严重烫伤大鼠骨骼肌蛋白质降解途径及泛素作用的研究
作者：谭银玲 董燕麟
单位：谭银玲 董燕麟 400038 重庆,第三军医大学生物化学教研室
关键词：灼伤；蛋白质降解途径；泛素
中华创伤杂志980615 【摘要】 目的 阐明严重烧伤后蛋白质降解的主要途径,以期为伤后代谢调理和防治提供理论依据。方法 以包括一侧后肢37%体表皮肤全层严重烫伤大鼠为模型,分别抑制不同蛋白质降解途径,以荧光分光光度法测定比目鱼肌酪氨酸体外总释放量,并采用Western blot法观察泛素含量的变化。结果 阻断依赖ATP-泛素途径后,能显著抑制大鼠伤肢蛋白质降解。同时,泛素含量均呈明显的进行性增加。结论 烫伤后骨骼肌蛋白质高分解主要是通过依赖ATP-泛素途径进行的。
Study of Proteolytic Pathway and Role of Ubiquitin on Skeletal Muscle Protein Degradation in Severe Scalded Rats TAN Yin-ling, DONG Yan-lin. Dept. of Biochemistry, Third Military Medical University, Chongqing 400038
, 百拇医药
【Abstract】 Aim To find out the main proteolytic pathway induced by severe burn injury for the prophylaxis and treatment of metabolic changes after burn. Methods Wistar rats inflicted with 37% TBSA third degree scald injury used as the animal models and inhibitors of different proteolytic pathway on the protein degradation of the skeletal muscle were used to determine the release of tyrosine by fluorescence spectrography. The level of ubiquitin was further examined by Western blot. Results When the ATP-ubiquitin-proteasome complex dependent proteolytic system was maximally inhibited after burn, the increased blockade in proteolysis of injured limb was 85.7%, 35.2% and 4.7%, respectively. Additionly the content of ubiquitin had a markedly progressing enhancement on the 1st, 2nd and 3rd day after scald. Conclusion Severe burn injury causes an large activation of an ATP-ubiquitin-proteasome complex dependent proteolytic process, which accompanys the notable increase of ubiquitin content.
, 百拇医药
【Key words】 Burn Proteolytic pathway Ubiquitin
烧伤后机体蛋白质分解代谢增强,并超过合成代谢,从而造成负氮平衡。但造成骨骼肌蛋白质分解加快的原因与途径尚不明确。利用体表皮肤全层烫伤模型,观察不同蛋白降解途径抑制剂对蛋白降解作用影响以及伤后泛素表达,旨在明确伤后蛋白质优势降解途径和泛素在伤后高分解代谢中的作用。
材料与方法
一、材料
1.实验动物:雄性健康Wistar大鼠,体重(150±20)g,本校动物所提供。
2.主要试剂:α-脱氧葡萄糖,E-64,泛素(美国Sigma),抗泛素抗体(美国Wisconsin-Madison College Dr Steve Van Nocker惠赠),甲胺,二硝基酚(上海试剂三厂)。
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二、方法
1.动物分组:动物随机分为5组,(1)未烫伤对照组;(2)烫伤未施加因素组;(3)ATP-泛素途径抑制组:保温液中不含葡萄糖,加入二硝基酚(0.5mmol/L)和α-脱氧葡萄糖(5mmol/L);(4)溶酶体途径抑制组:保温液加入甲胺(10mmol/L);(5)溶酶体途径+Ca2+依赖途径抑制组:保温液中不含Ca2+,加入E-64(100μmol/L)、甲胺(10mmol/L)。
