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编号:10238239
维甲酸诱导HL-60细胞Fas蛋白表达
http://www.100md.com 《中华血液学杂志》 1998年第5期
     作者:曾辉 赵相印 马雅銮 赵如冰 杨敏 张勇 刘复强 高天祥

    单位:

    关键词:细胞凋亡;维甲酸;细胞系,HL-60;基因,fas

    中华血液学杂志980504 摘要 目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸(9-cis RA)对HL-60细胞Fas表达水平及维甲酸对抗Fas抗体诱导的细胞凋亡敏感性的影响。方法:用流式细胞仪检测HL-60细胞膜Fas蛋白表达水平;分别采用形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪检测抗Fas抗体诱导的细胞凋亡。结果:HL-60细胞Fas弱表达。经10-6mol/L ATRA或9-cis RA分别预处理4天后,HL-60细胞Fas表达水平及对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性均显著提高。9-cis RA提高HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性的能力强于ATRA。结论:维甲酸可上调HL-60细胞表达Fas,这可能与维甲酸诱导HL-60细胞分化相关。进一步深入探讨其分子机制,将为肿瘤治疗,特别是自体骨髓移植中骨髓净化提供新方法。
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    Retinoic acid inducing Fas expression in HL-60 cells Zeng Hui, Zhao Xiangyin, Ma Yaluan, et al. Department of Hematology, Beijing Tongren Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100730

    Abstract Objective: To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and 9-cis retinoic acid (9-cis RA) on the expression of Fas and the sensitivity to anti-Fas induced apotosis in HL-60 cells. Methods: Fas expression was detected by flow cytometry. Anti-Fas induced apoptosis (AFIA) was determined by morphological features, DNA fragment electrophoresis, and flow cytometric cell cycle analysis. Results: Fas antigen was weakly expressed on HL-60 cells. After incubation of HL-60 cells with 10-6mol/L ATRA or 9-cis RA for 4 days, both the Fas expression and AFIA were significantly enhanced. 9-cis RA was more potent than ATRA in increasing the sensitivity to AFIA. Conclusion: RA might upregulate Fas expression. Further elucidation of its molecular mechanisms might provide a rationale for new therapeutic strategies of malignant diseases.
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    Key words Apoptosis Tretinoin Cell line, HL-60 Gene, fas

    Fas(又称APO-1,CD95)是一种传递细胞凋亡信号的Ⅰ型跨膜蛋白[1]。Fas配体(Fas-L)或Fas抗体与膜Fas结合后,凋亡信号传递到细胞内,诱导细胞凋亡,因此,Fas-L或Fas抗体有望用于治疗肿瘤。目前,在体外和小鼠体内利用Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡均已获得成功[2]。但是,某些肿瘤细胞由于Fas表达的缺失或功能的缺陷而对Fas抗体诱导的凋亡具有抗性[3],限制了Fas抗体的应用。诱导Fas抗原功能性表达是解决这一问题的重要手段。我们在研究分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸(9-cis RA)诱导HL-60细胞凋亡,降低Bcl-2表达的基础上[4],进一步研究其对Fas表达的影响。

    材料和方法
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    1 细胞培养 HL-60细胞培养条件与文献[4]相同。取指数生长期细胞进行试验。维甲酸(RA)处理的细胞在培养基中分别加入10-6mol/L ATRA或9-cis RA(均由瑞士Roche公司赠送)。

    2 抗体 用于流式细胞仪检测的生物素标记的鼠抗人Fas单克隆抗体DX2(IgG1)和用于诱导细胞凋亡的鼠抗人Fas单克隆抗体CH11(IgM)均由美国Tong Zhou博士惠赠。

    3 流式细胞仪检测Fas表达水平 RA处理不同时间后收集细胞,间接免疫荧光标记法检测。一抗为生物素标记的鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 ,阴性对照加入等量生物素标记的非特异性鼠抗人IgG1,4℃孵育1小时后,加入FITC标记的streptavidin (Sigma) 4℃避光孵育1小时,用FACS 420型流式细胞仪进行分析。

