骨形态发生蛋白-2的体外表达及其成骨作用
作者：叶伟胜 郭善一 蔡芳 陈棣 张镜宇
单位：300211 天津医院骨科(叶伟胜)；天津医科大学内分泌研究所(郭善一、蔡芳、陈棣、张镜宇)
关键词：
中华医学杂志980634 为进一步研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对骨形成的作用及作用机制，我们在中国苍鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达了大鼠BMP-2。通过在体和离体实验，研究了BMP-2促进细胞分化和骨形成的生物功能。
一、材料与方法
大鼠全长BMP-2 cDNA插入pCMV5表达载体后，用磷酸钙沉淀法稳定转移至CHO细胞，可持续(组成性)分泌BMP-2。经G418选择后，对抗G418的细胞集落进行Northern分析。证明CHO/BMP-2细胞表达BMP-2 mRNA。而CHO/空白载体细胞未检测到表达。利用小鼠抗BMP-2的单克隆抗体进行Western印渍分析，经过氧化物酶标记羊抗鼠IgG的抗体(第二抗)显色，在CHO/BMP-2细胞的条件培养基(CM)中可测到BMP-2蛋白，而在CHO/空白载体细胞的CM中不能测到。
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用对碱磷酶(ALP)的刺激作用检测该蛋白的生物活性[1]，结果来自CHO/BMP-2细胞的CM具有很高的刺激FRC细胞ALP活性的能力。相反，来自CHO/空白载体细胞的CM没有这种能力。
在30个CHO/BMP-2细胞克隆中，通过测定CM刺激胎鼠颅骨(FRC)细胞中ALP活性的大小，选出一株BMP-2高表达细胞株。以其对ALP活性的提高能力估算该细胞的BMP-2产量，此细胞株的CM中大约可产生200 ng/ml的重组大鼠BMP-2。空白CHO细胞的CM不影响其它来源BMP-2刺激ALP的活性，说明CHO细胞中不含对BMP-2有抑制或协同作用的因子。
二、结果
将CHO/空白载体或CHO/BMP-2细胞(约2×106个细胞)注射到BALB裸鼠的颅旁皮下组织，18天后，颅骨切片镜检，可见注射携带空白载体的CHO细胞的小鼠颅骨，在接种细胞与其下面的骨膜之间无新骨形成。相反，在注射CHO/BMP-2细胞的小鼠颅骨的骨膜表面发现大量新生的编织骨。用计算机成像系统进行骨计量学的量化分析更说明有明显的新骨形成。
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三、讨论
本文对重组大鼠BMP-2在哺乳动物细胞中的表达进行了在体和离体实验，检测了重组蛋白质的表达及生物学活性。通过Northern和Western印渍分析证明，BMP-2在CHO细胞的mRNA和蛋白质水平的表达。ALP活性测定进一步证明，CHO细胞表达的BMP-2蛋白质具有完整的生物学活性(不再需人工加工)，并且具有诱导骨细胞分化的能力。BMP-2能诱导异位(例如在肌肉组织中)骨形成已有证明[1]，但对正常骨形成的作用尚缺乏研究。本研究首次用在体原位实验证实了BMP-2有诱导正常骨生成的能力。
重组BMP-2对哺乳动物骨折愈合和大块骨缺损的治疗作用的效果已有报导[2]。但BMP-2与其它骨代谢相关生长因子(例如转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子或胰岛素样生长因子等)的作用的比较则仍未清楚。进行上述研究需要获得足够量的有活性的重组BMP-2。本研究为制备活性BMP-2和进一步研究BMP-2与其它生长因子间的相互作用提供了可能性。总之，经稳定转染后，大鼠BMP-2活性蛋白可在CHO细胞中表达，并且无需任何人工加工即具有促进成骨细胞分化和骨形成的作用。
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本课题为天津市自然科学基金资助项目
参考文献
1 Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblastic cells. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 174：96-101.
2 赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志，1994，10：319.
3 陈棣，叶伟胜.骨形态发生蛋白的成骨功能及临床应用.中华外科杂志，1996，34：602.
