年龄对牙周膜细胞钙化表达的影响
作者：刘宏伟 马良 欧龙 袁志萍 庞劲凡
单位：100853 北京，解放军总医院口腔科
关键词：牙周组织；年龄；再生；钙化
中华口腔医学杂志980603 【摘要】 目的 探讨不同年龄人的牙周膜(periodontal ligament, PDL)细胞参与牙周组织再生的能力和影响因素。方法 对青年人(4颗牙)和老年人(3颗牙)的正常牙周膜细胞进行细胞克隆化，观察碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对PDL细胞克隆体外钙化能力的影响。结果 青年组钙化细胞约占接种细胞数的17.7%，而老年组仅占4.1%。可见老年人PDL细胞的钙化能力明显低于青年人。当bFGF作用后，青年组所获钙化细胞克隆数较前增加26.3%；而老年组增加3.4%。结论 老年组PDL中前体细胞的数量和对bFGF的生物学应答均低于青年组。对老年人牙周组织再生治疗原则和研究方向应有别于青年人，应着重于增加老年人PDL中干细胞池的数量和激活前体细胞的生物学功能。
, http://www.100md.com
Effect of age on mineralization expression of periodontal ligament cell clones
Liu Hongwei, Ma Liang, Ou Long, et al. Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of age on the expression of mineralized tissue progenitors in the periodontium and the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF).Methods The periodontal ligament (PDL) tissues that derived from three old and 4 young donors were cultured and cells were cloned. The mineralizing ability were detected with or without bFGF treatment in the presence of dexamethasone. The cell cloning technic was employed in present study.Results The results indicated that the frequency of mineralized tissue progenitors (old donor: 4.1%) and the numbers of cell clones that mineralized with bFGF treated in the PDL cultures derived from old donors (3.4%) is considerably less than that of cultures obtained from young donors (17.7% and 16.9%). bFGF enhanced the mineralization of cell clone but not the parent population.Conclusion It is concluded that the poor stem cell and progenitors in PDL and the low reaction of progenitors to growth factors in PDL are responsible for the limited regenerative capacity of periodontium in old patient.
, 百拇医药
【Key words】 Periodontium Aging Regeneration Mineralization
牙周组织再生是一复杂的过程，取决于牙周膜(periodontal ligament, PDL)中参与组织再生的细胞，包括牙周干细胞和前体细胞。随着年龄的增长，牙周组织再生不能达到预期的效果，提示牙周组织再生能力的减弱。这种现象可能与老年人牙周膜中参与组织再生的细胞减少或功能的丧失有关。有实验表明，小鼠颅盖骨中的骨前体细胞数量受年龄的影响而变化[1]。这种变化是否也反应在牙周组织中，尚未见研究报道。本实验利用PDL细胞克隆技术，观察青老年PDL细胞中前体细胞的数量与分化能力，为今后进一步研究和临床治疗提供依据。
材料与方法
1.PDL细胞克隆化：青年组：共4例(4颗牙)，年龄20～25岁，本组重复实验3次(共4次)；老年组：共3例(3颗牙)，年龄50～62岁，重复实验2次(共3次)。两组标本均取自健康男性因正畸或义齿修复需要而拔除的正常牙，患者无系统性疾病。取其正常牙周膜组织进行原代培养，培养基为含15%小牛血清(FCS)的α-MEM(α-modified minimum essential medium)组织培养液，内含青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素-B(0.25μg/ml)。待细胞生长一定数量后，采用稀释法进行细胞克隆化。每颗牙的PDL细胞取10块96孔组织培养板进行克隆。标准条件下培养。每3天换液。当细胞生长覆盖孔底面积70%左右时，将细胞在24孔板中进行扩传，再行以下实验。
, 百拇医药
2.克隆细胞体外钙化能力的表达：取96孔组织培养板，每克隆6孔，细胞接种浓度为5×103/孔，24小时后用含15%FCS，β-磷酸甘油(10mmol/L)，实验用地塞米松(10-8mol/L)，抗坏血酸(50μg/ml)的α-MEM进行培养，其中3孔加入碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Sigma Chamical Co.,St.Louis,MO)3μg/L。另外3孔不加bFGF。每3天换液。第28天终止培养，饱和茜红素溶液染色，肉眼及相差显微镜观察。
结果
1.生长克隆的不同：每组细胞克隆接种总数为300个，青年组平均获生长克隆125.4±13.2个；老年组平均生长克隆46.6±9.5个。这些生长克隆是PDL中具有增殖或分化潜力的细胞，被认为是PDL中的前体细胞。可见老年人PDL中这类细胞明显低于青年人。证实老年人PDL中参与组织再生的细胞总数较低。
, 百拇医药
