皮质脑梗塞患者的载脂蛋白a分析
作者：张颖冬 梁秀龄
单位：210029 南京医科大学附属脑科医院神经科(张颖冬)；中山医科大学第一附属医院神经科(梁秀龄)
关键词：载脂蛋白A类；基因；脑梗塞
中华医学杂志980511 【摘要】 目的 研究蛋白及分子水平载脂蛋白(a)[apo(a)]多态性与脑梗塞间的联系。方法 对85名健康对照者和42例皮质脑梗塞患者以酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血Lp(a)水平、凝胶电泳(SDS-PAGE)免疫印迹结合银染法检测apo(a)蛋白大小多态性以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)和扩增片段长度多态性(AFLP)方法检测apo(a)基因5′控制区、第一内含子和外显子的序列变异。结果 脑梗塞患者血Lp(a)水平(153±3 mg/L)显著高于对照者(56±4 mg/L)(t=4.15,P<0.001)；患者组中含有B、S1、S2异型的低分子量apo(a)表型频率(52.4%)明显高于对照组(29.4%)；apo(a)基因5′控制区有两位点变异在脑梗塞患者中显著不同于对照人群，与血Lp(a)水平变化有关。结论 证实apo(a)基因5′控制区序列变异对Lp(a)水平变化亦起重要作用，apo(a)基因大小及序列变异与人群易感脑梗塞有关。
, 百拇医药
Apolipoprotein(a) and cortical cerebral infarction * Zhang Yingdong, Liang Xiuling.* Department of Neurology, Brain Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To elucidate the correlation of apolipoprotein(a)[apo(a)] with cerebral infarction at the level of molecule and protein. Methods The serum Lp(a) level, by means of ELISA, the polymorphism of apo(a) protein, by SDS-PAGE/Western blotting combined with silver staining assays, and the sequence polymorphism in 5′ control region, the first exon and intron of apo(a) gene, by PCR-SSCP/AFLP assays, were detected in 85 healthy controls and 42 cases of cortical cerebral infarction. Results The serum Lp(a) level was remarkadly higher in the patients(153±3 mg/L)than that in the controls(56±4 mg/L)(t =4.15, P <0.001), even in the subjects with the same apo(a) phenotype. The allele frequency of low molecular weight phenotype containing B, S1 and S2 isoforms was also significantly higher in the patients than that in the controls (0.5238 vs. 0.2941). There were 2 sites of sequence variance in the 5′ control region of apo(a) gene in the studied population, which were of significant difference between the patients and controls, and were related to the variation of serum Lp(a) level. Conclusion On the basis of proving further the risk of high serum Lp(a) level for AS event, we found that the low molecular weight phenotype of apo(a) is closely associated with cerebral infarction. The variation of serum Lp(a) level is also related to the sequence of apo(a) gene, indicating that both the size and sequence of apo(a) are associated with the susceptibility to cerebral infarction due to its impact on serum Lp(a) level.
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【Key words】 Apolipoprotein(a) Gene Cerebral infarction
(Natl Med J China, 1998, 78：350-353)
为了解中国人Lp(a)水平、apo(a)蛋白多态性和apo(a)基因序列多态性，探讨这些因素与动脉粥样硬化(AS)所致皮质脑梗塞间的联系，以阐明载脂蛋白导致AS性疾病的分子机制。
