转化生长因子-β启动骨膜下新生骨生成的实验研究
作者：徐虎 胡蕴玉
单位：胡蕴玉 710032 西安,第四军医大学附属西京医院全军骨科研究所；徐虎 解放军第三五九医院骨科,镇江,212001
关键词：转化生长因子-β；骨生成
中华创伤杂志980606 【摘要】 目的 观察转化生长因子-β(TGF-β)在小鼠股骨骨膜下启动骨及软骨生成过程。方法 将TGF-β纯品、TGF-β粗提品、BSA及PBS分别注射于小鼠股骨骨膜下,最多连续注射9天,分别于4,7,14和21天处死小鼠,观察注射局部的组织学变化。结果 注射TGF-β组动物股骨骨膜下皆可见新生软骨和骨组织,存在膜内成骨和软骨内成骨两种成骨方式,TGF-β粗提品组在成骨过程的时相上早于TGF-β纯品组。注射BSA、PBS组部分动有骨膜反应,空白对照组无变化。结论 TNF-β在体内可启动骨及软骨生成过程,TGF-β粗提品在促成骨过程的时相上早于TGF-β纯品。
, 百拇医药
Osteogenesis Promoted by Transforming Growth Factor-β Under Periosteum of Mouse Femur XU Hu, HU Yun-yu. Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
【Abstract】 Aim To observe the effect of transforming growth factor-β (TGF-β) on promoting the process of chondrogenesis and osteogenesis under the periosteum of mouse femur. Methods Pure TGF-β, impure TGF-β, BSA and PBS were separately injected under the periosteum of mouse femur successively for 9 days at most, then the femora were removed at 4th, 7th, 14th and 21st day and were processed and observed under microscope. Results In all the animals injected with TGF-β, condrogenesis and osteogenesis were found under the periosteum and both intramembranous and endochondral osteogenesis were observed. The effect of impure TGF-β on osteogenesis took place at an earlier phase than that of pure TGF-β. Proliferation of periosteum was observed in some of the animals injected with BSA and PBS. The control animals with no injection showed no change. Conclusion TGF-β can promote the process of chondrogenesis and osteogenesis in vivo. And impure TGF-β shows earlier effect than that of pure TGF-β.
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【Key words】 Transforming growth factor-β Osteogenesis
转化生长因子-β(TGF-β)是一种可由多种细胞分泌的多功能细胞因子。近年的研究表明,TGF-β存在于多种组织和细胞中,生物学作用广泛,可调解多种正常或瘤性细胞的生长及分化[1]。皮下注射TGF-β可加速伤口愈合,但将TGF-β应用于骨组织的体内试验较少见。笔者从牛血小板中提取并纯化了TGF-β,注射于小鼠股骨骨膜下,观察TGF-β粗提品及纯品对骨及软骨生成的诱导作用。现报告如下。
材料与方法
1.TGF-β的提取:TGF-β由本所参照Assoian等[2]的方法自行提取。从新鲜牛全血中分离血小板,给洗涤液[3]洗涤2次后,加入酸醇抽提液,匀浆破碎,抽提24小时,离心,取上清加无水乙醇和乙醚沉淀,离心,弃上清,沉淀溶于1mol/L乙酸,离心,取上清,冻干,即得到粗提品,将粗提品溶液0.5mol/L HAc/0.9% NaCl,经Superdex75凝胶层析注层析,收集洗脱液进行活性测定,取其中的活性部分,透析后溶于8mol/L尿素,4℃过夜,第2次经Superdex75凝胶柱层析,收集洗脱峰中的活性部分,透析,冻干,即获纯品。
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2.TGF-β的活性测定[4]:将TGF-β注射于出生1天的Balb/c小鼠颈后部皮下,1,24和48小时各注射1次,第72小时取材,10%中性甲醛固定,制石蜡切片,HE染色,光镜下观察。
