实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究
作者：李长有1 林国宏2
单位：1 中国医科大学第一临床学院骨科 110001 沈阳市；2 中国医科大学病理教研室
关键词：神经丝；免疫组织化学；脊髓；缺血；兔
中国脊柱脊髓杂志980606 摘要 目的：观察实验性兔腰髓缺血40min和再灌流4h的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。方法：用免疫组织化学方法观察神经丝(neurofilaments,NF)抗体特异标记神经元胞体和轴突，并对其结果进行图像分析。结果：缺血40min，脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应异常增强，胞体内神经丝分布紊乱聚集。再灌流4h，脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应阳性，胞体内神经丝散乱、稀疏、崩溃和溶解，轴突肿胀、扩大、消失。图像分析了脊髓前角运动神经元胞体内神经丝的面积、灰度和脊髓前索内轴突的数量，其结果具有明显的统计学意义。结论：神经丝免疫组织化学方法能更清楚地显示脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变，脊髓损伤后细胞骨架紊乱在神经元的病理发病机制中起重要作用。
, 百拇医药
The neurofilament immunohistochemical study of pathological changes of neurons on experimental ischemic spinal cord injury/LI Changyou LIN Guohong//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(6):323～325
Abstract Objective:The pathological changes of cell bodies and axons of motorneurons were investigated in rabbits lumbar spinal cord after 40min of ischemia and 4h of reperfusion.Method:Neurofilament(NF) antibody was adopted to label cell bodies and axons specifically and were observed with the immunohistochemical method.The results were analysed by the image pattern analysis.Result:The excessive misaccumulation of NF was observed in the cell bodies and axons of motorneurons in the ventral horn after 40min of ischemia and the distribution of NF in the cell bodies was disturbed and accumulative.The NF immunohistochemical reaction could be shown in the cell bodies and axons of motorneuorns after 4h of reperfusion,and the distribution of NF in the cell bodies was divergent,rare and disintegrative,the axons were swollen and vanish.The areas,grey levels of NF in the cell bodies and the numbers of axons in the anterior funiculus were measured and the statistical analysis showed significant difference.Conclusion:The pathological changes of cell bodies and axons of motoneurons were demonstrated clearly by NF immunohistochemical reaction,and the disorder of cytomatrix played an important role in the pathogenesis of neurons cell body and axons.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopaedic Surgery,1st Hospital,China Medical University,Shenyang,Liaoning,110001
Key words Neurofilament Immunohistochemy Spinal cord Ischemia Rabbit
免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价方面的报道较少。本实验应用神经丝(neurofi-lament,NF)抗体对实验性脊髓缺血损伤进行了评价。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性日本大耳白兔23只，体重2.1～3.0kg，平均2.58±0.40kg。全部动物均在同一实验室按相同饲养方法由专人饲养。室内空气新鲜，温度保持在20℃左右。实验动物手术和监测详见另文〔1〕。
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1.2 免疫组织化学染色
缺血前、缺血40min、再灌流4h，分别在活体状态下，取同一伤段脊髓行病理学检查。标本固定于10%中性福尔马林液中。标本常规制样，HE、尼氏染色供一般病理学研究。神经丝免疫组织化学方法如下：石蜡切片脱蜡和水化，0.3%H2O2和甲醇(1∶9)室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。3%正常羊血清室温下孵育10min，减少非特异性背景。应用鼠抗人NF抗体(Maxim，70KD+200KD)室温下孵育60min进行抗原抗体特异结合。生物素标记的羊抗鼠IgG(Maxim)室温下孵育10min。加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶室温下孵育10min。新鲜DBA溶液显色，显微镜下观察3～5min，中性树胶封固。每步之间均用PBS冲洗3次，每次3～5min。阳性呈黄色，阴性对照片用PBS代替第一抗体。
