抑癌基因p16在人肝细胞癌中的表达及其与HBxAg表达的关系
作者：顾广玉 朱明华 王文亮△ 詹洲
单位：
关键词：肝肿瘤；乙型肝炎病毒；基因；p16
第二军医大学学报980622 摘要 目的：探讨抑癌基因p16在肝细胞癌发生、发展中的作用。方法：采用免疫组化及原位杂交方法在87例肝细胞癌及其癌旁肝组织内检测P16蛋白、HBxAg及p16 mRNA。结果：在87例中，16例P16蛋白和19例p16 mRNA阳性，分别占18.4%和21.8%。在53例癌旁肝组织中，32例P16蛋白和33例p16 mRNA阳性，分别占60.4%和62.8%。在HBxAg阳性的70例中，9例P16蛋白阳性，HBxAg阴性的17例中，7例P16蛋白阳性。结论：肝细胞癌的发生可能与p16表达减少有关，HBV x基因表达产物可能参与p16基因表达的调控。
中国图书资料分类法分类号 R735.7
, http://www.100md.com
Studies on gene p16 and its correlation with expression of HBxAg in human hepatocellular carcinoma
Gu Guangyu, Zhu Minghua, Wang Wenliang, Zhan Rongzhou (Department of Pathology, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To explore the possible role of p16 in the pathogenesis and development in hepatocellular carcinoma. Methods: Immunohistochemical technique and in situ hybridization technique were used to detect P16 protein, HBxAg and p16 mRNA. Results: Sixteen cases (18.4%) and 19 cases (21.8%) were positive for P16 protein or p16 mRNA in 87 cases of hepatocellular carcinoma. Thirty-two cases (60.4%) and 33 cases (62.8%) were positive for P16 protein and p16 mRNA in 53 cases of its surrounding tissue. Nine cases and 7 cases were positive for P16 protein in 70 cases and 17 cases of hepatocellular carcinoma that HBxAg were positive and negative,respectively. Conclusion: The results of this study suggest that there exists a close relationship between hepatocellular carcinoma and the reduction of p16. HBV X protein may have some effects on p16 expression.
, 百拇医药
Key words liver neoplasms; hepatitis B virus; genes, p16
p16作为一种新的抑癌基因，在真核细胞分裂周期中起着重要作用，在许多恶性肿瘤中存在着p16基因的缺失或突变，将p16表达载体导入肿瘤细胞可导致肿瘤细胞逆转[1，2]。乙型肝炎病毒感染是原发性肝癌发生的重要因素，但其作用机制尚不完全清楚。本研究采用免疫组化与原位杂交方法，检测P16蛋白、HBxAg及p16 mRNA的表达，并观察HBV感染与p16表达之间可能存在的联系。
1 材料和方法
1.1 标本 87例肝细胞癌标本应用10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，病理诊断证实。
1.2 抗体及质粒 兔抗p16多克隆抗体购自Santa Gruz公司 ，兔抗HBxAg多克隆抗体，由美国费城Fox Chase癌症中心提供，质粒PUC19-p16由美国Priya Dayananth博士惠赠。
, http://www.100md.com
1.3 探针制备 用EcoRⅠ及BanHⅠ酶切PUC19-p16质粒，回收0.5 kb大小的片段，随机引物法标记地高辛探针。
1.4 免疫组化及原位杂交检测 免疫组化及原位杂交步骤均按常规方法进行，对照组设置：阳性、阴性、空白及替代对照。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 p16在肝细胞癌及癌旁组织中的表达 87例肝细胞癌，P16蛋白阳性16例，占18.4%;p16 mRNA 阳性19例，占21.8%；53例癌旁组织中，P16蛋白阳性32例，占60.4%；p16 mRNA阳性33例，占62.8%；在癌及癌旁肝组织内，P16蛋白免疫组化阳性信号为棕色颗粒状，主要位于胞浆(图1)，癌旁肝组织内阳性细胞数及阳性反应强度均比癌组织内高，阳性细胞主要以弥漫性分布为主，少数病例呈局灶性或散在分布。p16 mRNA杂交阳性信号呈蓝紫色细颗粒状，主要定位于胞浆，少数病例定位于胞核，分布情况与P16蛋白分布情况基本相同(图2)。p16在癌组织与癌旁组织中表达的差异具有显著性意义(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 HBxAg在肝细胞癌中的表达及其与P16蛋白表达的关系 87例肝细胞癌组织中，HBxAg阳性70例，占80.5%。HBxAg阳性细胞多呈弥漫型分布，少数病例阳性细胞散在分布或呈灶状分布。阳性信号为棕黄色颗粒状， 均匀分布于胞浆内，少数阳性信号位于核内或核膜上(图3)。