3.动物处理:将52只Balb/c小鼠,体重20～22g,随机分为A,B,C,D,E5组(表1),每日在A,B,C,D 4组小鼠左侧股骨骨膜下注射药液25μl,连续注射9天,A组注射TGF-β粗提品(其中所含纯净TGF-β与B组相当), B组注射TGF-β纯品,C组注射BSA,D崐组注射0.01mol/L PBS,E组为空白对照。于4,7,14和21天4个时间点A,B,C,D,E组每次分别处死4,4,2,2,2只动物(表1)。取左侧股骨固定于10%中性甲醛。
附表 动物的分组及处理 组别
鼠数
注射药品
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剂量
注射时间(d)
处死时间(d)
A
16
16TGF-β粗提品
400μg/d
3,6,9,9
4,7,14,21
B
16
TGF-β纯品
8μg/d
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3,6,9,9
4,7,14,21
C
8
BSA
400μg/d
3,6,9,9
4,7,14,21
D
8
PBS
25μl
3,6,9,9
, 百拇医药
4,7,14,21
E
8
-
-
-
4,7,14,21
4.组织学观察:标本经固定24小时后,混合脱钙液脱钙24小时,流水漂洗24小时,逐级脱水,浸蜡,石蜡包埋。作5μm厚切片,HE染色,光镜观察。
结 果
1.TGF-β活性测定试验:光镜下观察,在注射TGF-β的局部皮下可见明显的组织增生现象,大量成纤维细胞、间充质细胞、巨噬细胞及粒细胞聚集,并有大量成纤维细胞包绕的新生毛细血管,表明TGF-β活性良好。
, 百拇医药
2.组织学观察:A组4天时,骨外膜下可见间充质细胞和成纤维细胞大量增生,局部组织隆起形成丘状结构,但骨外膜无明显变化,7天可见增生组织中出现大量形态幼稚的软骨细胞,细胞扁圆、体积较小,也有少数成熟的软骨细胞,体积大、圆形,形成软骨巢(图1),同时在软骨巢周围可见膜内成骨现象,新生的类骨质在骨膜下沿骨干方向排列,着色浅红。14天软骨巢增大,并向下侵蚀骨干的皮质骨,软骨细胞趋向成熟,细胞圆形、核大,胞浆呈嗜碱性,周围的膜内成骨区域骨小梁形成,着色加深(图2),21天出现软骨内骨化,软骨细胞变性、死亡,出现大量成骨细胞,分泌骨基质,形成原始骨小梁,周围膜内成骨的骨小梁成熟,着色深,形成骨髓腔,腔内可见破骨细胞及红细胞(图3)。
图1 A组7天时,增生组织中出现大量幼稚软骨细胞及
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少数较成熟的软骨细胞,形成软骨巢 HE×400
图2 A组14天时,软骨巢周围的膜内成骨区域骨小梁形成,并向下侵蚀骨皮质 HE×100
图3 A组21天时,膜内成骨区的骨小梁成熟,形成骨髓腔,腔内可见红细胞 HE×400
B组4天可见明显的骨膜反应,7天有软骨细胞出现,但较A组同一时间组少,形态幼稚,有膜内成骨现象(图4),14天形成软骨巢,21天软骨巢成熟,膜内成骨区形成骨小梁,与A组相比,B组成骨过程相似,但在时相上显得滞后。
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图4 B组7天时,骨膜下新生软骨细胞 HE×400
C,D组部分动物7天后可有骨膜反应,无其他明显变化,E组无变化。
讨 论
TGF-β是一种多功能的细胞因子,存在于多种细胞,生物学作用广泛,且对细胞的生长分化常呈现出双向式的调节作用。在骨组织中也体现了TGF-β的这种特性,TGF-β在小鼠颅骨细胞培养中表现出成骨潜能[5],可以诱导间充质细胞表现出软骨细胞样形态及其功能[6],可以促进成骨细胞增生[7],抑制其分化,可产生成骨细胞趋化,以及促进细胞外基质的合成。
本文结果显示,TGF-β纯品及粗提品均可启动软骨及骨的生成过程,在注射TGF-β粗提品3天后,可见骨膜下大量成纤维细胞、间充质细胞增生,形成明显的骨膜反应。这与以往报道的某些体上试验的结果相同[6]。一些文献[1，8]认为,TGF-β1、β2对于细胞的增殖、分化、细胞外基质的合成有双向调节作用。本文中骨膜下注射TGF-β后促进增殖效应呈现优势,注射TGF-β 7天后,可见大量软骨细胞增生,形成软骨巢,并在周围出现膜内成骨现象,高倍镜下观察两者分界清晰,说明为同一时间出现的两种效应,其原因可能是TGF-β对间充质细胞的诱导分化作用趋向软骨细胞、骨细胞两个方向。9天时停止注射,在14和21天时,新生的软骨细胞变性、死亡,出现软骨内骨化,膜内骨化产生的类骨质进一步钙化,发育为原始骨小梁,出现原始骨髓腔,21天时,髓腔内已有红细胞。TGF-β启动了骨生成过程。
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A、B两组TGF-β注射液中所含纯净TGF-β是相同的,但从启动成骨效应来看,A组在时相上快于B组,其软骨巢形成早,细胞形态成熟,分析其原因可能是TGF-β从血小板中提取,粗提品中还含有其他细胞因子,如PDGF等[3],也可促进骨细胞、软骨细胞生成和分化,以及诱导未分化细胞分化。这些因子可单独作用于骨组织,促骨生成效应,还可通过与TGF-β的相互作用,调节多种细胞因子的表达水平[9],影响骨生成过程。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39570709)
参考文献
[1]Lawrence DA. Transforming growth factor-β: An overview. Kidney International, 1995, 47(Suppl)∶19-23.