对象与方法
一、对象
根据WHO的卒中诊断标准和头颅CT(或MRI)表现，并排除栓塞性、感染性、灌注不足及遗传性等因素致病可能性，连续收集住院的皮质动脉区脑梗塞患者42例，男21例，女21例，平均年龄67±10岁，其中25例伴有高血压；同时选择收集无心脑血管病、糖尿病、肝肾疾病、肿瘤、炎症及血液病等无血缘关系的健康体检者85名作为对照组，男38例，女47例，平均年龄48±13岁。
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二、方法
1.血Lp(a)水平测定：采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法(试剂盒购于南京军区南京总医院生化科)。
2.apo(a)表型的检测[1，2]：采用凝胶电泳(SDS-PAGE)免疫印迹结合银染法。取受试血清20 μl以巯基乙醇处理后，两次上样至不连续SDS聚丙酰胺垂直凝胶(6.6%分离胶和3.6%浓缩胶)左右两侧，同时以apoB100(分子量约500 000)及高分子系列标准(分子量67 000～669 000，Pharmacia公司产品)作为分子量标准上样电泳。取半侧凝胶以醋酸固定后采用硝酸银染色；另半侧凝胶进行Western转膜至硝酸纤维膜上。对其封闭处理后，以抗apo(a)抗体-辣根过氧化物(南京军区南京总医院生化科庄一义主任馈赠)免疫标定、显色。由于银染技术检测阳性率较高，所以根据免疫印迹显色带定位，再以银染显色带判定apo(a)异构型。受试血apo(a)蛋白表型，按Utermann分型[3]将apo(a)异型分为F、B、S1～4型以及未显带的0型。
, 百拇医药
3.apo(a)基因序列多态性的检测：采用聚合酶联反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)及(PCR-AFLP)对apo(a)基因各位点序列变异进行分析。采集受试者静脉血白细胞，以酚抽法提取基因组DNA。实验用5对PCR寡核苷酸引物序列(表1)，PCR 2和PCR 4引物是根据apo(a)基因文库[4，5]及目的扩增区自行设计，另3对引物则引自相应文献[6](均由中国科学院上海细胞生物学研究所合成)。
表1 apo(a)基因5对寡核苷酸引物
引物
序 列
退火
温度(℃)
PCR1
, 百拇医药
5′-TGACATTGCACTCTCAAATATTTTA-3′
55
CATATACAAGATTTTGAACTGGGAA
PCR2
AAAGGCAATGTGGAGCAGCT
56
TGGCCAGCAGTGCCCAGAA
PCR3
GAATTCATTTGCGGAAAGATTG
60
CTTCAACCGGGGTGAGAGTCTC
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PCR4
GCACAGACCCTCATGGATT
57
CTGCAGCAACCTCAATTGT
PCR5
TTGGTCATCTATGACACCACATCAA
68
GGCTCGGTTGATTTCATTTTTCAGC
以PE 9 600型PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司)对以上5对引物分别进行PCR热循环扩增反应(dNTP 2 mmol/L，Promega公司;TaqDNA聚合酶5U/μl,华美生物工程公司)。以0.8%～1%琼酯糖凝胶电泳及溴乙锭染色鉴定PCR扩增情况。
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取PCR 1、2、4和5(其中PCR 5扩增产物先以限制酶HaeⅢ进行酶切)扩增产物，按Orita方法[7]以95%甲酰胺变性后，上样8%非变性聚丙酰胺凝胶(Acr∶Bis为49∶1)，进行单链构象多态性(SSCP)分析；对PCR 3扩增产物上样尿素变性的10%聚丙酰胺凝胶(Acr∶Bis为19∶1)，以pGEM-3Zf(+)HaeⅢ DNA作为分子量参照物，垂直电泳、银染后，采用Turbo Basic 1.0版本软件计算出PCR 3扩增片段的bp数。PCR 3扩增片段内含TTTTA序列的PNR数为：(PCR 3扩增片段bp数-56)/5。
三、统计学：
对所得资料以Student′s t检验、χ2检验、Odds Ratio比数比分析、相关回归分析以及非参数Kruskal-Wallis检验等方法统计学处理；在评估apo(a)基因序列对Lp(a)水平影响作用时，首先要排除apo(a)蛋白大小对Lp(a)的影响值，根据0等位基因频率，得出0型与其它apo(a)异型杂合可能性，以计算出各apo(a)蛋白异型相应的Lp(a)水平的理论值，实际值与理论值之差即代表影响值[ΔLp(a)]。
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结果
一、血Lp(a)水平与脑梗塞
血Lp(a)水平分布在对照人群呈趋于低值的正偏态分布，而在患者组无一定规律。患者组血Lp(a)水平(154±3 mg/L)要显著高于对照组(56±4 mg/L)(t=4.15，P<0.001)；当受试者血Lp(a)水平高于其在健康人群的第95%位数(209.8 mg/L)时，患者组有32人，对照组有16人，脑梗塞发病危险性增加4.74倍(95%可信限：2.16～10.44)。患者组中是否伴有高血压，血Lp(a)水平(127±4 vs.198±3 mg/L)差异无显著性意义(t=1.13，P>0.1)。且脑梗塞患者血Lp(a)水平与血糖、甘油三酯和总胆固醇水平无明显相关性；以高低Lp(a)水平(以209.8 mg/L为界)者间，这些指标亦无明显差别。
二、apo(a)蛋白多态性与脑梗塞