    4 HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性 取正常生长及经RA作用不同时间的HL-60细胞,调整细胞密度为1×106/ml,移至24孔板中,在培养液中分别加入50~200ng/ml 鼠抗人Fas单克隆抗体IgM(clone CH11),对照细胞加入等量非特异性鼠IgM,37℃继续培养,分别于0,1,2,3,4小时收集细胞,按下列方法检测细胞凋亡。形态学观察:常规离心涂片,HE染色,光镜观察。DNA凝胶电泳:采用快速法[5]提取DNA,1%琼脂糖凝胶电泳。流式细胞仪检测凋亡细胞:采用碘化丙锭(PI)染色法[4],FACS420型流式细胞仪进行细胞DNA含量分析,低于G0(G1)期细胞DNA含量的细胞为凋亡细胞。
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    5 统计学分析 流式细胞仪检测每份标本收集1×104个细胞。所有实验均重复3次,平均值采用Systat统计软件进行分析。

    结 果

    1 HL-60细胞Fas表达的变化 经RA诱导4天后,免疫荧光染色流式细胞仪检测表明荧光强度显著提高(图1),表明Fas阳性细胞比例增高,表达强度增强。

    2 RA对Fas抗体诱导HL-60细胞凋亡敏感性的影响

    2.1 抗Fas抗体诱导未经RA处理的HL-60细胞凋亡:经抗Fas抗体作用2小时后,HE染色可见典型凋亡细胞,其特征为细胞体积缩小,胞浆浓缩,胞核固缩,染色质凝集,核碎裂,“凋亡小体”形成;DNA电泳显示出明显的阶梯状条带(图2),在流式细胞仪检测直方图上出现DNA含量低于G0(G1)期细胞的亚二倍体细胞群,即凋亡细胞群。说明抗Fas抗体具有诱导HL-60细胞凋亡的作用。在50~200ng/ml的浓度范围内,抗Fas抗体(IgM)诱导细胞凋亡具有时间依赖性和剂量依赖性(P值分别为0.004,0.005)。但这种诱导凋亡能力较弱,在实验观察的浓度和时间范围内,细胞凋亡数目最高值为18.3%,并且100ng/ml与200ng/ml的作用在统计学上无显著性差异(P值为0.424)。因此我们选用100ng/ml为后续实验浓度。
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    1~3:未经RA处理,100ng/ml抗Fas单抗分别作用1,2,4小时;4~6:9-cis RA处理4天,100ng/ml抗Fas单抗分别作用1,2,4小时;7~9:ATRA处理4天,100ng/ml抗Fas单抗分别作用1,2,4小时;M:DNA HindⅢ分子标记

    图2 DNA琼脂糖凝胶电泳……为对照,——为Fas荧光强度;a:未经RA处理;b:ATRA 处理4天;c:9-cis RA处理4天

    图1 流式细胞仪检测Fas表达2.2 RA提高HL-60细胞对anti-Fas诱导凋亡的敏感性:图3所示,经ATRA和9-cis RA处理4天后,在100ng/ml抗Fas抗体诱导下,HL-60细胞凋亡数较对照组显著增加(ATRA: P值为0.018;9-cis RA:P值为0.001), 峰值分别为对照组峰值的1.76倍和2.45倍。9-cis RA的作用高于ATRA(P<0.05)。
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    图3 RA处理前、后抗Fas抗体诱导HL-60细胞

    凋亡数目的变化

    讨论

    肿瘤细胞表达Fas,并且Fas具有传递细胞凋亡信号的功能是应用Fas抗体治疗肿瘤的两个必要条件。Fas表达的缺陷(表达缺失或降低、基因突变)和功能的缺陷(细胞内凋亡信号传导途径异常、抗凋亡因素的存在)都会造成对抗Fas抗体诱导的凋亡产生抗性。我们检测了抗Fas抗体诱导HL-60细胞凋亡的能力,发现虽然抗Fas抗体可以诱导HL-60细胞凋亡,但HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性较弱,增加抗体浓度已不能显著增加凋亡细胞的数目。经RA预处理后,HL-60细胞不仅Fas表达增强,抗-Fas抗体对其杀伤活性也显著提高,说明诱导的Fas受体具有介导Fas抗体诱导凋亡的功能。