2.动物烫伤处理:用乙醚吸入麻醉后,剪去背部和一侧后肢的毛,将背部(占体表总面积30%)置于90℃热水中7秒钟,随之将一侧后肢置于上述热水中3秒钟。姫3.比目鱼肌蛋白质降解速率测定:将动物断头处死,分离双侧比目鱼肌,按黄涛生等[1]介绍的方法进行酪氨酸总释放量测定。
4.比目鱼肌泛素测定:取双侧比目鱼肌,采用固相免疫印迹测定(Western blot)泛素含量。
, 百拇医药
5.统计处理:数据采用单因素方差分析、t检验及χ2检验进行统计学分析,计量结果以均值±标准差表示。
结 果
一、不同途径抑制剂对比目鱼肌酪氨酸总释放量的影响
烫伤组伤肢酪氨酸总释放量较正常对照组升高44.5%,差别非常显著。依赖ATP-泛素系统被抑制后,烫伤组伤肢酪氨酸总释放量显著下降,达60.1%;溶酶体系统被抑制后,伤肢释放量下降较明显,降低了15.5%;同时抑制依赖Ca2+途径和溶酶体途径,伤肢酪氨酸总释放量下降20.0%与单独抑制溶酶体途径的结果相比无显著差异(表1)。
表1 不同途径抑制剂对酪氨酸总释放量的
影响(nmol Tyr.g湿组织-1.2h-1,
±s) 组别
, 百拇医药
释放量
未施加因素组
312.6±38.2
ATP-泛素途径抑制组
124.6±25.1*
溶酶体途径抑制组
277.5±33.6△
溶酶体+Ca2+途径抑制组
250.1±33.1△
与未施加因素组比较:*P<0.01, 与泛素途径抑制组比较:△P<0.01
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二、烫伤后比目鱼肌泛素含量的变化
烫伤后第1,2,3天伤肢比目鱼肌游离泛素(f-ub)与对照组无明显差异,但结合泛素(c-ub)含量均呈进行性显著增加(表2,附图)
表2 伤肢比目鱼肌泛素含量变化(arbitary unit/50 μg蛋白) 组别
f-ub
c-ub
对照组
48.4±5.9
38.7±4.2
伤后第1天
43.1±4.7
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95.5±8.2*
伤后第2天
44.0±3.2
147.3±16.1△
伤后第3天
44.8±3.3
185.1±19.5△
与相应对照组比较:*P<0.01, 与烫伤后不同天数比较:△P<0.01
附图 比目鱼泛素含量的免疫印迹(Wistern blot)测定结果
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讨 论
烧伤特别是严重烧伤后,机体蛋白质高分解代谢极为常见,其中又以骨骼肌较为突出。明确其蛋白质的降解途径和机制,对于纠正蛋白质的代谢紊乱具有重要意义。生理条件下,骨骼肌与其他真核细胞一样,蛋白质降解途径较复杂,它们包括ATP-泛素途径、溶酶体途径和依赖Ca2+途径等
[2]。其中溶酶体途径主要通过组织蛋白酶B、D、H和L等起作用。依赖Ca2+途径主要通过Ca2+激活中性蛋白酶Calpain Ⅰ或Ⅱ起作用。而依赖ATP-泛素途径则是真核细胞内主要的降解系统。在ATP存在时,泛素与细胞内的底物蛋白共价结合,并将需降解的蛋白提呈给26S蛋白酶复合体降解。细胞内产生的异常蛋白和短周期蛋白大部分是通过该途径降解的。笔者分别使用了不同的抑制剂来观察它们对蛋白质降解速率的影响。这些抑制剂包括甲胺、E-64、二硝基酚(DNP)和α-脱氧葡萄糖(2-DG)[3]。甲胺可改变溶酶体内的pH值,从而抑制85%以上的组织蛋白酶作用。E-64是一种专一的半胱氨酸酶抑制剂。DNP是氧化磷酸化解偶联剂,2-DG可阻断糖酵解产生能量。在依赖ATP泛素系统中,ATP可促进泛素与蛋白质的连续、26S蛋白酶复合体的聚合及其对底物的降解。因此,DNP与2-DG联合使用可阻断依赖ATP-泛素途径。
, http://www.100md.com
本实验使用不同蛋白质降解途径抑制剂后的结果表明,烫伤局部蛋白质降解主要是通过依赖ATP-泛素途径进行的。Lowell等报道骨骼肌中的肌原纤维主要是通过依赖ATP-泛素系统降解,该报道与笔者结果相吻合。但该途径与溶酶体途径的作用有交叉重叠。最近有报道表明,溶酶体中存在泛素与蛋白的结合物,且泛素与溶酶体膜的形成密切相关[4]。提示溶酶体途径是与依赖ATP-泛素相互作用的。以上结果与去神经肌萎缩、肝细胞瘤、感染和饥饿等情况的蛋白质分解代谢情形相似[5，8]。
依赖ATP-泛素系统作用的前提条件是底物蛋白需与多聚泛素结合进而提呈给26S蛋白酶复合体降解。本实验显示烫伤后泛素含量增加,说明有更多的蛋白质与泛素结合而被提呈降解。但有关该途径在烫伤后被激活的原因和机制还不清楚,有待于进一步的实验明确。
本课题受军队“八五”攻关课题基金资助
参考文献
, 百拇医药
[1]黄涛生,董燕麟.烫伤后大鼠比目鱼肌蛋白质代谢的变化及亮氨酸、胰岛素的作用.第三军医大学学报,1987, 9∶16-20.