, 百拇医药 [2]Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, et al. Transforming growth factor-β in human platelets. J Biol Chem, 1983, 258∶7155-7160.
[3]Antoniades HN, Scher CD,Stiles CD. Purification of human platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76∶1809-1813.
[4]Roberts AB, Sporn MB, Assoian RK, et al. Transforming growth factor type β: Rapid induction of fibrosis and formation in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83∶4167-4171.
, 百拇医药
[5]Das SK, Flanders KC, Andrews GK, et al. Expression of transforming growth factor-beta isoforms (β2 and β3) in the mouse uterus: Analysis of the periimplantation period and effects of ovarian steroids. Endocrinology, 1992, 130∶3459-3466.
[6]Seyedin SM, Thompson AY, Bentz H, et al. Cartilage-inducing factor-A. J Biol Chem, 1986, 261∶5693-5709.
[7]Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of TGF-β on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein-2, osteocalin, osteopontin, alkaline phosphatase and type I collagen mRNA in prolonged cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9∶855-863.
, 百拇医药
[8]Sporn MB, Roberts AB. Transforming growth factor-β: Recent progress and new challenges. J Cell Biol, 1992, 119∶1017-1021.
[9]Silberstein FC, De-Simone R, Levi G, et al. Cytokine-regulated expression of platelet-derived growth factor gene and protien in cultured human astrocytes. J Neurochem, 1996, 66∶1409-1417.
(收稿:1997-10-20 修回:1998-07-08), 百拇医药
单位：胡蕴玉 710032 西安,第四军医大学附属西京医院全军骨科研究所；徐虎 解放军第三五九医院骨科,镇江,212001
关键词：转化生长因子-β；骨生成
中华创伤杂志980606 【摘要】 目的 观察转化生长因子-β(TGF-β)在小鼠股骨骨膜下启动骨及软骨生成过程。方法 将TGF-β纯品、TGF-β粗提品、BSA及PBS分别注射于小鼠股骨骨膜下,最多连续注射9天,分别于4,7,14和21天处死小鼠,观察注射局部的组织学变化。结果 注射TGF-β组动物股骨骨膜下皆可见新生软骨和骨组织,存在膜内成骨和软骨内成骨两种成骨方式,TGF-β粗提品组在成骨过程的时相上早于TGF-β纯品组。注射BSA、PBS组部分动有骨膜反应,空白对照组无变化。结论 TNF-β在体内可启动骨及软骨生成过程,TGF-β粗提品在促成骨过程的时相上早于TGF-β纯品。
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Osteogenesis Promoted by Transforming Growth Factor-β Under Periosteum of Mouse Femur XU Hu, HU Yun-yu. Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
【Abstract】 Aim To observe the effect of transforming growth factor-β (TGF-β) on promoting the process of chondrogenesis and osteogenesis under the periosteum of mouse femur. Methods Pure TGF-β, impure TGF-β, BSA and PBS were separately injected under the periosteum of mouse femur successively for 9 days at most, then the femora were removed at 4th, 7th, 14th and 21st day and were processed and observed under microscope. Results In all the animals injected with TGF-β, condrogenesis and osteogenesis were found under the periosteum and both intramembranous and endochondral osteogenesis were observed. The effect of impure TGF-β on osteogenesis took place at an earlier phase than that of pure TGF-β. Proliferation of periosteum was observed in some of the animals injected with BSA and PBS. The control animals with no injection showed no change. Conclusion TGF-β can promote the process of chondrogenesis and osteogenesis in vivo. And impure TGF-β shows earlier effect than that of pure TGF-β.
