胚胎运动神经元种植至失神经骨骼肌内的观察
作者：姜广良 顾玉东
单位：200040 上海医科大学华山医院手外科
关键词：胚胎；运动神经元；移植，同种；骨骼肌
中华医学杂志980611 【摘要】 目的 观察同种异体胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内的存活状况。方法 用5-溴化尿嘧啶(Brdur)标记孕12天胎鼠运动神经元，种植至成鼠失神经骨骼肌内。在种植后9、22周,取实验侧肌肉作Nissl染色、乙酰胆碱酯酶染色、免疫组织化学染色及ATP酶染色，以显示种植神经元和肌纤维形态。结果 鼠胚胎运动神经元能在失神经骨骼肌内存活，并长出长的轴突与终板连结；可见肌纤维的群化，群化的肌纤维较粗大；对照组肌纤维较细小，且无群化现象。结论 同种异体胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内能存活，并再支配失神经骨骼肌。
Embryonic motoneurons transplanted into denervated skeletal muscles Jiang Guangliang,Gu Yudong.Institute of Hand Surgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai，200040
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To observe the living situation of homografting embryonic motoneurons in denervated skeletal muscles. Methods We transplanted dissociated ventral spinal cord cells from 12 embryonic days rats prelabeled with 5-bromo-2-deoxyuridine(Brdur) into denervated skeletal muscles of adult rats.The denervated skeletal muscles were collected at 9 and 22 weeks respectively，and Nissl，acetylcholinesterases、immunocytochemistry and ATPase staining were used to show the transplanted embryonic motoneurons and the morphography of muscle fibers.Results Transplanted embryonic motoneurons could survive, extend out long axons, and form neuromuscular junctions with muscle fibers. Type grouping fibers with bigger transverse area were also observed in the experimental group. Muscle fibers were much smaller and did not form fiber type grouping in the control group.Conclusion Homografting embryonic motoneurons could survive well and reinnervate the denervated skeletal muscles.
, 百拇医药
【Key words】 Embryo Motoneuron Homograft Skeletal muscle
(Natl Med J China, 1998, 78：434-436)
臂丛神经根性损伤后，使骨骼肌失去中枢神经元的营养而萎缩，尤以手内肌为重。目前，尚无有效的防治肌萎的方法。我们设想用运动神经元移植至失神经骨骼肌内的方法来防治肌萎缩。为此，我们观察了鼠胚胎运动神经元能否耐受消化、分离及在失神经骨骼肌内存活、发育和与终板连结。
材料与方法
一、胎鼠运动神经元的标记
取孕10天SD雌鼠3只，每只鼠在12小时内分6次腹腔内注入用磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.2)溶解的5-溴化尿嘧啶(Brdur)，共160mg，浓度为20 mg/ml。Brdur是胸腺尿嘧啶类似物，在细胞再生的S期可以整合到DNA中，细胞成熟后，胞核能用相应抗体检测出来[1，2]。
, 百拇医药
二、胚胎运动神经元的分离与制备
前述标记母鼠在孕12天时，用4%水合氯醛腹腔内注射麻醉，无菌操作下剖开子宫，取出胎鼠，浸入0.6%葡萄糖缓冲液中，在解剖显微镜下见胎心跳动，证实为活胎。取出脊髓腹侧半，剪碎后，在37℃下，用无钙、镁离子的D-Hank液配制的0.25%的胰蛋白酶消化30分钟；800r/min离心5分钟，吸出上清，沉淀复加Hank液，漂洗后，离心去上清；沉淀加培养液，制成细胞悬液，入培养箱备用，本实验中放置24～48小时。本培养液是在Eagle液内加10%胎牛血清、0.6%葡萄糖及5 ng/ml的神经生长因子[1，2]。