[2]Kerttelhut IC, Pepalo MT, Migliorini RH, et al. Regulation of different proteolytic pathways in skeletal muscle in fasting and diabetes mellitus. Bragillian J Med Bio Res, 1994, 27∶981-993.
[3]Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell, 1994, 78∶13-21.
[4]Schqarth AL, Brandt RA, Geuge H, et al. Stress-induced alterations in autophagic pathway relationship to ubiquitin system. Am J Physiol, 1992, 262∶1031-1038.
, http://www.100md.com
[5]Medina R, Wing SS, Han HQ, et al. Activation of the ubiquitin-ATP-dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting and denervation atrophy. Biomed Biochem Acta, 1991, 50∶347-358.
[6]Baracos VE, Devivo C, Hoyle D, et al. Activation of the ATP-dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting and denervation atrophy. Am J Physiol, 1995, 268∶996-1006.
[7]Tiao G, Fagan JM, Samuels N, et al. Sepsis stimulates nonlysosomal, energy-dependent proteolysis and increases ubiquitin mRNA levels in rat skeletal muscle. J Clin Invest, 1994, 94∶2255-2264.
[8]Wing SS, Goldberg AL. Glucocorticoids activate the ATP-ubiquitin-dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting. Am J Physiol, 1993, 264∶668-676.
(收稿:1997-05-29 修回:1998-07-23), 百拇医药
单位：谭银玲 董燕麟 400038 重庆,第三军医大学生物化学教研室
关键词：灼伤；蛋白质降解途径；泛素
中华创伤杂志980615 【摘要】 目的 阐明严重烧伤后蛋白质降解的主要途径,以期为伤后代谢调理和防治提供理论依据。方法 以包括一侧后肢37%体表皮肤全层严重烫伤大鼠为模型,分别抑制不同蛋白质降解途径,以荧光分光光度法测定比目鱼肌酪氨酸体外总释放量,并采用Western blot法观察泛素含量的变化。结果 阻断依赖ATP-泛素途径后,能显著抑制大鼠伤肢蛋白质降解。同时,泛素含量均呈明显的进行性增加。结论 烫伤后骨骼肌蛋白质高分解主要是通过依赖ATP-泛素途径进行的。
Study of Proteolytic Pathway and Role of Ubiquitin on Skeletal Muscle Protein Degradation in Severe Scalded Rats TAN Yin-ling, DONG Yan-lin. Dept. of Biochemistry, Third Military Medical University, Chongqing 400038
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【Abstract】 Aim To find out the main proteolytic pathway induced by severe burn injury for the prophylaxis and treatment of metabolic changes after burn. Methods Wistar rats inflicted with 37% TBSA third degree scald injury used as the animal models and inhibitors of different proteolytic pathway on the protein degradation of the skeletal muscle were used to determine the release of tyrosine by fluorescence spectrography. The level of ubiquitin was further examined by Western blot. Results When the ATP-ubiquitin-proteasome complex dependent proteolytic system was maximally inhibited after burn, the increased blockade in proteolysis of injured limb was 85.7%, 35.2% and 4.7%, respectively. Additionly the content of ubiquitin had a markedly progressing enhancement on the 1st, 2nd and 3rd day after scald. Conclusion Severe burn injury causes an large activation of an ATP-ubiquitin-proteasome complex dependent proteolytic process, which accompanys the notable increase of ubiquitin content.