1.3 图像分析处理
, 百拇医药
应用日本Luzex-F型图像分析系统，在20倍物镜下随机测定缺血前、缺血40min、再灌流4h各组脊髓前角30个有核细胞神经丝的平均面积和平均灰度，同时测定各切片脊髓前索内轴突数量。
1.4 统计学处理
所有测定值以平均值±标准差表示，统计学意义通过Microsoft Excel 5.0 for Windows电子表格软件中的F检查和t检查进行评价，P值<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 组织病理学改变
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核大多位于中央，核仁清晰可见，尼氏体呈网斑状均匀排列于核周，胞浆均匀，深染，前索轴突分布均匀。
缺血40min组：前角运动神经元肿胀，圆形，胞核偏位，核仁尚清楚，尼氏体呈细尘状颗粒，浅染，松散，排列紊乱或位于细胞周边部。灰质内可见大片出血。前索轴突分布较散乱。
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再灌流4h组：前角运动神经元固缩、变小，呈三角形。胞核结构大多萎缩消失，尼氏体溶解、消失，胞浆呈空泡状改变。前索轴突分布明显紊乱，数量明显减少(详见另文〔1〕)。
2.2 神经丝免疫组织化学改变
免去第一抗体的标本都呈NF阴性反应。
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核轮廓清晰可见。NF染色呈丝网状均匀分布于胞浆中(图1，插Ⅲ)。前索轴突分布均匀，轴突NF染色均匀一致(图2，插Ⅲ)。
缺血40min组：前角运动神经元肿胀，胞核轮廓尚清楚，NF呈强阳性不均匀分布于胞质中，神经丝排列紊乱聚集(图3，插Ⅲ)。前索轴突散乱分布，NF染色强阳性(图4，插Ⅲ)。
再灌流4h组：前角运动神经元固缩、变小，大致呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。NF染色阳性，神经丝紊乱、稀疏、溶解、消失(图5，插Ⅲ)。前索轴突分布明显紊乱，轴突肿胀、扩大、消失，轴突内NF染色阳性(图6，插Ⅲ)。
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2.3 图像分析结果
缺血40min组脊髓前角运动细胞NF平均灰度(注：灰度表示图像各部分颜色的深浅程度，切片底色越浅，灰度值越高。)明显低于缺血前组(P<0.01)，再灌流4h组平均灰度低于缺血前组(P<0.05)，且与缺血40min组比较P<0.01。结果见附表。
缺血40min组脊髓前角运动细胞NF平均面积与缺血前组没有明显差异(P>0.05)。再灌流4h组平均面积较缺血前和缺血40min组明显减少(P<0.01)
缺血40min组脊髓前索轴突数量低于缺血前组(P<0.05)，再灌流4h组轴突数量明显减少，与缺血前组和缺血40min组比较P<0.01。
附表 脊髓缺血再灌流NF图像分析结果
(
±s)
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缺血前
缺血40min
再灌流4h
平均灰度
106.95±17.83
53.32±8.92①
89.56±13.61②
平均面积(μm2)
1093.88±207.65
1005.96±186.72③
590.82±157.62①
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轴突平均数量(条)
1563.72±336.51
1237.38±243.55②
842.76±126.58①
注：与缺血前相比，①代表P<0.01，②代表P<0.05，③代表P>0.05
3 讨论
脊髓损伤的基础研究方法很多，但免疫组织化学方法应用于实验性脊髓损伤的研究很少。本实验采用单克隆NF抗体特异地显示神经元胞体和轴突的细胞骨架结构。结果显示缺血40min，神经元胞质中NF呈强阳性反应，神经丝紊乱聚集，轴突NF也呈强阳性，分布不均匀，说明了缺血40min神经元胞体和轴突有明显的免疫组织化学方面病理学损伤。再灌流4h神经元损伤进一步加重，NF反应阳性，神经丝紊乱、稀疏、崩溃、溶解，轴突肿胀、扩大、消失。说明再灌流4h神经元胞体和轴突损伤进一步加重。上述结果用图像分析，经统计学比较而证实。这与作者用脊髓血流(SCBF)、超微结构、自由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致〔1〕。本实验证实神经丝免疫组织化学方法较一般病理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体和轴突病变。
, 百拇医药
在细胞骨架结构中，NF是一神经元特异中间丝，由神经丝蛋白构成，对于维持细胞的特定形状及多种细胞生理功能具有重要意义。它广泛分布于神经元的胞体和突起内，这种特异性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维持下来的。神经丝由三种主要多肽类亚单位(70KD，160KD，200KD)组成〔2〕，本抗体能与70KD及200KD亚单位起反应，特异性标记脊髓运动神经元和神经突起〔3〕。
缺血时，组织血供减少，ATP减少，膜泵功能失灵。细胞不能维持通过细胞膜适宜的离子梯度，Ca2+进入细胞内激活依赖性蛋白水解酶，通过黄嘌呤氧化酶系统在缺血再灌组织中产生大量自由基〔4〕。脊髓神经元胞体和轴突内脂质过氧化水平增高，膜性结构受损，进一步增加了Ca2+从线粒体的释放及细胞外的内流，从而激活了由钙激活的中性蛋白酶(CANP)。CANP在神经丝蛋白的代谢中起重要作用，可将髓鞘蛋白分解成小泡状结构，并可将NF分解成小片断，导致NF降解，细胞骨架解体，形成轴突空泡样变性和Waller溃变〔5、6〕。实验证明，神经生长因子可降低质膜脂质过氧化水平而稳定细胞膜和膜性细胞器，稳定细胞内游离钙浓度，减轻NF的受损程度〔7〕。
, 百拇医药
脊髓损伤后病理生理机制非常复杂，各种原因均可引起神经元胞体和轴突病变〔8〕。本实验说明了细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的病理发病机制中起重要作用。
4 参考文献
1 李长有，王星铎，金明熙，等.应用激光多普勒血流仪监测兔急性脊髓缺血损伤后腰髓血流动力学变化及病理学观察的研究.中华骨科杂志，1997，5：299.
