维甲酸对小鼠牙胚冠部形态发生的影响
作者：高玉光 樊明文 边专 韩建国
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院(高玉光现在山东滨州医学院口腔内科工作)
关键词：维甲酸；器官培养；形态发生
中华口腔医学杂志980613 【摘要】 目的 探讨维甲酸对早期牙胚形态发生的影响。方法 利用体外鼠磨牙牙胚器官培养模型，观察不同剂量维甲酸对14天胎龄的小鼠下颌第一磨牙牙胚形态发育的影响。结果 培养6天后，在不含维甲酸的培养基中牙胚形成明显的牙乳头尖；当培养基中维甲酸的浓度为1×10-7 mol/L时，牙胚冠部仍形成明显的牙乳头尖；当培养基中维甲酸的浓度为1×10-6 mol/L时，牙胚冠部无牙乳头尖形成。结论 牙胚冠部形态发生与维甲酸剂量有密切关系，过量的维甲酸可抑制牙胚冠部牙乳头尖的形成。
The effect of retinoic acid on crown morphogenesis of mouse tooth germs in vitro
, 百拇医药
Gao Yuguang, Fan Mingwen, Bian Zhuan, et al. College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
【Abstract】 Objective To study the effects of retinoic acid on crown morphogenesis of early tooth germs.Methods Mouse tooth organ culture model was used and the functions of different retinoic acid concentration on the first mandibular molar germs of 14-day old mouse embryo were examined.Results The first mandibular molar germ of 14-day old mouse was at the bud stage. After 6 days culture, tooth germs in culture medium (not containing retinoic acid) developed from bud stage to bell stage and formed normal cusps. The morphogenesis of tooth germs in medium containing 1×10-7 mol/L retinoic acid was similar to molar germs in the medium without retinoic acid. When the concentration of retinoic acid increased to 1×10-6mol/L, the mouse tooth germs still developed from bud stage to bell stage, but normal cusps was not formed.Conclusion The results suggest that high concentration of retinoic acid alter crown morphogenesis of tooth germs.
, 百拇医药
【Key words】 Tretinoin Organ culture Morphogenesis
牙齿发育畸形是临床上常见的牙体疾病，其发生与环境因素(如妊娠期母体患有某些疾病、某些化学药物的作用及营养成分的缺乏等)有密切关系。维甲酸是维生素A在体内代谢后具有多方面生物学活性的终产物，对胚胎发育、骨骼和上皮组织的生长分化以及视觉功能等许多方面都有重要作用。维甲酸的生物学作用又与维甲酸的剂量和作用时间有密切关系。我们通过小鼠磨牙牙胚的体外培养模型来探讨维甲酸对体外牙胚形态发生的影响。
材料与方法
1.标本来源：本实验所用小鼠为湖北医学科学院提供的昆明小鼠。小鼠交配后的胎龄计算以见到阴道栓时定为零天。将14天胎龄的昆明小鼠断颈处死，浸入75%酒精中消毒15 s。取鼠胎下颌并于体式显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚。方法如下：在含10%胎牛血清的Hanks液中用显微外科手术镊在鼠胎下颌骨磨牙区的近中端将颌骨固定，用探针将刚开始形成的颌骨骨板及软骨与其上方的口腔上皮和上皮下组织分开。在牙胚发育的蕾状期，口腔上皮与牙胚器官紧密相连，在确定下颌第一磨牙牙胚位置后，除与下颌第一磨牙牙胚成釉器相连的口腔上皮外，其周围组织包括远中端的牙板上皮应尽可能分离干净。
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2.培养方法：培养基为RPMI-1640半固态培养基，含青霉素5×104U/L，链霉素50 mg/L，维生素C 200mg/L，N-双哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES) 20mmol/L，胎牛血清(Gibco)20%，琼脂(Sigma)0.5%。培养基中维甲酸(全反式，Sigma)的浓度为1×10-7 mol/L和1×10-6 mol/L，以不含维甲酸的培养基作对照。将分离的14天胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于RPMI-1640半固体培养基表面，于37℃、含5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养6天，每48 h更换培养基1次。