图 1 ABC法检测肝细胞癌中P16蛋白表达(×200)
Fig 1 Immunohistochemical detection of P16
Protein in hepatocellular carcinoma (×200)
图 2 肝细胞癌及其癌旁组织中p16 mRNA原位杂交染色结果
, 百拇医药
Fig 2 Results of p16 mRNA in situ hybridization stain in hepatocellular carcinoma and its surrounding tissue
A: Hepatocellular carcinoma (×400); B:Surrounding tissue of
hepatocellular carcinoma (×200)
图 3 ABC法检测肝细胞癌中HBxAg表达(×400)
Fig 3 Immunohistochemical detection of HBxAg
, http://www.100md.com
in hepatocellular carcinoma (×400)
HBxAg表达与P16蛋白表达的关系见表1。
上述实验均经多项对照试验，阳性切片多次重复均为阳性，阴性切片均为阴性，替代对照和空白对照均为阴性。
表 1 P16表达与HBxAg表达的关系
Tab 1 Relationship between expression of P16 protoin and HBxAg Group
n
P16(+)
P16(-)
HBxAg(+)
, 百拇医药
70
9
61*
HBxAg(-)
17
7
10
Total
87
16
71
*P<0.05 vs HBxAg(-)
, http://www.100md.com 3 讨 论
p16基因位于人染色体9p21，其表达产物P16蛋白可通过抑制细胞周期D/CDK4活性参与并调节细胞从G1期进入S期，若没有P16蛋白的抑制作用，细胞会异常增生[3]。研究表明，p16基因在大多数人类原发肿瘤和细胞系中都有改变。p16基因失活的主要机制是基因的纯合性缺失，点突变和DNA原位高度甲基化等。
在我们研究的87例肝细胞癌标本中，P16蛋白的阳性率为18.4%，明显低于癌旁肝组织60.4%(P<0.05)。p16 mRNA原位杂交结果与免疫组化结果无显著差异。说明P16蛋白表达减低可能与肝细胞癌的发生发展密切相关。
以往的研究证实，HBV感染与肝细胞癌的发生密切相关，特别是HBV x基因表达产物的反式激活作用，在肝细胞癌发生中的作用更为突出[4，5]。有研究发现，HBxAg可与P53蛋白结合形成复合物，并抑制P53活性[6]。为进一步弄清HBxAg表达与P16蛋白表达是否存在内在联系，我们将87例肝细胞癌标本分成HBxAg阳性组与阴性组，统计结果表明，HBxAg阳性组中P16蛋白表达的阳性率明显低于HBxAg阴性组，提示HBV感染与P16蛋白表达减少有关，肝细胞癌的发生可能与HBV感染导致的p16表达减低有关。HBV感染与p16表达的进一步研究正在进行中。p16表达与肝细胞癌侵袭、转移及预后是否相关尚有待进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Feldhaus WJ, et al. A cell cycle regulater potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157):436
2 Arap W, Nishikawa R, Furnari FB, et al. Replacement of the p16/ CDKN2 gene suppresses human glioma cell growth. Cancer Res, 1995,55(6):1351
3 Serrano M, Hannon GJ, Beach D, et al. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993,366(6456):704
, 百拇医药
4 London WT, Buetow K. Hepatitis B virus and primary hepa- tocellular carcinoma. Cancer Invest, 1988,6(3):317
5 Zahm P, Hofschneider PH, Koshy P. The HBV X-ORF encodes a transactivator: a potential factor in viral hepatocarcinogenesis. Oncogene, 1988,3(2):169
6 朱明华, Feitelson MA, Lonolon WT. HBxAg和P53蛋白结合在原发性肝癌发生中的意义. 中华医学杂志, 1993, 73(6):325
(1998-05-13收稿， 1998-08-17修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：肝肿瘤；乙型肝炎病毒；基因；p16