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本实验受试者中共发现15种apo(a)蛋白表型，包括B、S1、S2、S3、S4纯合型及两两杂合型，未发现有F异型(见图1)。根据apo(a)蛋白各异型泳动率，计算得出apo(a)异型B、S1、S2、S3和S4分子量分别为485 000、540 000、615 000、690 000和755 000，以此为蛋白表型分子量与血Lp(a)水平的对数值作相关分析得出，对照组及患者组受试者apo(a)蛋白表型均与其Lp(a)水平显著负相关，相关系数分别为-0.831和-0.873(均P<0.001)。
SOD-PAGE/Western印迹 SDS-PAGE/银染
图1 apo(a)蛋白表型检测结果
比较两组受试者不同apo(a)表型间血Lp(a)水平显示有显著差别，但两组中临近apo(a)表型者间血Lp(a)水平有交叉现象；而且，在相同apo(a)表型的两组受试者间，血Lp(a)水平亦有明显差别(见表2)。
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表2 两组受试者各apo(a)表型血Lp(a)水平(mg/L，x±s)
组别
例数
apo(a)表型
B
S1
S2
S3
S4
对照组
55
, http://www.100md.com 480
±38
290
±80
221
±29
114
±23
38
±25
试验组
29
553
, 百拇医药 ±39
392
±21
319
±28
164
±30
79
±38
t值
0.09
2.23
7.42
, 百拇医药 4.06
3.87
P值
>0.5
<0.05
<0.001
<0.001
<0.001
各主要单带纯合的apo(a)表型分布频率两组间差异无显著性意义(χ2=6.253，P>0.5)；且以双带型和单带型比较两组受试者apo(a)表型分布频率差异亦无显著性意义(χ2=0.053，P>0.9)。
而将含有B、S1和S2异型的所有apo(a)表型作为低分子量apo(a)蛋白表型，而仅含有S3、S4及0异型的作为高分子量apo(a)蛋白表型，则两组受试者间，高、低分子量apo(a)表型分布频率差异有显著性意义，且脑梗塞发病危险性的比数比(OR)分析，低分子量者为高分子量者的2.64倍(95%可信限：1.24～5.61)。无论高、低分子量apo(a)表型，患者组血Lp(a)水平均显著高于对照组(见表3)。
, 百拇医药
表3 两组受试者高、低分子量apo(a)表型分布
及其相应血Lp(a)水平(mg/L，x±s) 组别
例数
高分子量
apo(a)表型
例数
低分子量
apo(a)表型
对照组
60
46±39
25
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274±114
患者组
20
94±66△
22
365± 74*
两组apo(a)表型分布比较，χ2=6.362，P<0.025；与对照组比较，△ P<0.005，* P<0.001
三、apo(a)基因序列多态性与脑梗塞
PCR 1扩增产物的SSCP分析，可见有2种泳动明显不同的条带(见图2)，根据电泳带泳动距离的近远，分别称为α和β型；PCR 3扩增产物片段长度多态性分析得出PNR数有6～11次，以两带杂合或单带出现(图3)；而对PCR 2、PCR 4和PCR 5扩增产物的SSCP分析未见多态现象。
, 百拇医药
对照组中α和β型分别为66(77.6%)和19(22.4%)名，而患者组相应为19(45.2%)和23
图2 PCR1-SSCP分析结果
(54.8%)例，β型频率在患者中明显高于对照组(χ2=13.34，P<0.005)；β型危险度OR值为4.20(95%可信限：1.94～9.10)。相应，两组内β型携带者ΔLp(a)值(对照组及患者组分别为22.7±49.4和69.1±37.5 mg/L)均高于α型者(对照组及患者组分别为-14.1±28.4和33.8±33.8 mg/L)(α与β型比较，对照组，t＝3.90，P<0.001；患者组，t＝3.17，P<0.005)，且患者组β型者ΔLp(a)值亦显著对照组此型者(t＝3.46，P<0.002)，α型者亦然(t＝6.20，P<0.001)。
, 百拇医药
图3 PCR3-AFLP显示PNR重复次数泳带
两组受试者PNR基因型包括有PNR-6、7、8、9、10和11次的纯合型及杂合型，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(对照组∑χ2＝21.9，df＝15，P>0.1；患者组∑χ2＝21.86，df＝15，P>0.1)。两受试组PNR等位基因频率均以PNR-8最高，PNR-9次之，其等位基因频率(见表4)。两组间最常见的PNR基因型8/8和9/9频率无明显差别(χ2＝0.18，P>0.5)。但是，由不同数目PNR构成的杂合PNR基因型频率在患者组中(29例，69.1%)要显著多于对照组(43名，50.5%)(χ2＝3.9，P<0.05)，且患者组相应ΔLp(a)值(55±42 mg/L)亦显著高于对照组(-9.74±39.5 mg/L)(t＝6.66，P<0.001)。
表4 apo(a)PNR等位基因频率
, 百拇医药
组别
例数
等位基因
PNR-6
PNR-7
PNR-8
PNR-9
PNR-10
PNR-11
对照组
42
0.0770
0.0415
, 百拇医药
0.5520
0.1820
0.1355
0.0120
患者组
13
0.0595
0.0240
0.4760
0.2588
0.1070
0.0480
对纯合型PNR基因型受试者的ΔLp(a)值比较可见，随PNR数目增多，ΔLp(a)值降低(见表5)。
, 百拇医药