三、胚胎运动神经元的种植
取180～200 g的SD大鼠24只，同前麻醉后，在右侧坐骨神经及胫神经起始处分别结扎，在两结扎线间切断坐骨神经，近断端埋植于臀部肌肉，制成腓
, 百拇医药
图1 Nissl染色示神经细胞位于肌细胞横断面(箭头)间 ×400 图2 示神经细胞发出AchE阳性长轴突，并见发芽 ×200 图3 示肌细胞间AchE染色强阳性细胞，并见轴突与运动终板(箭头)相连 ×200 图4 示Brdur免疫染色阳性神经细胞核 ×1 000 图5 ATP酶染色(pH 9.5)示实验组肌细胞的群化(箭头) ×100 图6 ATP酶染色(pH 9.5)示对照组肌细胞横断面 ×100
肠肌失神经模型。取前述胚胎运动神经元悬液，细胞计数为5.4×106个/ml，用100 μm、0.1 ml的微量进液器，抽取0.2 ml，于12只大鼠腓肠肌的每一头各注入0.1 ml，见肌膜涨起，无液体外漏。另12只大鼠腓肠肌内注入等量的离心上清液与培养液的混合液，作为对照组。
四、实验观察
于实验后9、22周，各取6只实验侧肌肉，放入已在液氮中预冷的异戊醇内10秒钟，然后作20 μm厚的冰冻切片。分别行1%中性红Nissl染色、乙酰胆碱酯酶(AchE)染色、ATP酶染色及Brdur免疫组织化学染色[1～3]。免疫染色用ABC法，同时设置阴性对照。试剂由Sigma公司提供。用TJTY-300分析系统测量神经元的平均直径和面积。
, 百拇医药
结果
一、神经细胞Nissl染色观察
在每一例实验侧骨骼肌的切片中，均见胞浆Nissl颗粒阳性，胞核大而圆，核内含深染的核仁，呈多极性的典型神经细胞；可见长的突起及多突起；细胞形状各异，多位于肌细胞间的结缔组织中，弥漫分布；神经细胞大小不一(图1)。
二、神经细胞AchE染色观察
每一例实验侧骨骼肌切片行AchE染色，均可见神经细胞胞浆内胆碱酯酶颗粒呈茶褐色强阳性，胞核着色浅淡，核仁深染，位于肌细胞间；并可见细胞长出很长的轴突，沿肌细胞的长轴延伸，轴突也呈AchE染色强阳性，并发芽；有些神经细胞多个突起均着色；胞体着色深浅不一(图2、3)。
三、免疫组织化学染色
在每一例切片中，均见染色强度不一Brdur标记的细胞核，弥漫于肌细胞间；细胞核的大小不一，可能大核属于运动神经细胞，小核属于胶质细胞(图4)。阴性对照片无阳性反应。
, 百拇医药
四、失神经骨骼肌的再支配
由ATP酶染色见实验组肌细胞有纤维型分化，横断面积大小不一，大细胞成群化存在，小细胞则无群化现象，群化提示肌纤维的再支配(图5)；而对照组骨骼肌纤维横断面积明显较小，排列紊乱，胶原增生明显，无肌纤维的群化现象(图6)。
五、神经细胞的大小
神经细胞的大小不一，散在。于12例标本测量发出长轴突的123只神经细胞，其平均直径为24.0±4.7 μm，胞体面积为1 900±750 μm2。
讨论
一、胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内存活并发育神经细胞异体移植的研究，主要集中在中枢神经上，脊髓内异位移植的鼠胚胎运动神经元能再支配失神经肢体，并观察到再支配肌肉的动作电位及肢体活动[4]。脊髓内异体移植的鼠胚胎运动神经细胞能存活、迁移和成熟，且主要位于脊髓灰质前角，并可见轴突通过周围神经桥长入宿主肌肉内，使肌纤维分化[2]。本研究显示，染色强阳性的神经元位于肌细胞间，部分大神经细胞具有脊髓前角运动神经细胞的特征，小神经元可能为中间神经元；大神经元发出AchE染色阳性的长轴突，且与终板连结。成鼠α-运动神经细胞的直径为35～70 μm，为测量经细胞核的平面所得[2]。本实验中神经元直径为24 μm，略小，可能测量了非经核平面的神经细胞；其次，所用前角细胞未经纯化处理，混有直径较小的中间神经元；另外植入神经元缺少中枢神经的刺激。研究表明，胚胎运动神经细胞能耐受标记、消化、分离；并在失神经骨骼肌内存活和发育。
, 百拇医药
二、胚胎运动神经细胞在失神经骨骼肌内存活和发育的可能机制
在中枢神经的移植中，预先破坏植入部位神经细胞功能的完整性，可使植入神经元更易存活和发育[1，4]。在本实验中，预先使骨骼肌失神经，可能促进了植入其中的胚胎运动神经元的存活和发育。骨骼肌中存在胶质细胞神经营养因子(GDNF)和神经营养因子4，均能促进离体和在体的运动神经细胞的成活和发育；且骨骼肌提取液对α-运动神经元有营养作用[5]。本实验中，移植神经细胞与靶器官紧密接触，较易获得靶器官的营养。移植床肌肉内有丰富的血供。
三、如何防治失神经骨骼肌萎缩，是临床上亟待解决的难题。神经提取液有延缓失神经骨骼肌萎缩的作用；将骨骼肌与胚胎运动神经元联合移植，可见相互营养作用；而且骨骼肌萎缩与移植运动神经元数目的减少相伴发生[4，5]。本实验创造性地将胚胎脊髓前角细胞移植到在体失神经骨骼肌内，见神经细胞与肌细胞形成终板连接和骨骼肌纤维群化，并延缓了群化细胞的萎缩；因大大地缩短了神经细胞与肌细胞的距离，使上述营养作用可很快发生。
, 百拇医药
本课题为美国中华医学会基金资助项目
参考文献
1 Nogradi A,Vrbova G.The use of embryonic spinal cord grafts to replace identified motoneuron pools by a neurotoxic lectin,volkensin. Exp Neurol, 1994, 129：130-141.