, 百拇医药
【Key words】 Burn Proteolytic pathway Ubiquitin
烧伤后机体蛋白质分解代谢增强,并超过合成代谢,从而造成负氮平衡。但造成骨骼肌蛋白质分解加快的原因与途径尚不明确。利用体表皮肤全层烫伤模型,观察不同蛋白降解途径抑制剂对蛋白降解作用影响以及伤后泛素表达,旨在明确伤后蛋白质优势降解途径和泛素在伤后高分解代谢中的作用。
材料与方法
一、材料
1.实验动物:雄性健康Wistar大鼠,体重(150±20)g,本校动物所提供。
2.主要试剂:α-脱氧葡萄糖,E-64,泛素(美国Sigma),抗泛素抗体(美国Wisconsin-Madison College Dr Steve Van Nocker惠赠),甲胺,二硝基酚(上海试剂三厂)。
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二、方法
1.动物分组:动物随机分为5组,(1)未烫伤对照组;(2)烫伤未施加因素组;(3)ATP-泛素途径抑制组:保温液中不含葡萄糖,加入二硝基酚(0.5mmol/L)和α-脱氧葡萄糖(5mmol/L);(4)溶酶体途径抑制组:保温液加入甲胺(10mmol/L);(5)溶酶体途径+Ca2+依赖途径抑制组:保温液中不含Ca2+,加入E-64(100μmol/L)、甲胺(10mmol/L)。
2.动物烫伤处理:用乙醚吸入麻醉后,剪去背部和一侧后肢的毛,将背部(占体表总面积30%)置于90℃热水中7秒钟,随之将一侧后肢置于上述热水中3秒钟。姫3.比目鱼肌蛋白质降解速率测定:将动物断头处死,分离双侧比目鱼肌,按黄涛生等[1]介绍的方法进行酪氨酸总释放量测定。
4.比目鱼肌泛素测定:取双侧比目鱼肌,采用固相免疫印迹测定(Western blot)泛素含量。
, 百拇医药
5.统计处理:数据采用单因素方差分析、t检验及χ2检验进行统计学分析,计量结果以均值±标准差表示。
结 果
一、不同途径抑制剂对比目鱼肌酪氨酸总释放量的影响
烫伤组伤肢酪氨酸总释放量较正常对照组升高44.5%,差别非常显著。依赖ATP-泛素系统被抑制后,烫伤组伤肢酪氨酸总释放量显著下降,达60.1%;溶酶体系统被抑制后,伤肢释放量下降较明显,降低了15.5%;同时抑制依赖Ca2+途径和溶酶体途径,伤肢酪氨酸总释放量下降20.0%与单独抑制溶酶体途径的结果相比无显著差异(表1)。
表1 不同途径抑制剂对酪氨酸总释放量的
影响(nmol Tyr.g湿组织-1.2h-1,
±s) 组别, 百拇医药
释放量
未施加因素组
312.6±38.2
ATP-泛素途径抑制组
124.6±25.1*
溶酶体途径抑制组
277.5±33.6△
溶酶体+Ca2+途径抑制组
250.1±33.1△
与未施加因素组比较:*P<0.01, 与泛素途径抑制组比较:△P<0.01
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二、烫伤后比目鱼肌泛素含量的变化
烫伤后第1,2,3天伤肢比目鱼肌游离泛素(f-ub)与对照组无明显差异,但结合泛素(c-ub)含量均呈进行性显著增加(表2,附图)
表2 伤肢比目鱼肌泛素含量变化(arbitary unit/50 μg蛋白) 组别
f-ub
c-ub
对照组
48.4±5.9
38.7±4.2
伤后第1天
43.1±4.7
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95.5±8.2*
伤后第2天
44.0±3.2
147.3±16.1△
伤后第3天
44.8±3.3
185.1±19.5△
与相应对照组比较:*P<0.01, 与烫伤后不同天数比较:△P<0.01
附图 比目鱼泛素含量的免疫印迹(Wistern blot)测定结果
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讨 论
烧伤特别是严重烧伤后,机体蛋白质高分解代谢极为常见,其中又以骨骼肌较为突出。明确其蛋白质的降解途径和机制,对于纠正蛋白质的代谢紊乱具有重要意义。生理条件下,骨骼肌与其他真核细胞一样,蛋白质降解途径较复杂,它们包括ATP-泛素途径、溶酶体途径和依赖Ca2+途径等