2 Liem RK,Yen SH,Solomon GE,et al.Intermediate filaments in nervous tissues.J Cell Biol,1978,79:637.
3 Dahl D.Immunohistochemical differences between neurofilaments in perilarya,dendrites and axon.Ext Cell Res,1983,149:397.
, 百拇医药
4 Buldley GB.Free radical mediated reperfusion injury:a selective review.Br J Cancer,1987,55:66.
5 Schlaepfer WW.Neurofilaments:structure,metabolosmand implications in disease.J Neuropathol Exp Neurol,1987,46:117.
6 Schlaepfer WW,Micko S.Chemical and structural changes of neurofilaments in transected rat sciatic nerve.J Cell Biol,1987,78:369.
7 Perea-Polo JR,Foreman PJ,Jackson GR,et al.Nerve growth factor and neuronal cell death.Mol Neurobiol,1990,4:57.
8 Povlishock JT.Traumatically induces axonal injury:pathogenesid and pathobiological implications.Brain Pathol,1992,2:1.
收稿日期：1997-12-30
, http://www.100md.com(李长有1 林国宏2)
单位：1 中国医科大学第一临床学院骨科 110001 沈阳市；2 中国医科大学病理教研室
关键词：神经丝；免疫组织化学；脊髓；缺血；兔
中国脊柱脊髓杂志980606 摘要 目的：观察实验性兔腰髓缺血40min和再灌流4h的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。方法：用免疫组织化学方法观察神经丝(neurofilaments,NF)抗体特异标记神经元胞体和轴突，并对其结果进行图像分析。结果：缺血40min，脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应异常增强，胞体内神经丝分布紊乱聚集。再灌流4h，脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应阳性，胞体内神经丝散乱、稀疏、崩溃和溶解，轴突肿胀、扩大、消失。图像分析了脊髓前角运动神经元胞体内神经丝的面积、灰度和脊髓前索内轴突的数量，其结果具有明显的统计学意义。结论：神经丝免疫组织化学方法能更清楚地显示脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变，脊髓损伤后细胞骨架紊乱在神经元的病理发病机制中起重要作用。
, 百拇医药
The neurofilament immunohistochemical study of pathological changes of neurons on experimental ischemic spinal cord injury/LI Changyou LIN Guohong//Chinese Journal of Spine and Spinal Cord,1998,8(6):323～325
Abstract Objective:The pathological changes of cell bodies and axons of motorneurons were investigated in rabbits lumbar spinal cord after 40min of ischemia and 4h of reperfusion.Method:Neurofilament(NF) antibody was adopted to label cell bodies and axons specifically and were observed with the immunohistochemical method.The results were analysed by the image pattern analysis.Result:The excessive misaccumulation of NF was observed in the cell bodies and axons of motorneurons in the ventral horn after 40min of ischemia and the distribution of NF in the cell bodies was disturbed and accumulative.The NF immunohistochemical reaction could be shown in the cell bodies and axons of motorneuorns after 4h of reperfusion,and the distribution of NF in the cell bodies was divergent,rare and disintegrative,the axons were swollen and vanish.The areas,grey levels of NF in the cell bodies and the numbers of axons in the anterior funiculus were measured and the statistical analysis showed significant difference.Conclusion:The pathological changes of cell bodies and axons of motoneurons were demonstrated clearly by NF immunohistochemical reaction,and the disorder of cytomatrix played an important role in the pathogenesis of neurons cell body and axons.