第二军医大学学报980622 摘要 目的：探讨抑癌基因p16在肝细胞癌发生、发展中的作用。方法：采用免疫组化及原位杂交方法在87例肝细胞癌及其癌旁肝组织内检测P16蛋白、HBxAg及p16 mRNA。结果：在87例中，16例P16蛋白和19例p16 mRNA阳性，分别占18.4%和21.8%。在53例癌旁肝组织中，32例P16蛋白和33例p16 mRNA阳性，分别占60.4%和62.8%。在HBxAg阳性的70例中，9例P16蛋白阳性，HBxAg阴性的17例中，7例P16蛋白阳性。结论：肝细胞癌的发生可能与p16表达减少有关，HBV x基因表达产物可能参与p16基因表达的调控。
中国图书资料分类法分类号 R735.7
, http://www.100md.com
Studies on gene p16 and its correlation with expression of HBxAg in human hepatocellular carcinoma
Gu Guangyu, Zhu Minghua, Wang Wenliang, Zhan Rongzhou (Department of Pathology, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To explore the possible role of p16 in the pathogenesis and development in hepatocellular carcinoma. Methods: Immunohistochemical technique and in situ hybridization technique were used to detect P16 protein, HBxAg and p16 mRNA. Results: Sixteen cases (18.4%) and 19 cases (21.8%) were positive for P16 protein or p16 mRNA in 87 cases of hepatocellular carcinoma. Thirty-two cases (60.4%) and 33 cases (62.8%) were positive for P16 protein and p16 mRNA in 53 cases of its surrounding tissue. Nine cases and 7 cases were positive for P16 protein in 70 cases and 17 cases of hepatocellular carcinoma that HBxAg were positive and negative,respectively. Conclusion: The results of this study suggest that there exists a close relationship between hepatocellular carcinoma and the reduction of p16. HBV X protein may have some effects on p16 expression.
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Key words liver neoplasms; hepatitis B virus; genes, p16
p16作为一种新的抑癌基因，在真核细胞分裂周期中起着重要作用，在许多恶性肿瘤中存在着p16基因的缺失或突变，将p16表达载体导入肿瘤细胞可导致肿瘤细胞逆转[1，2]。乙型肝炎病毒感染是原发性肝癌发生的重要因素，但其作用机制尚不完全清楚。本研究采用免疫组化与原位杂交方法，检测P16蛋白、HBxAg及p16 mRNA的表达，并观察HBV感染与p16表达之间可能存在的联系。
1 材料和方法
1.1 标本 87例肝细胞癌标本应用10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm连续切片，病理诊断证实。
1.2 抗体及质粒 兔抗p16多克隆抗体购自Santa Gruz公司 ，兔抗HBxAg多克隆抗体，由美国费城Fox Chase癌症中心提供，质粒PUC19-p16由美国Priya Dayananth博士惠赠。
, http://www.100md.com
1.3 探针制备 用EcoRⅠ及BanHⅠ酶切PUC19-p16质粒，回收0.5 kb大小的片段，随机引物法标记地高辛探针。
1.4 免疫组化及原位杂交检测 免疫组化及原位杂交步骤均按常规方法进行，对照组设置：阳性、阴性、空白及替代对照。
1.5 统计学处理 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 p16在肝细胞癌及癌旁组织中的表达 87例肝细胞癌，P16蛋白阳性16例，占18.4%;p16 mRNA 阳性19例，占21.8%；53例癌旁组织中，P16蛋白阳性32例，占60.4%；p16 mRNA阳性33例，占62.8%；在癌及癌旁肝组织内，P16蛋白免疫组化阳性信号为棕色颗粒状，主要位于胞浆(图1)，癌旁肝组织内阳性细胞数及阳性反应强度均比癌组织内高，阳性细胞主要以弥漫性分布为主，少数病例呈局灶性或散在分布。p16 mRNA杂交阳性信号呈蓝紫色细颗粒状，主要定位于胞浆，少数病例定位于胞核，分布情况与P16蛋白分布情况基本相同(图2)。p16在癌组织与癌旁组织中表达的差异具有显著性意义(P<0.01)。