[2]。其中溶酶体途径主要通过组织蛋白酶B、D、H和L等起作用。依赖Ca2+途径主要通过Ca2+激活中性蛋白酶Calpain Ⅰ或Ⅱ起作用。而依赖ATP-泛素途径则是真核细胞内主要的降解系统。在ATP存在时,泛素与细胞内的底物蛋白共价结合,并将需降解的蛋白提呈给26S蛋白酶复合体降解。细胞内产生的异常蛋白和短周期蛋白大部分是通过该途径降解的。笔者分别使用了不同的抑制剂来观察它们对蛋白质降解速率的影响。这些抑制剂包括甲胺、E-64、二硝基酚(DNP)和α-脱氧葡萄糖(2-DG)[3]。甲胺可改变溶酶体内的pH值,从而抑制85%以上的组织蛋白酶作用。E-64是一种专一的半胱氨酸酶抑制剂。DNP是氧化磷酸化解偶联剂,2-DG可阻断糖酵解产生能量。在依赖ATP泛素系统中,ATP可促进泛素与蛋白质的连续、26S蛋白酶复合体的聚合及其对底物的降解。因此,DNP与2-DG联合使用可阻断依赖ATP-泛素途径。
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本实验使用不同蛋白质降解途径抑制剂后的结果表明,烫伤局部蛋白质降解主要是通过依赖ATP-泛素途径进行的。Lowell等报道骨骼肌中的肌原纤维主要是通过依赖ATP-泛素系统降解,该报道与笔者结果相吻合。但该途径与溶酶体途径的作用有交叉重叠。最近有报道表明,溶酶体中存在泛素与蛋白的结合物,且泛素与溶酶体膜的形成密切相关[4]。提示溶酶体途径是与依赖ATP-泛素相互作用的。以上结果与去神经肌萎缩、肝细胞瘤、感染和饥饿等情况的蛋白质分解代谢情形相似[5，8]。
依赖ATP-泛素系统作用的前提条件是底物蛋白需与多聚泛素结合进而提呈给26S蛋白酶复合体降解。本实验显示烫伤后泛素含量增加,说明有更多的蛋白质与泛素结合而被提呈降解。但有关该途径在烫伤后被激活的原因和机制还不清楚,有待于进一步的实验明确。
本课题受军队“八五”攻关课题基金资助
参考文献
, 百拇医药
[1]黄涛生,董燕麟.烫伤后大鼠比目鱼肌蛋白质代谢的变化及亮氨酸、胰岛素的作用.第三军医大学学报,1987, 9∶16-20.
[2]Kerttelhut IC, Pepalo MT, Migliorini RH, et al. Regulation of different proteolytic pathways in skeletal muscle in fasting and diabetes mellitus. Bragillian J Med Bio Res, 1994, 27∶981-993.
[3]Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell, 1994, 78∶13-21.
[4]Schqarth AL, Brandt RA, Geuge H, et al. Stress-induced alterations in autophagic pathway relationship to ubiquitin system. Am J Physiol, 1992, 262∶1031-1038.
, http://www.100md.com
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[6]Baracos VE, Devivo C, Hoyle D, et al. Activation of the ATP-dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting and denervation atrophy. Am J Physiol, 1995, 268∶996-1006.
[7]Tiao G, Fagan JM, Samuels N, et al. Sepsis stimulates nonlysosomal, energy-dependent proteolysis and increases ubiquitin mRNA levels in rat skeletal muscle. J Clin Invest, 1994, 94∶2255-2264.
[8]Wing SS, Goldberg AL. Glucocorticoids activate the ATP-ubiquitin-dependent proteolytic system in skeletal muscle during fasting. Am J Physiol, 1993, 264∶668-676.
(收稿:1997-05-29 修回:1998-07-23), 百拇医药