, 百拇医药
Authors address Department of Orthopaedic Surgery,1st Hospital,China Medical University,Shenyang,Liaoning,110001
Key words Neurofilament Immunohistochemy Spinal cord Ischemia Rabbit
免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价方面的报道较少。本实验应用神经丝(neurofi-lament,NF)抗体对实验性脊髓缺血损伤进行了评价。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性日本大耳白兔23只，体重2.1～3.0kg，平均2.58±0.40kg。全部动物均在同一实验室按相同饲养方法由专人饲养。室内空气新鲜，温度保持在20℃左右。实验动物手术和监测详见另文〔1〕。
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1.2 免疫组织化学染色
缺血前、缺血40min、再灌流4h，分别在活体状态下，取同一伤段脊髓行病理学检查。标本固定于10%中性福尔马林液中。标本常规制样，HE、尼氏染色供一般病理学研究。神经丝免疫组织化学方法如下：石蜡切片脱蜡和水化，0.3%H2O2和甲醇(1∶9)室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。3%正常羊血清室温下孵育10min，减少非特异性背景。应用鼠抗人NF抗体(Maxim，70KD+200KD)室温下孵育60min进行抗原抗体特异结合。生物素标记的羊抗鼠IgG(Maxim)室温下孵育10min。加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶室温下孵育10min。新鲜DBA溶液显色，显微镜下观察3～5min，中性树胶封固。每步之间均用PBS冲洗3次，每次3～5min。阳性呈黄色，阴性对照片用PBS代替第一抗体。
1.3 图像分析处理
, 百拇医药
应用日本Luzex-F型图像分析系统，在20倍物镜下随机测定缺血前、缺血40min、再灌流4h各组脊髓前角30个有核细胞神经丝的平均面积和平均灰度，同时测定各切片脊髓前索内轴突数量。
1.4 统计学处理
所有测定值以平均值±标准差表示，统计学意义通过Microsoft Excel 5.0 for Windows电子表格软件中的F检查和t检查进行评价，P值<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 组织病理学改变
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核大多位于中央，核仁清晰可见，尼氏体呈网斑状均匀排列于核周，胞浆均匀，深染，前索轴突分布均匀。
缺血40min组：前角运动神经元肿胀，圆形，胞核偏位，核仁尚清楚，尼氏体呈细尘状颗粒，浅染，松散，排列紊乱或位于细胞周边部。灰质内可见大片出血。前索轴突分布较散乱。
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再灌流4h组：前角运动神经元固缩、变小，呈三角形。胞核结构大多萎缩消失，尼氏体溶解、消失，胞浆呈空泡状改变。前索轴突分布明显紊乱，数量明显减少(详见另文〔1〕)。
2.2 神经丝免疫组织化学改变
免去第一抗体的标本都呈NF阴性反应。
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核轮廓清晰可见。NF染色呈丝网状均匀分布于胞浆中(图1，插Ⅲ)。前索轴突分布均匀，轴突NF染色均匀一致(图2，插Ⅲ)。
缺血40min组：前角运动神经元肿胀，胞核轮廓尚清楚，NF呈强阳性不均匀分布于胞质中，神经丝排列紊乱聚集(图3，插Ⅲ)。前索轴突散乱分布，NF染色强阳性(图4，插Ⅲ)。
再灌流4h组：前角运动神经元固缩、变小，大致呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。NF染色阳性，神经丝紊乱、稀疏、溶解、消失(图5，插Ⅲ)。前索轴突分布明显紊乱，轴突肿胀、扩大、消失，轴突内NF染色阳性(图6，插Ⅲ)。
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2.3 图像分析结果
缺血40min组脊髓前角运动细胞NF平均灰度(注：灰度表示图像各部分颜色的深浅程度，切片底色越浅，灰度值越高。)明显低于缺血前组(P<0.01)，再灌流4h组平均灰度低于缺血前组(P<0.05)，且与缺血40min组比较P<0.01。结果见附表。
缺血40min组脊髓前角运动细胞NF平均面积与缺血前组没有明显差异(P>0.05)。再灌流4h组平均面积较缺血前和缺血40min组明显减少(P<0.01)
缺血40min组脊髓前索轴突数量低于缺血前组(P<0.05)，再灌流4h组轴突数量明显减少，与缺血前组和缺血40min组比较P<0.01。
附表 脊髓缺血再灌流NF图像分析结果
(
±s), http://www.100md.com
缺血前
缺血40min
再灌流4h
平均灰度
106.95±17.83
53.32±8.92①