3.标本制作：分别将14天和18天胎龄的鼠胎下颌及培养6天后的14天胎龄的鼠胎牙胚置于Bouin＇s固定液中固定8h，PBS洗涤30 min，再用含少量饱和碳酸锂溶液的70%酒精充分洗涤，直至牙胚的黄颜色全部褪去。常规脱水、石蜡包埋、制成5 μm厚的连续组织切片，H染色，镜下观察。
, 百拇医药
结果
1.14天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于蕾状期，牙板上皮开始向间充质深部增殖，邻近的外间充质细胞密度增加(图1)。
2.18天鼠胎的下颌第一磨牙牙胚处于钟状期，成釉器分为4层：内釉上皮、中间层、星网状层和外釉上皮。成釉器的颈环上皮向深部增殖包绕牙乳头并形成明显的牙乳头尖(图2)。
3.14天鼠胎牙胚培养6天后，在不含维甲酸的培养基中牙胚由蕾状期发育至钟状期，牙胚冠部形成明显的牙乳头尖(图3)，与18天鼠胎牙胚形态相似；当培养基中维甲酸浓度为1×10-7 mol/L时，培养6天后牙胚冠部仍有牙乳头尖形成(图4)；当培养基中维甲酸的浓度增至1×10-6 mol/L时，培养6天后牙胚仍由蕾状期发育至钟状期，但牙胚冠部无牙乳头尖形成(图5)。
讨论
, 百拇医药
本组研究结果表明：不论培养基中是否含有维甲酸，14天胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚培养6天后均由蕾状期发育至钟状期，但过量的维甲酸可抑制牙胚冠部牙乳头尖的形成。
已往的实验结果显示，维生素A过量可导致胚胎发育障碍，尤其是颅面部发育障碍[1，2]。动物体内注入过量的维生素A可导致胚胎的颌面部发育障碍，如腭裂、小颌畸形等；在牙板开始发生之前，在动物体内注入过量的维生素A则可导致多生牙和融合牙。
牙胚培养是研究牙胚发育的一种良好方法，体外培养排除了体内复杂因素的干扰，可用于研究单一因素对牙胚发育的影响。Kronmiller等[3]利用体外培养手段发现体外过量的维生素A可引起切牙区额外牙蕾以及磨牙区牙蕾消失；在牙胚发育的钟状期，体外过量维甲酸可造成成牙本质细胞和成釉细胞分化障碍[4]。维甲酸及维生素A的这些生物学作用与其作用剂量、作用时间以及胚胎的发育阶段有关。
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关于维甲酸调控牙胚发育的分子机制尚不清楚。目前的研究表明，体内存在多种维甲酸受体并可将其分为两类：一类是细胞核受体，维甲酸可通过细胞核受体直接调节目的基因的表达；另一类是细胞浆结合蛋白受体，它可能参与了维甲酸的贮存和运输[5，6]。在牙胚发育过程中，基底膜可控制牙乳头外围细胞的增殖和分化，而牙乳头细胞的增殖和分化又决定了牙胚冠部形态的发生[7]。有研究表明，维甲酸的生物学作用与细胞外基质和生长因子关系密切，体外维甲酸除了能够促进胞外基质(如氨基聚糖、胶原和层粘连蛋白)的合成[8]，还能够诱导转化生长因子-β2和一种肝素结合生长因子(Midkine)的表达[9，10]。本研究表明了维甲酸能够改变牙胚冠部形态的发生，但维甲酸调控牙胚形态的发生与细胞外基质和生长因子的关系尚需进一步研究。
(本文图1～5见插页第23页)
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图1 14天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于蕾状期，牙板上皮向深部增殖，邻近间充质细胞密度增加。 dl:牙板上皮，m:牙间充质(H 20×2.5) 图2 18天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于钟状期，成釉器的颈环上皮向深部增殖包绕牙乳头并形成明显的牙乳头尖。ode:外釉上皮，s:星网状层，ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图3 培养6天后，在不含维甲酸的培养基中，牙胚由蕾状期发育至钟状期，牙胚冠部形态发育正常，有明显牙乳头尖出现(↑所示)。ide：内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图4 培养基中维甲酸浓度为1×10-7 mol/L时，培养6天后，牙胚冠部仍有明显的牙乳头尖形成(↑所示)。ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图5当培养基中维甲酸增至1×10-6 mol/L时，培养6天后，牙胚仍由蕾状期发育至钟状期，但牙乳头尖消失。ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Lammer EJ, Chen OT, Hoar RM, et al. Retinoic acid embryopathy. New Engl J Med, 1985, 313:837-841.
