提示该区存在T细胞表位；该区氨基酸亲水性峰值增强，提示该区的抗原性可能具有保护性免疫作用。值得注意的是，恶性疟原虫MSP1分子为单拷贝基因定位第9号染色体，恶性疟原虫MSP2分子亦为单拷贝基因定位第2号染色体，抗MAD20株MSP1分子C端19 000片段的单克隆抗体和免疫血清以及抗FC27株MSP2分子中STNS和DTPTATE表位的单克隆抗体8G10/48和8F6/49，体外均可阻断裂殖子入侵红细胞并抑制其生长。我们已将脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP2基因插入到PWR590质粒的β半乳糖苷酶基因中，构建成含Lac启动子的编码β半乳糖苷酶590个氨基酸残基和脑型疟恶性疟原虫分离株MSP2的重组质粒，并在大肠杆菌中进行了表达，通过Western Blot测定，结果表明获得的蛋白具有免疫原性。
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本课题为国家教委归国留学人员科研基金资助项目
参考文献
1 边中启，宋关鸿，管惟滨，等.中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因和MSP2基因的分子克隆与鉴定.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，1：1-6.
2 边中启，管惟滨，宋关鸿，等.中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因的分子克隆及序列分析.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15：69-75.
3 边中启，汪伟业，王功焯，等.红细胞膜蛋白分子在脑型疟发病中的作用.中华医学杂志，1997，77：618-620.
4 边中启，宋关鸿，张龙兴，等.中国恶性疟原虫MSP1第13—17区基因和MSP2基因的研究.中华传染病杂志，1996，14：214-217.
5 Fenton B, Clark JT, Khan CMA, et al. Structural and antigenic polymorphism of the 35 to 48 Kilodalton merozoite surface antigen (MSA2) of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Mol Cell Biol, 1991, 11:963-968.
(收稿：1997-12-12 修回：1998-02-10)
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