89.56±13.61②
平均面积(μm2)
1093.88±207.65
1005.96±186.72③
590.82±157.62①
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轴突平均数量(条)
1563.72±336.51
1237.38±243.55②
842.76±126.58①
注：与缺血前相比，①代表P<0.01，②代表P<0.05，③代表P>0.05
3 讨论
脊髓损伤的基础研究方法很多，但免疫组织化学方法应用于实验性脊髓损伤的研究很少。本实验采用单克隆NF抗体特异地显示神经元胞体和轴突的细胞骨架结构。结果显示缺血40min，神经元胞质中NF呈强阳性反应，神经丝紊乱聚集，轴突NF也呈强阳性，分布不均匀，说明了缺血40min神经元胞体和轴突有明显的免疫组织化学方面病理学损伤。再灌流4h神经元损伤进一步加重，NF反应阳性，神经丝紊乱、稀疏、崩溃、溶解，轴突肿胀、扩大、消失。说明再灌流4h神经元胞体和轴突损伤进一步加重。上述结果用图像分析，经统计学比较而证实。这与作者用脊髓血流(SCBF)、超微结构、自由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致〔1〕。本实验证实神经丝免疫组织化学方法较一般病理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体和轴突病变。
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在细胞骨架结构中，NF是一神经元特异中间丝，由神经丝蛋白构成，对于维持细胞的特定形状及多种细胞生理功能具有重要意义。它广泛分布于神经元的胞体和突起内，这种特异性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维持下来的。神经丝由三种主要多肽类亚单位(70KD，160KD，200KD)组成〔2〕，本抗体能与70KD及200KD亚单位起反应，特异性标记脊髓运动神经元和神经突起〔3〕。
缺血时，组织血供减少，ATP减少，膜泵功能失灵。细胞不能维持通过细胞膜适宜的离子梯度，Ca2+进入细胞内激活依赖性蛋白水解酶，通过黄嘌呤氧化酶系统在缺血再灌组织中产生大量自由基〔4〕。脊髓神经元胞体和轴突内脂质过氧化水平增高，膜性结构受损，进一步增加了Ca2+从线粒体的释放及细胞外的内流，从而激活了由钙激活的中性蛋白酶(CANP)。CANP在神经丝蛋白的代谢中起重要作用，可将髓鞘蛋白分解成小泡状结构，并可将NF分解成小片断，导致NF降解，细胞骨架解体，形成轴突空泡样变性和Waller溃变〔5、6〕。实验证明，神经生长因子可降低质膜脂质过氧化水平而稳定细胞膜和膜性细胞器，稳定细胞内游离钙浓度，减轻NF的受损程度〔7〕。
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脊髓损伤后病理生理机制非常复杂，各种原因均可引起神经元胞体和轴突病变〔8〕。本实验说明了细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的病理发病机制中起重要作用。
4 参考文献
1 李长有，王星铎，金明熙，等.应用激光多普勒血流仪监测兔急性脊髓缺血损伤后腰髓血流动力学变化及病理学观察的研究.中华骨科杂志，1997，5：299.
2 Liem RK,Yen SH,Solomon GE,et al.Intermediate filaments in nervous tissues.J Cell Biol,1978,79:637.
3 Dahl D.Immunohistochemical differences between neurofilaments in perilarya,dendrites and axon.Ext Cell Res,1983,149:397.
, 百拇医药
4 Buldley GB.Free radical mediated reperfusion injury:a selective review.Br J Cancer,1987,55:66.
5 Schlaepfer WW.Neurofilaments:structure,metabolosmand implications in disease.J Neuropathol Exp Neurol,1987,46:117.
6 Schlaepfer WW,Micko S.Chemical and structural changes of neurofilaments in transected rat sciatic nerve.J Cell Biol,1987,78:369.
7 Perea-Polo JR,Foreman PJ,Jackson GR,et al.Nerve growth factor and neuronal cell death.Mol Neurobiol,1990,4:57.
8 Povlishock JT.Traumatically induces axonal injury:pathogenesid and pathobiological implications.Brain Pathol,1992,2:1.
收稿日期：1997-12-30
, http://www.100md.com(李长有1 林国宏2)