(收稿：1997-12-06 修回：1998-02-18)
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单位：300211 天津医院骨科(叶伟胜)；天津医科大学内分泌研究所(郭善一、蔡芳、陈棣、张镜宇)
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中华医学杂志980634 为进一步研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对骨形成的作用及作用机制，我们在中国苍鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达了大鼠BMP-2。通过在体和离体实验，研究了BMP-2促进细胞分化和骨形成的生物功能。
一、材料与方法
大鼠全长BMP-2 cDNA插入pCMV5表达载体后，用磷酸钙沉淀法稳定转移至CHO细胞，可持续(组成性)分泌BMP-2。经G418选择后，对抗G418的细胞集落进行Northern分析。证明CHO/BMP-2细胞表达BMP-2 mRNA。而CHO/空白载体细胞未检测到表达。利用小鼠抗BMP-2的单克隆抗体进行Western印渍分析，经过氧化物酶标记羊抗鼠IgG的抗体(第二抗)显色，在CHO/BMP-2细胞的条件培养基(CM)中可测到BMP-2蛋白，而在CHO/空白载体细胞的CM中不能测到。
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用对碱磷酶(ALP)的刺激作用检测该蛋白的生物活性[1]，结果来自CHO/BMP-2细胞的CM具有很高的刺激FRC细胞ALP活性的能力。相反，来自CHO/空白载体细胞的CM没有这种能力。
在30个CHO/BMP-2细胞克隆中，通过测定CM刺激胎鼠颅骨(FRC)细胞中ALP活性的大小，选出一株BMP-2高表达细胞株。以其对ALP活性的提高能力估算该细胞的BMP-2产量，此细胞株的CM中大约可产生200 ng/ml的重组大鼠BMP-2。空白CHO细胞的CM不影响其它来源BMP-2刺激ALP的活性，说明CHO细胞中不含对BMP-2有抑制或协同作用的因子。
二、结果
将CHO/空白载体或CHO/BMP-2细胞(约2×106个细胞)注射到BALB裸鼠的颅旁皮下组织，18天后，颅骨切片镜检，可见注射携带空白载体的CHO细胞的小鼠颅骨，在接种细胞与其下面的骨膜之间无新骨形成。相反，在注射CHO/BMP-2细胞的小鼠颅骨的骨膜表面发现大量新生的编织骨。用计算机成像系统进行骨计量学的量化分析更说明有明显的新骨形成。
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三、讨论
本文对重组大鼠BMP-2在哺乳动物细胞中的表达进行了在体和离体实验，检测了重组蛋白质的表达及生物学活性。通过Northern和Western印渍分析证明，BMP-2在CHO细胞的mRNA和蛋白质水平的表达。ALP活性测定进一步证明，CHO细胞表达的BMP-2蛋白质具有完整的生物学活性(不再需人工加工)，并且具有诱导骨细胞分化的能力。BMP-2能诱导异位(例如在肌肉组织中)骨形成已有证明[1]，但对正常骨形成的作用尚缺乏研究。本研究首次用在体原位实验证实了BMP-2有诱导正常骨生成的能力。
重组BMP-2对哺乳动物骨折愈合和大块骨缺损的治疗作用的效果已有报导[2]。但BMP-2与其它骨代谢相关生长因子(例如转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子或胰岛素样生长因子等)的作用的比较则仍未清楚。进行上述研究需要获得足够量的有活性的重组BMP-2。本研究为制备活性BMP-2和进一步研究BMP-2与其它生长因子间的相互作用提供了可能性。总之，经稳定转染后，大鼠BMP-2活性蛋白可在CHO细胞中表达，并且无需任何人工加工即具有促进成骨细胞分化和骨形成的作用。
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本课题为天津市自然科学基金资助项目
参考文献
1 Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulates alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblastic cells. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 174：96-101.
2 赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志，1994，10：319.
3 陈棣，叶伟胜.骨形态发生蛋白的成骨功能及临床应用.中华外科杂志，1996，34：602.
(收稿：1997-12-06 修回：1998-02-18)
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