2 Clowry G,Sieradzan K,Vrbova G.Transplants of embryonic motoneurons to adult spinal cord:survival and innervation abilities.Trends Neurosci, 1991，4：355-357.
3 Round JM. A quick simple and reliable method for ATPase in human muscle preparation.Histochem J，1980，12：707-710.
, 百拇医药
4 Brien MK, Oppenheim RW. Development and survival of thoracic motoneurons and hindlimb musclature following transplantation of the thoracic neural tube to the lumber region in the chick embryo: anatomical aspects. J Neurobi, 1990，21：313-340.
5 Trok K, Almstrom S, Olson L. A comparison of the effects of glial cell line-derived neurotriogic factor on spiral cord and cortex cerebri grafts. J Pharmco Exp Therap, 1996, 278：941-949.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-12-10), 百拇医药
单位：200040 上海医科大学华山医院手外科
关键词：胚胎；运动神经元；移植，同种；骨骼肌
中华医学杂志980611 【摘要】 目的 观察同种异体胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内的存活状况。方法 用5-溴化尿嘧啶(Brdur)标记孕12天胎鼠运动神经元，种植至成鼠失神经骨骼肌内。在种植后9、22周,取实验侧肌肉作Nissl染色、乙酰胆碱酯酶染色、免疫组织化学染色及ATP酶染色，以显示种植神经元和肌纤维形态。结果 鼠胚胎运动神经元能在失神经骨骼肌内存活，并长出长的轴突与终板连结；可见肌纤维的群化，群化的肌纤维较粗大；对照组肌纤维较细小，且无群化现象。结论 同种异体胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内能存活，并再支配失神经骨骼肌。
Embryonic motoneurons transplanted into denervated skeletal muscles Jiang Guangliang,Gu Yudong.Institute of Hand Surgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai，200040
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To observe the living situation of homografting embryonic motoneurons in denervated skeletal muscles. Methods We transplanted dissociated ventral spinal cord cells from 12 embryonic days rats prelabeled with 5-bromo-2-deoxyuridine(Brdur) into denervated skeletal muscles of adult rats.The denervated skeletal muscles were collected at 9 and 22 weeks respectively，and Nissl，acetylcholinesterases、immunocytochemistry and ATPase staining were used to show the transplanted embryonic motoneurons and the morphography of muscle fibers.Results Transplanted embryonic motoneurons could survive, extend out long axons, and form neuromuscular junctions with muscle fibers. Type grouping fibers with bigger transverse area were also observed in the experimental group. Muscle fibers were much smaller and did not form fiber type grouping in the control group.Conclusion Homografting embryonic motoneurons could survive well and reinnervate the denervated skeletal muscles.