表5 各纯合型PNR基因型相应ΔLp(a)值(mg/L)
组别
例数
基因型
1/6
7/7
8/8
9/9
10/10
11/11
对照组*
42
, 百拇医药
107.00…
1.01
-15.50
-46.47…
患者组
13……
52.26
53…
0.6
* Kruskal-Wallis检验，P<0.05
讨论
对由AS致病的皮质脑梗塞研究表明，患者血Lp(a)水平较健康对照者显著高，且血Lp(a)水平高于所谓正常高界时，脑梗塞发病危险性增加4.74倍，进一步从临床证实高水平Lp(a)是动脉粥样硬化性脑梗塞的危险因素，且Lp(a)水平与血糖、脂质水平与高血压无关。
, 百拇医药
Utermann等[3]最早以SDS-PAGE/Western印迹法检测出人群apo(a)蛋白有F、B及S1～46种异型。apo(a)蛋白大小多态性及分子水平研究表明，apo(a)基因中kringle4编码序列多少决定了apo(a)蛋白大小，以负相关形式决定血Lp(a)水平高低。我们对皮质脑梗塞患者研究显示，决定高水平血Lp(a)的低分子量apo(a)表型频率要显著高于健康人群，且相应表型携带者的脑梗塞发病危险性明显高，表明决定此蛋白大小的apo(a)基因大小多态性与AS性脑梗塞发病有关。
本研究中还发现，即使相同apo(a)表型间，患者Lp(a)水平亦显著高于对照者，不同apo(a)表型间Lp(a)水平有交叉。此现象提示，除apo(a)基因大小多态性决定血Lp(a)水平以外，尚有其它因素影响Lp(a)水平。为此我们对apo(a)基因序列，主要是5'控制区及第一外显子和内含子序列多态性对Lp(a)水平影响及与脑梗塞发病关联进行研究。在基因5′控制区第一个翻译启动码ATG上游+914位有单碱基A/G变异[6]。本实验对此片段DNA序列检测得出有两种泳动明显不同的单链构象带型：α和β型，其中在脑梗塞患者中β型SSCP明显多于健康对照者，且全部受试者中β型携带者相应的ΔLp(a)值均高于α型携带者，提示β型SSCP的碱基变异可致机体高水平血Lp(a)，从而与脑梗塞发病密切关联，即β型SSCP携带者的脑梗塞发病危险性是α型者的4.2倍。因未对此部分序列测序，所以尚不明确为何种碱基变异。比较两组受试者值还发现，无论α型还是β型SSCP携带者相应患者的ΔLp(a)值均显著高于对照者，似表明除此位点的SSCP外，尚有其它因素影响着血Lp(a)水平。Apo(a)基因5′控制区上游有一6～11次TTTTA五核苷酸(PNR)重复序列[7]。在本研究受试患者中检测此PNR多态性以PNR-8的等位基因频率最高，9、10次之，同时也发现随PNR次数增加ΔLp(a)值有下降趋势；且患者中杂合PNR基因型频率要显著多于对照组，相应患者的ΔLp(a)值亦明显高于对照者。由于其PNR基因型分布不均，所以不能明确此PNR等位基因除其重复次数多少对血Lp(a)水平有影响外，此纯合或杂合基因型对Lp(a)水平是否有不同程度的作用。约14%人群中的apo(a)基因5'控制区第一翻译启动码ATG上游+49位点有碱基C/T变异现象，此位点碱基为T时，基因翻译效能下降约60%。但在本研究中对此PCR 3(扩增片段为251 bp)的SSCP分析未发现有单链构象多态泳带，似表明中国人群中并无此位点的碱基变异，对此尚需扩大检测人群确定。另外，与Cohen等[6]结论不同，我们对kringle4第一内含子序列PCR-SSCP分析并未发现有单链构象不同现象。同时亦未发现kringle 4第一外显子序列(扩增片断为401 bp)有SSCP现象。
, 百拇医药
本研究结果在进一步证实高水平血Lp(a)是AS性脑梗塞危险因素的基础上，发现脑梗塞与决定Lp(a)高水平的低分子量apo(a)表型密切关联，同时最先在脑梗塞患者中证实血Lp(a)水平变化亦与apo(a)基因5′控制区序列变异有关，表明apo(a)基因在大小及序列多态性上与人群易感脑梗塞有关。
本课题为国家及广东省博士后科学研究基金资助项目
参考文献
1 李建军，庄一义，汪俊军. 人血清载脂蛋白(a)的多态性. 中华医学检验杂志. 1994，17：22-25.
2 郭尧君.SDS电泳技术的实验参考及最新进展. 生物化学与生物物理进展，1992，18：32-37.
3 Utermann G, Menzel HJ, Duba HC, et al. Lp(a) glycoprotein phenotypes. Inheritances and relation to Lp(a)-lipoprotein concentration in plasma. J Clin Invest, 1987, 80：458-465.
, 百拇医药
4 Mclean JW, Tomlinson JE, Kuang WJ, et al. cDNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen. Nature, 1987, 330：132-137.
5 Wade DP, Clarke JG, Lindahl GE, et al. 5′Control regions of the apolipoprotein(a) gene and numbers of the related plasminogen gene family. Proc Natl Acad Sci USA, 1993，90：1369-1373.
6 Cohen JC, Chiesa G, Hobbs HH. Sequence polymorphism in apolipoprotein(a) gene: Evidence for dissociation between apolipoprotein(a) size and plasma lipoprotein(a) levels. J Clin Invest, 1993，91：1630-1636.