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2.2 HBxAg在肝细胞癌中的表达及其与P16蛋白表达的关系 87例肝细胞癌组织中，HBxAg阳性70例，占80.5%。HBxAg阳性细胞多呈弥漫型分布，少数病例阳性细胞散在分布或呈灶状分布。阳性信号为棕黄色颗粒状， 均匀分布于胞浆内，少数阳性信号位于核内或核膜上(图3)。
图 1 ABC法检测肝细胞癌中P16蛋白表达(×200)
Fig 1 Immunohistochemical detection of P16
Protein in hepatocellular carcinoma (×200)
图 2 肝细胞癌及其癌旁组织中p16 mRNA原位杂交染色结果
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Fig 2 Results of p16 mRNA in situ hybridization stain in hepatocellular carcinoma and its surrounding tissue
A: Hepatocellular carcinoma (×400); B:Surrounding tissue of
hepatocellular carcinoma (×200)
图 3 ABC法检测肝细胞癌中HBxAg表达(×400)
Fig 3 Immunohistochemical detection of HBxAg
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in hepatocellular carcinoma (×400)
HBxAg表达与P16蛋白表达的关系见表1。
上述实验均经多项对照试验，阳性切片多次重复均为阳性，阴性切片均为阴性，替代对照和空白对照均为阴性。
表 1 P16表达与HBxAg表达的关系
Tab 1 Relationship between expression of P16 protoin and HBxAg Group
n
P16(+)
P16(-)
HBxAg(+)
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70
9
61*
HBxAg(-)
17
7
10
Total
87
16
71
*P<0.05 vs HBxAg(-)
, http://www.100md.com 3 讨 论
p16基因位于人染色体9p21，其表达产物P16蛋白可通过抑制细胞周期D/CDK4活性参与并调节细胞从G1期进入S期，若没有P16蛋白的抑制作用，细胞会异常增生[3]。研究表明，p16基因在大多数人类原发肿瘤和细胞系中都有改变。p16基因失活的主要机制是基因的纯合性缺失，点突变和DNA原位高度甲基化等。
在我们研究的87例肝细胞癌标本中，P16蛋白的阳性率为18.4%，明显低于癌旁肝组织60.4%(P<0.05)。p16 mRNA原位杂交结果与免疫组化结果无显著差异。说明P16蛋白表达减低可能与肝细胞癌的发生发展密切相关。
以往的研究证实，HBV感染与肝细胞癌的发生密切相关，特别是HBV x基因表达产物的反式激活作用，在肝细胞癌发生中的作用更为突出[4，5]。有研究发现，HBxAg可与P53蛋白结合形成复合物，并抑制P53活性[6]。为进一步弄清HBxAg表达与P16蛋白表达是否存在内在联系，我们将87例肝细胞癌标本分成HBxAg阳性组与阴性组，统计结果表明，HBxAg阳性组中P16蛋白表达的阳性率明显低于HBxAg阴性组，提示HBV感染与P16蛋白表达减少有关，肝细胞癌的发生可能与HBV感染导致的p16表达减低有关。HBV感染与p16表达的进一步研究正在进行中。p16表达与肝细胞癌侵袭、转移及预后是否相关尚有待进一步研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis NA, Feldhaus WJ, et al. A cell cycle regulater potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994,264(5157):436
2 Arap W, Nishikawa R, Furnari FB, et al. Replacement of the p16/ CDKN2 gene suppresses human glioma cell growth. Cancer Res, 1995,55(6):1351
3 Serrano M, Hannon GJ, Beach D, et al. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993,366(6456):704
, 百拇医药
4 London WT, Buetow K. Hepatitis B virus and primary hepa- tocellular carcinoma. Cancer Invest, 1988,6(3):317
5 Zahm P, Hofschneider PH, Koshy P. The HBV X-ORF encodes a transactivator: a potential factor in viral hepatocarcinogenesis. Oncogene, 1988,3(2):169
6 朱明华, Feitelson MA, Lonolon WT. HBxAg和P53蛋白结合在原发性肝癌发生中的意义. 中华医学杂志, 1993, 73(6):325
(1998-05-13收稿， 1998-08-17修回)
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