    国外有人采用转基因技术提高肿瘤细胞Fas抗原表达获得成功[6]。但转基因技术尚有很多问题需要解决,目前临床应用暂时受到限制。有文献报道某些细胞因子如TNF-α、IFN-γ可诱导HL-60细胞表达Fas[7],但是这些负性造血因子同时可以诱导造血干细胞表达Fas[8],临床应用会产生骨髓抑制。而RA有以下优点:①自身可以诱导HL-60细胞分化、凋亡;②可降低Bcl-2表达水平[4];③临床应用副作用小,无骨髓抑制。因此,RA诱导肿瘤细胞Fas功能性表达有望拓宽抗Fas抗体应用范围,从受体角度提高了杀伤肿瘤细胞能力。如能用于自体骨髓移植的体外骨髓净化,不仅有望提高骨髓净化效果,还可避免抗Fas抗体体内应用的副作用。
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    正常髓系造血细胞Fas的表达与细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达有相似之处,即与细胞分化程度相关。不同的是,随着细胞分化程度的提高,Bcl-2表达逐渐下降,而Fas表达逐渐提高。终末分化的中性粒细胞不表达Bcl-2,Fas高表达,最终以凋亡的形式被清除[9]。我们通过实验已经证实RA可诱导HL-60细胞发生与分化相关的凋亡,在此过程中伴随着Bcl-2表达的降低[4],由此我们进一步推测通过诱导HL-60细胞分化可能提高Fas的表达。流式细胞仪的检测结果为这一推测提供了证据。

    但是,细胞分化本身是一个复杂过程,其中存在着多种基因的表达变化,及多个信号传导途径的激活,有多篇文献报道在细胞分化的特定阶段细胞对多种因素诱导凋亡的敏感性普遍降低[10]。我们发现RA诱导3天后,Fas的表达已经提高,而此时细胞凋亡数目甚至低于对照组。由于此时Bcl-2表达已经降低,因此,没有证据表明这种抗性是Bcl-2作用的结果。导致这一现象的分子机制尚待深入研究。由于这种抗性存在于分化的特定阶段,抗Fas抗体与RA的联合应用应注意应用时间,以发挥最佳效应。
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    参 考 文 献

    1 Itoh N, Yonehara S, Ishii A, et al. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis. Cell, 1991, 66: 233-243.

    2 Rensing-Ehl A, Frei K, Flury R,et al. Local Fas/APO-1(CD95) ligand mediated tumor cell killing in vivo. Eur J Immunol, 1995,25:2253-2258.

    3 Shima Y, Nishimoto N, Ogata A, et al. Myeloma cells express Fas Antigen/APO-1 (CD95) but only some are sensitive to anti-Fas antibody resulting in apoptosis. Blood, 1995, 85: 757-764.
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    4 曾辉,赵相印,马雅銮,等. 9-顺式维甲酸诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志,1997,18:356-358.

    5 王宪焘,郑德先. 8-氯腺苷诱导Molt-4细胞凋亡. 科学通报,1997,42:189-193.

    6 Weller M, Malipiero U, Rensing-Ehl A, et al. Fas/APO-1 gene transfer for human malignant glioma. Cancer Res, 1995, 55:2936-2944.

    7 Yonehara S, Ishii A, Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas ) to a cell surface antigen co-down regulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med, 1989, 169: 1747-1756.
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    8 Nagafuji K, Shibuya T, Harada M, et al. Functional expression of Fas Antigen (CD95) on hematopoietic progenitor cells. Blood, 1995, 86:883-889.

    9 Iwai K, Miyawaki T, Takizawa T, et al. Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas mediated cell death in peripheral blood lymphocytes, monocytes, and neutrophils. Blood, 1994, 84: 1201-1208.

    10 Solary E, Bertrand R, Kohn KW, et al. Differential induction of apoptosis in undifferentiated and differentiated HL-60 cells by DNA topoisomerase Ⅰ and Ⅱ inhibitors. Blood, 1993, 81:1359-1368.

    (收稿:1997-07-02 修回:1998-01-06)

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