7 Trommsdorff M, Kochl S, Lingenhel A, et al. A pentanucleotide repeat polymorphism in the 5′ control region of the apolipoprotein(a) gene is associated with lipoprotein(a) plasma concentration in Causasians. J Clin Invest, 1995，96：150-157.
(收稿：1997-04-11 修回：1997-11-25)
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中华医学杂志980511 【摘要】 目的 研究蛋白及分子水平载脂蛋白(a)[apo(a)]多态性与脑梗塞间的联系。方法 对85名健康对照者和42例皮质脑梗塞患者以酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血Lp(a)水平、凝胶电泳(SDS-PAGE)免疫印迹结合银染法检测apo(a)蛋白大小多态性以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)和扩增片段长度多态性(AFLP)方法检测apo(a)基因5′控制区、第一内含子和外显子的序列变异。结果 脑梗塞患者血Lp(a)水平(153±3 mg/L)显著高于对照者(56±4 mg/L)(t=4.15,P<0.001)；患者组中含有B、S1、S2异型的低分子量apo(a)表型频率(52.4%)明显高于对照组(29.4%)；apo(a)基因5′控制区有两位点变异在脑梗塞患者中显著不同于对照人群，与血Lp(a)水平变化有关。结论 证实apo(a)基因5′控制区序列变异对Lp(a)水平变化亦起重要作用，apo(a)基因大小及序列变异与人群易感脑梗塞有关。
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Apolipoprotein(a) and cortical cerebral infarction * Zhang Yingdong, Liang Xiuling.* Department of Neurology, Brain Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To elucidate the correlation of apolipoprotein(a)[apo(a)] with cerebral infarction at the level of molecule and protein. Methods The serum Lp(a) level, by means of ELISA, the polymorphism of apo(a) protein, by SDS-PAGE/Western blotting combined with silver staining assays, and the sequence polymorphism in 5′ control region, the first exon and intron of apo(a) gene, by PCR-SSCP/AFLP assays, were detected in 85 healthy controls and 42 cases of cortical cerebral infarction. Results The serum Lp(a) level was remarkadly higher in the patients(153±3 mg/L)than that in the controls(56±4 mg/L)(t =4.15, P <0.001), even in the subjects with the same apo(a) phenotype. The allele frequency of low molecular weight phenotype containing B, S1 and S2 isoforms was also significantly higher in the patients than that in the controls (0.5238 vs. 0.2941). There were 2 sites of sequence variance in the 5′ control region of apo(a) gene in the studied population, which were of significant difference between the patients and controls, and were related to the variation of serum Lp(a) level. Conclusion On the basis of proving further the risk of high serum Lp(a) level for AS event, we found that the low molecular weight phenotype of apo(a) is closely associated with cerebral infarction. The variation of serum Lp(a) level is also related to the sequence of apo(a) gene, indicating that both the size and sequence of apo(a) are associated with the susceptibility to cerebral infarction due to its impact on serum Lp(a) level.
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【Key words】 Apolipoprotein(a) Gene Cerebral infarction
(Natl Med J China, 1998, 78：350-353)
为了解中国人Lp(a)水平、apo(a)蛋白多态性和apo(a)基因序列多态性，探讨这些因素与动脉粥样硬化(AS)所致皮质脑梗塞间的联系，以阐明载脂蛋白导致AS性疾病的分子机制。