2 Knudsen PA. Tooth germs in non-exencephalic siblings of mouse embroys with exencephaly induced by hyper-vitaminosis A. Acta Odontol Scand, 1967, 25:669-676.
3 Kronmiller JE, Upholt WB, Kollar EJ. Alteration of murine odontogenic patterning and prolongation of expression of epidermal growth factor mRNA by retinol in vitro. Arch Oral Biol, 1992, 37:129-138.
, http://www.100md.com
4 Humerinta K, Thesleff I, Saxen L. In vitro inhibition of mouse odontoblast differentiation by vitamin A. Archs Oral Biol, 1980, 25:385-393.
5 Mark MP, Bloch-Zupan A, Wolf C, et al. Involvement of cellular retinoic acid-binding proteins I and II (CRABP I and CRABP II) and of the cellular retinol-binding protein I (CRBP I) in odontogenesis in the mouse. Differentiation, 1991, 48:89-98.
6 Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M, et al. Expression of nuclear retinoic acid receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994, 57:195-203.
, 百拇医药
7 Kollar EJ, Baird GR. Tissue interactions in embryonic mouse tooth germs. II. The inductive role of the dental papilla. J Embryol Exp Morphol, 1970, 24:173-186.
8 Bloch-Zupan A, Mark MP, Weber B, et al. In vitro effects of retinoic acid on mouse incisor development. Arch Oral Biol, 1994, 39:891-900.
9 Glick AB, Flanders KC, Danielpour D, et al. Retinoic acid induces transforming growth factor-beta 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Cell Regul, 1989, 1:87-97.
10 Mitsiadis TA, Muramatsu T, Muramatsu H, et al. Midkine (MK), a heparin-binding growth/differentiation factor, is regulated by retinoic acid and epithelia-mesenchymal interactions in the developing mouse tooth ,and affects cell proliferation and morphogenesis. J Cell Biol, 1995, 129:267-281.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-07-27), 百拇医药
单位：430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院(高玉光现在山东滨州医学院口腔内科工作)
关键词：维甲酸；器官培养；形态发生
中华口腔医学杂志980613 【摘要】 目的 探讨维甲酸对早期牙胚形态发生的影响。方法 利用体外鼠磨牙牙胚器官培养模型，观察不同剂量维甲酸对14天胎龄的小鼠下颌第一磨牙牙胚形态发育的影响。结果 培养6天后，在不含维甲酸的培养基中牙胚形成明显的牙乳头尖；当培养基中维甲酸的浓度为1×10-7 mol/L时，牙胚冠部仍形成明显的牙乳头尖；当培养基中维甲酸的浓度为1×10-6 mol/L时，牙胚冠部无牙乳头尖形成。结论 牙胚冠部形态发生与维甲酸剂量有密切关系，过量的维甲酸可抑制牙胚冠部牙乳头尖的形成。
The effect of retinoic acid on crown morphogenesis of mouse tooth germs in vitro
, 百拇医药
Gao Yuguang, Fan Mingwen, Bian Zhuan, et al. College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
【Abstract】 Objective To study the effects of retinoic acid on crown morphogenesis of early tooth germs.Methods Mouse tooth organ culture model was used and the functions of different retinoic acid concentration on the first mandibular molar germs of 14-day old mouse embryo were examined.Results The first mandibular molar germ of 14-day old mouse was at the bud stage. After 6 days culture, tooth germs in culture medium (not containing retinoic acid) developed from bud stage to bell stage and formed normal cusps. The morphogenesis of tooth germs in medium containing 1×10-7 mol/L retinoic acid was similar to molar germs in the medium without retinoic acid. When the concentration of retinoic acid increased to 1×10-6mol/L, the mouse tooth germs still developed from bud stage to bell stage, but normal cusps was not formed.Conclusion The results suggest that high concentration of retinoic acid alter crown morphogenesis of tooth germs.