, 百拇医药
【Key words】 Embryo Motoneuron Homograft Skeletal muscle
(Natl Med J China, 1998, 78：434-436)
臂丛神经根性损伤后，使骨骼肌失去中枢神经元的营养而萎缩，尤以手内肌为重。目前，尚无有效的防治肌萎的方法。我们设想用运动神经元移植至失神经骨骼肌内的方法来防治肌萎缩。为此，我们观察了鼠胚胎运动神经元能否耐受消化、分离及在失神经骨骼肌内存活、发育和与终板连结。
材料与方法
一、胎鼠运动神经元的标记
取孕10天SD雌鼠3只，每只鼠在12小时内分6次腹腔内注入用磷酸缓冲液(PBS)(pH＝7.2)溶解的5-溴化尿嘧啶(Brdur)，共160mg，浓度为20 mg/ml。Brdur是胸腺尿嘧啶类似物，在细胞再生的S期可以整合到DNA中，细胞成熟后，胞核能用相应抗体检测出来[1，2]。
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二、胚胎运动神经元的分离与制备
前述标记母鼠在孕12天时，用4%水合氯醛腹腔内注射麻醉，无菌操作下剖开子宫，取出胎鼠，浸入0.6%葡萄糖缓冲液中，在解剖显微镜下见胎心跳动，证实为活胎。取出脊髓腹侧半，剪碎后，在37℃下，用无钙、镁离子的D-Hank液配制的0.25%的胰蛋白酶消化30分钟；800r/min离心5分钟，吸出上清，沉淀复加Hank液，漂洗后，离心去上清；沉淀加培养液，制成细胞悬液，入培养箱备用，本实验中放置24～48小时。本培养液是在Eagle液内加10%胎牛血清、0.6%葡萄糖及5 ng/ml的神经生长因子[1，2]。
三、胚胎运动神经元的种植
取180～200 g的SD大鼠24只，同前麻醉后，在右侧坐骨神经及胫神经起始处分别结扎，在两结扎线间切断坐骨神经，近断端埋植于臀部肌肉，制成腓
, 百拇医药
图1 Nissl染色示神经细胞位于肌细胞横断面(箭头)间 ×400 图2 示神经细胞发出AchE阳性长轴突，并见发芽 ×200 图3 示肌细胞间AchE染色强阳性细胞，并见轴突与运动终板(箭头)相连 ×200 图4 示Brdur免疫染色阳性神经细胞核 ×1 000 图5 ATP酶染色(pH 9.5)示实验组肌细胞的群化(箭头) ×100 图6 ATP酶染色(pH 9.5)示对照组肌细胞横断面 ×100
肠肌失神经模型。取前述胚胎运动神经元悬液，细胞计数为5.4×106个/ml，用100 μm、0.1 ml的微量进液器，抽取0.2 ml，于12只大鼠腓肠肌的每一头各注入0.1 ml，见肌膜涨起，无液体外漏。另12只大鼠腓肠肌内注入等量的离心上清液与培养液的混合液，作为对照组。
四、实验观察
于实验后9、22周，各取6只实验侧肌肉，放入已在液氮中预冷的异戊醇内10秒钟，然后作20 μm厚的冰冻切片。分别行1%中性红Nissl染色、乙酰胆碱酯酶(AchE)染色、ATP酶染色及Brdur免疫组织化学染色[1～3]。免疫染色用ABC法，同时设置阴性对照。试剂由Sigma公司提供。用TJTY-300分析系统测量神经元的平均直径和面积。
, 百拇医药
结果
一、神经细胞Nissl染色观察
在每一例实验侧骨骼肌的切片中，均见胞浆Nissl颗粒阳性，胞核大而圆，核内含深染的核仁，呈多极性的典型神经细胞；可见长的突起及多突起；细胞形状各异，多位于肌细胞间的结缔组织中，弥漫分布；神经细胞大小不一(图1)。
二、神经细胞AchE染色观察
每一例实验侧骨骼肌切片行AchE染色，均可见神经细胞胞浆内胆碱酯酶颗粒呈茶褐色强阳性，胞核着色浅淡，核仁深染，位于肌细胞间；并可见细胞长出很长的轴突，沿肌细胞的长轴延伸，轴突也呈AchE染色强阳性，并发芽；有些神经细胞多个突起均着色；胞体着色深浅不一(图2、3)。
三、免疫组织化学染色
在每一例切片中，均见染色强度不一Brdur标记的细胞核，弥漫于肌细胞间；细胞核的大小不一，可能大核属于运动神经细胞，小核属于胶质细胞(图4)。阴性对照片无阳性反应。
, 百拇医药
四、失神经骨骼肌的再支配
由ATP酶染色见实验组肌细胞有纤维型分化，横断面积大小不一，大细胞成群化存在，小细胞则无群化现象，群化提示肌纤维的再支配(图5)；而对照组骨骼肌纤维横断面积明显较小，排列紊乱，胶原增生明显，无肌纤维的群化现象(图6)。
五、神经细胞的大小