对象与方法
一、对象
根据WHO的卒中诊断标准和头颅CT(或MRI)表现，并排除栓塞性、感染性、灌注不足及遗传性等因素致病可能性，连续收集住院的皮质动脉区脑梗塞患者42例，男21例，女21例，平均年龄67±10岁，其中25例伴有高血压；同时选择收集无心脑血管病、糖尿病、肝肾疾病、肿瘤、炎症及血液病等无血缘关系的健康体检者85名作为对照组，男38例，女47例，平均年龄48±13岁。
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二、方法
1.血Lp(a)水平测定：采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法(试剂盒购于南京军区南京总医院生化科)。
2.apo(a)表型的检测[1，2]：采用凝胶电泳(SDS-PAGE)免疫印迹结合银染法。取受试血清20 μl以巯基乙醇处理后，两次上样至不连续SDS聚丙酰胺垂直凝胶(6.6%分离胶和3.6%浓缩胶)左右两侧，同时以apoB100(分子量约500 000)及高分子系列标准(分子量67 000～669 000，Pharmacia公司产品)作为分子量标准上样电泳。取半侧凝胶以醋酸固定后采用硝酸银染色；另半侧凝胶进行Western转膜至硝酸纤维膜上。对其封闭处理后，以抗apo(a)抗体-辣根过氧化物(南京军区南京总医院生化科庄一义主任馈赠)免疫标定、显色。由于银染技术检测阳性率较高，所以根据免疫印迹显色带定位，再以银染显色带判定apo(a)异构型。受试血apo(a)蛋白表型，按Utermann分型[3]将apo(a)异型分为F、B、S1～4型以及未显带的0型。
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3.apo(a)基因序列多态性的检测：采用聚合酶联反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)及(PCR-AFLP)对apo(a)基因各位点序列变异进行分析。采集受试者静脉血白细胞，以酚抽法提取基因组DNA。实验用5对PCR寡核苷酸引物序列(表1)，PCR 2和PCR 4引物是根据apo(a)基因文库[4，5]及目的扩增区自行设计，另3对引物则引自相应文献[6](均由中国科学院上海细胞生物学研究所合成)。
表1 apo(a)基因5对寡核苷酸引物
引物
序 列
退火
温度(℃)
PCR1
, 百拇医药
5′-TGACATTGCACTCTCAAATATTTTA-3′
55
CATATACAAGATTTTGAACTGGGAA
PCR2
AAAGGCAATGTGGAGCAGCT
56
TGGCCAGCAGTGCCCAGAA
PCR3
GAATTCATTTGCGGAAAGATTG
60
CTTCAACCGGGGTGAGAGTCTC
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PCR4
GCACAGACCCTCATGGATT
57
CTGCAGCAACCTCAATTGT
PCR5
TTGGTCATCTATGACACCACATCAA
68
GGCTCGGTTGATTTCATTTTTCAGC
以PE 9 600型PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司)对以上5对引物分别进行PCR热循环扩增反应(dNTP 2 mmol/L，Promega公司;TaqDNA聚合酶5U/μl,华美生物工程公司)。以0.8%～1%琼酯糖凝胶电泳及溴乙锭染色鉴定PCR扩增情况。
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取PCR 1、2、4和5(其中PCR 5扩增产物先以限制酶HaeⅢ进行酶切)扩增产物，按Orita方法[7]以95%甲酰胺变性后，上样8%非变性聚丙酰胺凝胶(Acr∶Bis为49∶1)，进行单链构象多态性(SSCP)分析；对PCR 3扩增产物上样尿素变性的10%聚丙酰胺凝胶(Acr∶Bis为19∶1)，以pGEM-3Zf(+)HaeⅢ DNA作为分子量参照物，垂直电泳、银染后，采用Turbo Basic 1.0版本软件计算出PCR 3扩增片段的bp数。PCR 3扩增片段内含TTTTA序列的PNR数为：(PCR 3扩增片段bp数-56)/5。
三、统计学：
对所得资料以Student′s t检验、χ2检验、Odds Ratio比数比分析、相关回归分析以及非参数Kruskal-Wallis检验等方法统计学处理；在评估apo(a)基因序列对Lp(a)水平影响作用时，首先要排除apo(a)蛋白大小对Lp(a)的影响值，根据0等位基因频率，得出0型与其它apo(a)异型杂合可能性，以计算出各apo(a)蛋白异型相应的Lp(a)水平的理论值，实际值与理论值之差即代表影响值[ΔLp(a)]。
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结果
一、血Lp(a)水平与脑梗塞
血Lp(a)水平分布在对照人群呈趋于低值的正偏态分布，而在患者组无一定规律。患者组血Lp(a)水平(154±3 mg/L)要显著高于对照组(56±4 mg/L)(t=4.15，P<0.001)；当受试者血Lp(a)水平高于其在健康人群的第95%位数(209.8 mg/L)时，患者组有32人，对照组有16人，脑梗塞发病危险性增加4.74倍(95%可信限：2.16～10.44)。患者组中是否伴有高血压，血Lp(a)水平(127±4 vs.198±3 mg/L)差异无显著性意义(t=1.13，P>0.1)。且脑梗塞患者血Lp(a)水平与血糖、甘油三酯和总胆固醇水平无明显相关性；以高低Lp(a)水平(以209.8 mg/L为界)者间，这些指标亦无明显差别。
二、apo(a)蛋白多态性与脑梗塞
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本实验受试者中共发现15种apo(a)蛋白表型，包括B、S1、S2、S3、S4纯合型及两两杂合型，未发现有F异型(见图1)。根据apo(a)蛋白各异型泳动率，计算得出apo(a)异型B、S1、S2、S3和S4分子量分别为485 000、540 000、615 000、690 000和755 000，以此为蛋白表型分子量与血Lp(a)水平的对数值作相关分析得出，对照组及患者组受试者apo(a)蛋白表型均与其Lp(a)水平显著负相关，相关系数分别为-0.831和-0.873(均P<0.001)。