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【Key words】 Transforming growth factor-β Osteogenesis
转化生长因子-β(TGF-β)是一种可由多种细胞分泌的多功能细胞因子。近年的研究表明,TGF-β存在于多种组织和细胞中,生物学作用广泛,可调解多种正常或瘤性细胞的生长及分化[1]。皮下注射TGF-β可加速伤口愈合,但将TGF-β应用于骨组织的体内试验较少见。笔者从牛血小板中提取并纯化了TGF-β,注射于小鼠股骨骨膜下,观察TGF-β粗提品及纯品对骨及软骨生成的诱导作用。现报告如下。
材料与方法
1.TGF-β的提取:TGF-β由本所参照Assoian等[2]的方法自行提取。从新鲜牛全血中分离血小板,给洗涤液[3]洗涤2次后,加入酸醇抽提液,匀浆破碎,抽提24小时,离心,取上清加无水乙醇和乙醚沉淀,离心,弃上清,沉淀溶于1mol/L乙酸,离心,取上清,冻干,即得到粗提品,将粗提品溶液0.5mol/L HAc/0.9% NaCl,经Superdex75凝胶层析注层析,收集洗脱液进行活性测定,取其中的活性部分,透析后溶于8mol/L尿素,4℃过夜,第2次经Superdex75凝胶柱层析,收集洗脱峰中的活性部分,透析,冻干,即获纯品。
, http://www.100md.com
2.TGF-β的活性测定[4]:将TGF-β注射于出生1天的Balb/c小鼠颈后部皮下,1,24和48小时各注射1次,第72小时取材,10%中性甲醛固定,制石蜡切片,HE染色,光镜下观察。
3.动物处理:将52只Balb/c小鼠,体重20～22g,随机分为A,B,C,D,E5组(表1),每日在A,B,C,D 4组小鼠左侧股骨骨膜下注射药液25μl,连续注射9天,A组注射TGF-β粗提品(其中所含纯净TGF-β与B组相当), B组注射TGF-β纯品,C组注射BSA,D崐组注射0.01mol/L PBS,E组为空白对照。于4,7,14和21天4个时间点A,B,C,D,E组每次分别处死4,4,2,2,2只动物(表1)。取左侧股骨固定于10%中性甲醛。
附表 动物的分组及处理 组别
鼠数
注射药品
, 百拇医药
剂量
注射时间(d)
处死时间(d)
A
16
16TGF-β粗提品
400μg/d
3,6,9,9
4,7,14,21
B
16
TGF-β纯品
8μg/d
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3,6,9,9
4,7,14,21
C
8
BSA
400μg/d
3,6,9,9
4,7,14,21
D
8
PBS
25μl
3,6,9,9
, 百拇医药
4,7,14,21
E
8
-
-
-
4,7,14,21
4.组织学观察:标本经固定24小时后,混合脱钙液脱钙24小时,流水漂洗24小时,逐级脱水,浸蜡,石蜡包埋。作5μm厚切片,HE染色,光镜观察。
结 果
1.TGF-β活性测定试验:光镜下观察,在注射TGF-β的局部皮下可见明显的组织增生现象,大量成纤维细胞、间充质细胞、巨噬细胞及粒细胞聚集,并有大量成纤维细胞包绕的新生毛细血管,表明TGF-β活性良好。
, 百拇医药
2.组织学观察:A组4天时,骨外膜下可见间充质细胞和成纤维细胞大量增生,局部组织隆起形成丘状结构,但骨外膜无明显变化,7天可见增生组织中出现大量形态幼稚的软骨细胞,细胞扁圆、体积较小,也有少数成熟的软骨细胞,体积大、圆形,形成软骨巢(图1),同时在软骨巢周围可见膜内成骨现象,新生的类骨质在骨膜下沿骨干方向排列,着色浅红。14天软骨巢增大,并向下侵蚀骨干的皮质骨,软骨细胞趋向成熟,细胞圆形、核大,胞浆呈嗜碱性,周围的膜内成骨区域骨小梁形成,着色加深(图2),21天出现软骨内骨化,软骨细胞变性、死亡,出现大量成骨细胞,分泌骨基质,形成原始骨小梁,周围膜内成骨的骨小梁成熟,着色深,形成骨髓腔,腔内可见破骨细胞及红细胞(图3)。
图1 A组7天时,增生组织中出现大量幼稚软骨细胞及
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少数较成熟的软骨细胞,形成软骨巢 HE×400
图2 A组14天时,软骨巢周围的膜内成骨区域骨小梁形成,并向下侵蚀骨皮质 HE×100
图3 A组21天时,膜内成骨区的骨小梁成熟,形成骨髓腔,腔内可见红细胞 HE×400
B组4天可见明显的骨膜反应,7天有软骨细胞出现,但较A组同一时间组少,形态幼稚,有膜内成骨现象(图4),14天形成软骨巢,21天软骨巢成熟,膜内成骨区形成骨小梁,与A组相比,B组成骨过程相似,但在时相上显得滞后。
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图4 B组7天时,骨膜下新生软骨细胞 HE×400
C,D组部分动物7天后可有骨膜反应,无其他明显变化,E组无变化。
讨 论
TGF-β是一种多功能的细胞因子,存在于多种细胞,生物学作用广泛,且对细胞的生长分化常呈现出双向式的调节作用。在骨组织中也体现了TGF-β的这种特性,TGF-β在小鼠颅骨细胞培养中表现出成骨潜能[5],可以诱导间充质细胞表现出软骨细胞样形态及其功能[6],可以促进成骨细胞增生[7],抑制其分化,可产生成骨细胞趋化,以及促进细胞外基质的合成。