神经细胞的大小不一，散在。于12例标本测量发出长轴突的123只神经细胞，其平均直径为24.0±4.7 μm，胞体面积为1 900±750 μm2。
讨论
一、胚胎运动神经元在失神经骨骼肌内存活并发育神经细胞异体移植的研究，主要集中在中枢神经上，脊髓内异位移植的鼠胚胎运动神经元能再支配失神经肢体，并观察到再支配肌肉的动作电位及肢体活动[4]。脊髓内异体移植的鼠胚胎运动神经细胞能存活、迁移和成熟，且主要位于脊髓灰质前角，并可见轴突通过周围神经桥长入宿主肌肉内，使肌纤维分化[2]。本研究显示，染色强阳性的神经元位于肌细胞间，部分大神经细胞具有脊髓前角运动神经细胞的特征，小神经元可能为中间神经元；大神经元发出AchE染色阳性的长轴突，且与终板连结。成鼠α-运动神经细胞的直径为35～70 μm，为测量经细胞核的平面所得[2]。本实验中神经元直径为24 μm，略小，可能测量了非经核平面的神经细胞；其次，所用前角细胞未经纯化处理，混有直径较小的中间神经元；另外植入神经元缺少中枢神经的刺激。研究表明，胚胎运动神经细胞能耐受标记、消化、分离；并在失神经骨骼肌内存活和发育。
, 百拇医药
二、胚胎运动神经细胞在失神经骨骼肌内存活和发育的可能机制
在中枢神经的移植中，预先破坏植入部位神经细胞功能的完整性，可使植入神经元更易存活和发育[1，4]。在本实验中，预先使骨骼肌失神经，可能促进了植入其中的胚胎运动神经元的存活和发育。骨骼肌中存在胶质细胞神经营养因子(GDNF)和神经营养因子4，均能促进离体和在体的运动神经细胞的成活和发育；且骨骼肌提取液对α-运动神经元有营养作用[5]。本实验中，移植神经细胞与靶器官紧密接触，较易获得靶器官的营养。移植床肌肉内有丰富的血供。
三、如何防治失神经骨骼肌萎缩，是临床上亟待解决的难题。神经提取液有延缓失神经骨骼肌萎缩的作用；将骨骼肌与胚胎运动神经元联合移植，可见相互营养作用；而且骨骼肌萎缩与移植运动神经元数目的减少相伴发生[4，5]。本实验创造性地将胚胎脊髓前角细胞移植到在体失神经骨骼肌内，见神经细胞与肌细胞形成终板连接和骨骼肌纤维群化，并延缓了群化细胞的萎缩；因大大地缩短了神经细胞与肌细胞的距离，使上述营养作用可很快发生。
, 百拇医药
本课题为美国中华医学会基金资助项目
参考文献
1 Nogradi A,Vrbova G.The use of embryonic spinal cord grafts to replace identified motoneuron pools by a neurotoxic lectin,volkensin. Exp Neurol, 1994, 129：130-141.
2 Clowry G,Sieradzan K,Vrbova G.Transplants of embryonic motoneurons to adult spinal cord:survival and innervation abilities.Trends Neurosci, 1991，4：355-357.
3 Round JM. A quick simple and reliable method for ATPase in human muscle preparation.Histochem J，1980，12：707-710.
, 百拇医药
4 Brien MK, Oppenheim RW. Development and survival of thoracic motoneurons and hindlimb musclature following transplantation of the thoracic neural tube to the lumber region in the chick embryo: anatomical aspects. J Neurobi, 1990，21：313-340.
5 Trok K, Almstrom S, Olson L. A comparison of the effects of glial cell line-derived neurotriogic factor on spiral cord and cortex cerebri grafts. J Pharmco Exp Therap, 1996, 278：941-949.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-12-10), 百拇医药