SOD-PAGE/Western印迹 SDS-PAGE/银染
图1 apo(a)蛋白表型检测结果
比较两组受试者不同apo(a)表型间血Lp(a)水平显示有显著差别，但两组中临近apo(a)表型者间血Lp(a)水平有交叉现象；而且，在相同apo(a)表型的两组受试者间，血Lp(a)水平亦有明显差别(见表2)。
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表2 两组受试者各apo(a)表型血Lp(a)水平(mg/L，x±s)
组别
例数
apo(a)表型
B
S1
S2
S3
S4
对照组
55
, http://www.100md.com 480
±38
290
±80
221
±29
114
±23
38
±25
试验组
29
553
, 百拇医药 ±39
392
±21
319
±28
164
±30
79
±38
t值
0.09
2.23
7.42
, 百拇医药 4.06
3.87
P值
>0.5
<0.05
<0.001
<0.001
<0.001
各主要单带纯合的apo(a)表型分布频率两组间差异无显著性意义(χ2=6.253，P>0.5)；且以双带型和单带型比较两组受试者apo(a)表型分布频率差异亦无显著性意义(χ2=0.053，P>0.9)。
而将含有B、S1和S2异型的所有apo(a)表型作为低分子量apo(a)蛋白表型，而仅含有S3、S4及0异型的作为高分子量apo(a)蛋白表型，则两组受试者间，高、低分子量apo(a)表型分布频率差异有显著性意义，且脑梗塞发病危险性的比数比(OR)分析，低分子量者为高分子量者的2.64倍(95%可信限：1.24～5.61)。无论高、低分子量apo(a)表型，患者组血Lp(a)水平均显著高于对照组(见表3)。
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表3 两组受试者高、低分子量apo(a)表型分布
及其相应血Lp(a)水平(mg/L，x±s) 组别
例数
高分子量
apo(a)表型
例数
低分子量
apo(a)表型
对照组
60
46±39
25
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274±114
患者组
20
94±66△
22
365± 74*
两组apo(a)表型分布比较，χ2=6.362，P<0.025；与对照组比较，△ P<0.005，* P<0.001
三、apo(a)基因序列多态性与脑梗塞
PCR 1扩增产物的SSCP分析，可见有2种泳动明显不同的条带(见图2)，根据电泳带泳动距离的近远，分别称为α和β型；PCR 3扩增产物片段长度多态性分析得出PNR数有6～11次，以两带杂合或单带出现(图3)；而对PCR 2、PCR 4和PCR 5扩增产物的SSCP分析未见多态现象。
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对照组中α和β型分别为66(77.6%)和19(22.4%)名，而患者组相应为19(45.2%)和23
图2 PCR1-SSCP分析结果
(54.8%)例，β型频率在患者中明显高于对照组(χ2=13.34，P<0.005)；β型危险度OR值为4.20(95%可信限：1.94～9.10)。相应，两组内β型携带者ΔLp(a)值(对照组及患者组分别为22.7±49.4和69.1±37.5 mg/L)均高于α型者(对照组及患者组分别为-14.1±28.4和33.8±33.8 mg/L)(α与β型比较，对照组，t＝3.90，P<0.001；患者组，t＝3.17，P<0.005)，且患者组β型者ΔLp(a)值亦显著对照组此型者(t＝3.46，P<0.002)，α型者亦然(t＝6.20，P<0.001)。
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图3 PCR3-AFLP显示PNR重复次数泳带
两组受试者PNR基因型包括有PNR-6、7、8、9、10和11次的纯合型及杂合型，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(对照组∑χ2＝21.9，df＝15，P>0.1；患者组∑χ2＝21.86，df＝15，P>0.1)。两受试组PNR等位基因频率均以PNR-8最高，PNR-9次之，其等位基因频率(见表4)。两组间最常见的PNR基因型8/8和9/9频率无明显差别(χ2＝0.18，P>0.5)。但是，由不同数目PNR构成的杂合PNR基因型频率在患者组中(29例，69.1%)要显著多于对照组(43名，50.5%)(χ2＝3.9，P<0.05)，且患者组相应ΔLp(a)值(55±42 mg/L)亦显著高于对照组(-9.74±39.5 mg/L)(t＝6.66，P<0.001)。
表4 apo(a)PNR等位基因频率
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组别
例数
等位基因
PNR-6
PNR-7
PNR-8
PNR-9
PNR-10
PNR-11
对照组
42
0.0770
0.0415
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0.5520
0.1820
0.1355
0.0120
患者组
13
0.0595
0.0240
0.4760
0.2588
0.1070
0.0480
对纯合型PNR基因型受试者的ΔLp(a)值比较可见，随PNR数目增多，ΔLp(a)值降低(见表5)。
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表5 各纯合型PNR基因型相应ΔLp(a)值(mg/L)
组别
例数
基因型
1/6
7/7
8/8
9/9
10/10
11/11
对照组*
42
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107.00…
1.01
-15.50
-46.47…
患者组
13……
52.26
53…
0.6
* Kruskal-Wallis检验，P<0.05
讨论