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【Key words】 Tretinoin Organ culture Morphogenesis
牙齿发育畸形是临床上常见的牙体疾病，其发生与环境因素(如妊娠期母体患有某些疾病、某些化学药物的作用及营养成分的缺乏等)有密切关系。维甲酸是维生素A在体内代谢后具有多方面生物学活性的终产物，对胚胎发育、骨骼和上皮组织的生长分化以及视觉功能等许多方面都有重要作用。维甲酸的生物学作用又与维甲酸的剂量和作用时间有密切关系。我们通过小鼠磨牙牙胚的体外培养模型来探讨维甲酸对体外牙胚形态发生的影响。
材料与方法
1.标本来源：本实验所用小鼠为湖北医学科学院提供的昆明小鼠。小鼠交配后的胎龄计算以见到阴道栓时定为零天。将14天胎龄的昆明小鼠断颈处死，浸入75%酒精中消毒15 s。取鼠胎下颌并于体式显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚。方法如下：在含10%胎牛血清的Hanks液中用显微外科手术镊在鼠胎下颌骨磨牙区的近中端将颌骨固定，用探针将刚开始形成的颌骨骨板及软骨与其上方的口腔上皮和上皮下组织分开。在牙胚发育的蕾状期，口腔上皮与牙胚器官紧密相连，在确定下颌第一磨牙牙胚位置后，除与下颌第一磨牙牙胚成釉器相连的口腔上皮外，其周围组织包括远中端的牙板上皮应尽可能分离干净。
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2.培养方法：培养基为RPMI-1640半固态培养基，含青霉素5×104U/L，链霉素50 mg/L，维生素C 200mg/L，N-双哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES) 20mmol/L，胎牛血清(Gibco)20%，琼脂(Sigma)0.5%。培养基中维甲酸(全反式，Sigma)的浓度为1×10-7 mol/L和1×10-6 mol/L，以不含维甲酸的培养基作对照。将分离的14天胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于RPMI-1640半固体培养基表面，于37℃、含5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养6天，每48 h更换培养基1次。
3.标本制作：分别将14天和18天胎龄的鼠胎下颌及培养6天后的14天胎龄的鼠胎牙胚置于Bouin＇s固定液中固定8h，PBS洗涤30 min，再用含少量饱和碳酸锂溶液的70%酒精充分洗涤，直至牙胚的黄颜色全部褪去。常规脱水、石蜡包埋、制成5 μm厚的连续组织切片，H染色，镜下观察。
, 百拇医药
结果
1.14天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于蕾状期，牙板上皮开始向间充质深部增殖，邻近的外间充质细胞密度增加(图1)。
2.18天鼠胎的下颌第一磨牙牙胚处于钟状期，成釉器分为4层：内釉上皮、中间层、星网状层和外釉上皮。成釉器的颈环上皮向深部增殖包绕牙乳头并形成明显的牙乳头尖(图2)。
3.14天鼠胎牙胚培养6天后，在不含维甲酸的培养基中牙胚由蕾状期发育至钟状期，牙胚冠部形成明显的牙乳头尖(图3)，与18天鼠胎牙胚形态相似；当培养基中维甲酸浓度为1×10-7 mol/L时，培养6天后牙胚冠部仍有牙乳头尖形成(图4)；当培养基中维甲酸的浓度增至1×10-6 mol/L时，培养6天后牙胚仍由蕾状期发育至钟状期，但牙胚冠部无牙乳头尖形成(图5)。
讨论
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本组研究结果表明：不论培养基中是否含有维甲酸，14天胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚培养6天后均由蕾状期发育至钟状期，但过量的维甲酸可抑制牙胚冠部牙乳头尖的形成。
已往的实验结果显示，维生素A过量可导致胚胎发育障碍，尤其是颅面部发育障碍[1，2]。动物体内注入过量的维生素A可导致胚胎的颌面部发育障碍，如腭裂、小颌畸形等；在牙板开始发生之前，在动物体内注入过量的维生素A则可导致多生牙和融合牙。
牙胚培养是研究牙胚发育的一种良好方法，体外培养排除了体内复杂因素的干扰，可用于研究单一因素对牙胚发育的影响。Kronmiller等[3]利用体外培养手段发现体外过量的维生素A可引起切牙区额外牙蕾以及磨牙区牙蕾消失；在牙胚发育的钟状期，体外过量维甲酸可造成成牙本质细胞和成釉细胞分化障碍[4]。维甲酸及维生素A的这些生物学作用与其作用剂量、作用时间以及胚胎的发育阶段有关。
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关于维甲酸调控牙胚发育的分子机制尚不清楚。目前的研究表明，体内存在多种维甲酸受体并可将其分为两类：一类是细胞核受体，维甲酸可通过细胞核受体直接调节目的基因的表达；另一类是细胞浆结合蛋白受体，它可能参与了维甲酸的贮存和运输[5，6]。在牙胚发育过程中，基底膜可控制牙乳头外围细胞的增殖和分化，而牙乳头细胞的增殖和分化又决定了牙胚冠部形态的发生[7]。有研究表明，维甲酸的生物学作用与细胞外基质和生长因子关系密切，体外维甲酸除了能够促进胞外基质(如氨基聚糖、胶原和层粘连蛋白)的合成[8]，还能够诱导转化生长因子-β2和一种肝素结合生长因子(Midkine)的表达[9，10]。本研究表明了维甲酸能够改变牙胚冠部形态的发生，但维甲酸调控牙胚形态的发生与细胞外基质和生长因子的关系尚需进一步研究。
(本文图1～5见插页第23页)