本文结果显示,TGF-β纯品及粗提品均可启动软骨及骨的生成过程,在注射TGF-β粗提品3天后,可见骨膜下大量成纤维细胞、间充质细胞增生,形成明显的骨膜反应。这与以往报道的某些体上试验的结果相同[6]。一些文献[1，8]认为,TGF-β1、β2对于细胞的增殖、分化、细胞外基质的合成有双向调节作用。本文中骨膜下注射TGF-β后促进增殖效应呈现优势,注射TGF-β 7天后,可见大量软骨细胞增生,形成软骨巢,并在周围出现膜内成骨现象,高倍镜下观察两者分界清晰,说明为同一时间出现的两种效应,其原因可能是TGF-β对间充质细胞的诱导分化作用趋向软骨细胞、骨细胞两个方向。9天时停止注射,在14和21天时,新生的软骨细胞变性、死亡,出现软骨内骨化,膜内骨化产生的类骨质进一步钙化,发育为原始骨小梁,出现原始骨髓腔,21天时,髓腔内已有红细胞。TGF-β启动了骨生成过程。
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A、B两组TGF-β注射液中所含纯净TGF-β是相同的,但从启动成骨效应来看,A组在时相上快于B组,其软骨巢形成早,细胞形态成熟,分析其原因可能是TGF-β从血小板中提取,粗提品中还含有其他细胞因子,如PDGF等[3],也可促进骨细胞、软骨细胞生成和分化,以及诱导未分化细胞分化。这些因子可单独作用于骨组织,促骨生成效应,还可通过与TGF-β的相互作用,调节多种细胞因子的表达水平[9],影响骨生成过程。
本课题受国家自然科学基金资助(No.39570709)
参考文献
[1]Lawrence DA. Transforming growth factor-β: An overview. Kidney International, 1995, 47(Suppl)∶19-23.
, 百拇医药 [2]Assoian RK, Komoriya A, Meyers CA, et al. Transforming growth factor-β in human platelets. J Biol Chem, 1983, 258∶7155-7160.
[3]Antoniades HN, Scher CD,Stiles CD. Purification of human platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76∶1809-1813.
[4]Roberts AB, Sporn MB, Assoian RK, et al. Transforming growth factor type β: Rapid induction of fibrosis and formation in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83∶4167-4171.
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[5]Das SK, Flanders KC, Andrews GK, et al. Expression of transforming growth factor-beta isoforms (β2 and β3) in the mouse uterus: Analysis of the periimplantation period and effects of ovarian steroids. Endocrinology, 1992, 130∶3459-3466.
[6]Seyedin SM, Thompson AY, Bentz H, et al. Cartilage-inducing factor-A. J Biol Chem, 1986, 261∶5693-5709.
[7]Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of TGF-β on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein-2, osteocalin, osteopontin, alkaline phosphatase and type I collagen mRNA in prolonged cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9∶855-863.
, 百拇医药
[8]Sporn MB, Roberts AB. Transforming growth factor-β: Recent progress and new challenges. J Cell Biol, 1992, 119∶1017-1021.
[9]Silberstein FC, De-Simone R, Levi G, et al. Cytokine-regulated expression of platelet-derived growth factor gene and protien in cultured human astrocytes. J Neurochem, 1996, 66∶1409-1417.
(收稿:1997-10-20 修回:1998-07-08), 百拇医药