对由AS致病的皮质脑梗塞研究表明，患者血Lp(a)水平较健康对照者显著高，且血Lp(a)水平高于所谓正常高界时，脑梗塞发病危险性增加4.74倍，进一步从临床证实高水平Lp(a)是动脉粥样硬化性脑梗塞的危险因素，且Lp(a)水平与血糖、脂质水平与高血压无关。
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Utermann等[3]最早以SDS-PAGE/Western印迹法检测出人群apo(a)蛋白有F、B及S1～46种异型。apo(a)蛋白大小多态性及分子水平研究表明，apo(a)基因中kringle4编码序列多少决定了apo(a)蛋白大小，以负相关形式决定血Lp(a)水平高低。我们对皮质脑梗塞患者研究显示，决定高水平血Lp(a)的低分子量apo(a)表型频率要显著高于健康人群，且相应表型携带者的脑梗塞发病危险性明显高，表明决定此蛋白大小的apo(a)基因大小多态性与AS性脑梗塞发病有关。
本研究中还发现，即使相同apo(a)表型间，患者Lp(a)水平亦显著高于对照者，不同apo(a)表型间Lp(a)水平有交叉。此现象提示，除apo(a)基因大小多态性决定血Lp(a)水平以外，尚有其它因素影响Lp(a)水平。为此我们对apo(a)基因序列，主要是5'控制区及第一外显子和内含子序列多态性对Lp(a)水平影响及与脑梗塞发病关联进行研究。在基因5′控制区第一个翻译启动码ATG上游+914位有单碱基A/G变异[6]。本实验对此片段DNA序列检测得出有两种泳动明显不同的单链构象带型：α和β型，其中在脑梗塞患者中β型SSCP明显多于健康对照者，且全部受试者中β型携带者相应的ΔLp(a)值均高于α型携带者，提示β型SSCP的碱基变异可致机体高水平血Lp(a)，从而与脑梗塞发病密切关联，即β型SSCP携带者的脑梗塞发病危险性是α型者的4.2倍。因未对此部分序列测序，所以尚不明确为何种碱基变异。比较两组受试者值还发现，无论α型还是β型SSCP携带者相应患者的ΔLp(a)值均显著高于对照者，似表明除此位点的SSCP外，尚有其它因素影响着血Lp(a)水平。Apo(a)基因5′控制区上游有一6～11次TTTTA五核苷酸(PNR)重复序列[7]。在本研究受试患者中检测此PNR多态性以PNR-8的等位基因频率最高，9、10次之，同时也发现随PNR次数增加ΔLp(a)值有下降趋势；且患者中杂合PNR基因型频率要显著多于对照组，相应患者的ΔLp(a)值亦明显高于对照者。由于其PNR基因型分布不均，所以不能明确此PNR等位基因除其重复次数多少对血Lp(a)水平有影响外，此纯合或杂合基因型对Lp(a)水平是否有不同程度的作用。约14%人群中的apo(a)基因5'控制区第一翻译启动码ATG上游+49位点有碱基C/T变异现象，此位点碱基为T时，基因翻译效能下降约60%。但在本研究中对此PCR 3(扩增片段为251 bp)的SSCP分析未发现有单链构象多态泳带，似表明中国人群中并无此位点的碱基变异，对此尚需扩大检测人群确定。另外，与Cohen等[6]结论不同，我们对kringle4第一内含子序列PCR-SSCP分析并未发现有单链构象不同现象。同时亦未发现kringle 4第一外显子序列(扩增片断为401 bp)有SSCP现象。
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本研究结果在进一步证实高水平血Lp(a)是AS性脑梗塞危险因素的基础上，发现脑梗塞与决定Lp(a)高水平的低分子量apo(a)表型密切关联，同时最先在脑梗塞患者中证实血Lp(a)水平变化亦与apo(a)基因5′控制区序列变异有关，表明apo(a)基因在大小及序列多态性上与人群易感脑梗塞有关。
本课题为国家及广东省博士后科学研究基金资助项目
参考文献
1 李建军，庄一义，汪俊军. 人血清载脂蛋白(a)的多态性. 中华医学检验杂志. 1994，17：22-25.
2 郭尧君.SDS电泳技术的实验参考及最新进展. 生物化学与生物物理进展，1992，18：32-37.
3 Utermann G, Menzel HJ, Duba HC, et al. Lp(a) glycoprotein phenotypes. Inheritances and relation to Lp(a)-lipoprotein concentration in plasma. J Clin Invest, 1987, 80：458-465.
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4 Mclean JW, Tomlinson JE, Kuang WJ, et al. cDNA sequence of human apolipoprotein(a) is homologous to plasminogen. Nature, 1987, 330：132-137.
5 Wade DP, Clarke JG, Lindahl GE, et al. 5′Control regions of the apolipoprotein(a) gene and numbers of the related plasminogen gene family. Proc Natl Acad Sci USA, 1993，90：1369-1373.
6 Cohen JC, Chiesa G, Hobbs HH. Sequence polymorphism in apolipoprotein(a) gene: Evidence for dissociation between apolipoprotein(a) size and plasma lipoprotein(a) levels. J Clin Invest, 1993，91：1630-1636.
7 Trommsdorff M, Kochl S, Lingenhel A, et al. A pentanucleotide repeat polymorphism in the 5′ control region of the apolipoprotein(a) gene is associated with lipoprotein(a) plasma concentration in Causasians. J Clin Invest, 1995，96：150-157.
(收稿：1997-04-11 修回：1997-11-25)
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