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图1 14天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于蕾状期，牙板上皮向深部增殖，邻近间充质细胞密度增加。 dl:牙板上皮，m:牙间充质(H 20×2.5) 图2 18天鼠胎下颌第一磨牙牙胚发育处于钟状期，成釉器的颈环上皮向深部增殖包绕牙乳头并形成明显的牙乳头尖。ode:外釉上皮，s:星网状层，ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图3 培养6天后，在不含维甲酸的培养基中，牙胚由蕾状期发育至钟状期，牙胚冠部形态发育正常，有明显牙乳头尖出现(↑所示)。ide：内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图4 培养基中维甲酸浓度为1×10-7 mol/L时，培养6天后，牙胚冠部仍有明显的牙乳头尖形成(↑所示)。ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5) 图5当培养基中维甲酸增至1×10-6 mol/L时，培养6天后，牙胚仍由蕾状期发育至钟状期，但牙乳头尖消失。ide:内釉上皮，dp:牙乳头(H 20×2.5)
参考文献
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1 Lammer EJ, Chen OT, Hoar RM, et al. Retinoic acid embryopathy. New Engl J Med, 1985, 313:837-841.
2 Knudsen PA. Tooth germs in non-exencephalic siblings of mouse embroys with exencephaly induced by hyper-vitaminosis A. Acta Odontol Scand, 1967, 25:669-676.
3 Kronmiller JE, Upholt WB, Kollar EJ. Alteration of murine odontogenic patterning and prolongation of expression of epidermal growth factor mRNA by retinol in vitro. Arch Oral Biol, 1992, 37:129-138.
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4 Humerinta K, Thesleff I, Saxen L. In vitro inhibition of mouse odontoblast differentiation by vitamin A. Archs Oral Biol, 1980, 25:385-393.
5 Mark MP, Bloch-Zupan A, Wolf C, et al. Involvement of cellular retinoic acid-binding proteins I and II (CRABP I and CRABP II) and of the cellular retinol-binding protein I (CRBP I) in odontogenesis in the mouse. Differentiation, 1991, 48:89-98.
6 Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M, et al. Expression of nuclear retinoic acid receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994, 57:195-203.
, 百拇医药
7 Kollar EJ, Baird GR. Tissue interactions in embryonic mouse tooth germs. II. The inductive role of the dental papilla. J Embryol Exp Morphol, 1970, 24:173-186.
8 Bloch-Zupan A, Mark MP, Weber B, et al. In vitro effects of retinoic acid on mouse incisor development. Arch Oral Biol, 1994, 39:891-900.
9 Glick AB, Flanders KC, Danielpour D, et al. Retinoic acid induces transforming growth factor-beta 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Cell Regul, 1989, 1:87-97.
10 Mitsiadis TA, Muramatsu T, Muramatsu H, et al. Midkine (MK), a heparin-binding growth/differentiation factor, is regulated by retinoic acid and epithelia-mesenchymal interactions in the developing mouse tooth ,and affects cell proliferation and morphogenesis. J Cell Biol, 1995, 129:267-281.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-07-27), 百拇医药