2.不同年龄组钙化细胞的不同和bFGF的作用：体外钙化实验结果显示，青年组平均获钙化克隆53.2±6.6个；老年组获钙化细胞克隆12.3±3.4个。即在整体PDL细胞中，青年组钙化细胞约占17.7%，而老年组仅占4.1%。可见老年人PDL细胞的钙化能力明显低于青年人。
青年组细胞克隆体外钙化平均占生长克隆的42.4%；当bFGF作用后，所获钙化细胞克隆数较前平均增加了21.2±4.4个，占生长克隆的16.9%(图1)。老年组细胞克隆体外钙化占生长细胞克隆的26.3%；当bFGF作用后，钙化细胞克隆平均增加了1.6个，占生长细胞克隆的3.4%(图2)。
讨论
本组实验结果表明，年龄因素之所以造成老年人牙周组织再生能力降低，其直接原因是由于老年人PDL中参与组织再生的细胞数量和分化能力降低，具有钙化能力的细胞减少。
, 百拇医药
图1 碱基成纤维细胞生长因子(bFGF)对
青年组牙周膜细胞克隆体外钙化表达的影响
图2 碱基成纤维细胞生长因子(bFGF)对
老年组牙周膜细胞克隆体外钙化表达的影响
老年PDL细胞克隆对bFGF的反应较低，从本实验结果看存在着两种因素：①老年组PDL体外生长细胞克隆的减少，提示前体细胞数量上的减少，造成bFGF或其它生长因子的靶细胞数量降低；②老年组生长细胞克隆在bFGF作用后，细胞钙化增长率远低于青年组，提示老年PDL细胞中的前体细胞信息分子传递能力减弱、改变或消失。由此可见，年龄的增长可造成牙周干细胞池(the pool of stem cells)的减少，直接导致前体细胞数量的降低；同时也可造成牙周组织中生长因子表达能力和生物学信号的逐渐减弱或丢失(包括bFGF的表达)，导致细胞分化和增殖能力减弱是影响牙周组织再生的主要原因[2]。
, 百拇医药
已有资料表明，多种生长因子具有维持骨的自身稳定和促进骨再生的作用，bFGF就是其中的一种。有研究报道，bFGF在体外可促进骨髓细胞钙化样组织的形成[3～5]。
本实验结果显示，bFGF在体外可以明显促进青年人PDL细胞克隆的钙化表达，包括2种可能：①使原有钙化能力的细胞其钙化程度得以加强；②使未表现出钙化的细胞具有了钙化样组织表达的能力。
根据本实验结果，我们认为，老年人牙周组织再生的研究方向和治疗原则应有别于青年人。如何增加老年人PDL干细胞的数量，激活前体细胞对相应生物因子的生物学应答，是促进老年人牙周组织再生的关键。
国家自然科学基金(39770798)和国家教委留学回国人员科研启动基金(1997 436)资助课题
参考文献
, http://www.100md.com
1 Liang CT, Barnes J, Sedor JG, et al. Impaired bone activity in old rats: alterations at the cellular and molecular levels. Bone, 1992, 13:435-441.
2 Gao J, Jordan TW, Cutress TW. Immunolocalization of basic fibroblast growth factor (bFGF) in human periodontal ligament (PDL) tissue. J Periodont Res, 1996, 31:260-264.
3 Canalis E, McCarthy T, Centrella M. Growth factors and the regulation of bone remodeling. J Clin Invest, 1988, 81:277-281.
, http://www.100md.com
4 Hauschka PV, Mavrakos AE, Iafrati MD, et al. Growth factors in bone matrix: isolation of multiple types by affinity chromatography on beparin sipharose. J Biol Chem, 1986, 261:12665-12674.
5 Pitaru S, Kotev-Emeth S, Noff D, et al. Basic fibroblast growth factor stimulates mineralized bone-like tissue formation in vitro by enchancing the proliferation, differentiation and protein synthezis of stromal bone marrow cells. J Bone Miner Res, 1993, 8:919-929.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-07-29), 百拇医药
单位：100853 北京，解放军总医院口腔科
关键词：牙周组织；年龄；再生；钙化
中华口腔医学杂志980603 【摘要】 目的 探讨不同年龄人的牙周膜(periodontal ligament, PDL)细胞参与牙周组织再生的能力和影响因素。方法 对青年人(4颗牙)和老年人(3颗牙)的正常牙周膜细胞进行细胞克隆化，观察碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)对PDL细胞克隆体外钙化能力的影响。结果 青年组钙化细胞约占接种细胞数的17.7%，而老年组仅占4.1%。可见老年人PDL细胞的钙化能力明显低于青年人。当bFGF作用后，青年组所获钙化细胞克隆数较前增加26.3%；而老年组增加3.4%。结论 老年组PDL中前体细胞的数量和对bFGF的生物学应答均低于青年组。对老年人牙周组织再生治疗原则和研究方向应有别于青年人，应着重于增加老年人PDL中干细胞池的数量和激活前体细胞的生物学功能。
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Effect of age on mineralization expression of periodontal ligament cell clones
Liu Hongwei, Ma Liang, Ou Long, et al. Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of age on the expression of mineralized tissue progenitors in the periodontium and the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF).Methods The periodontal ligament (PDL) tissues that derived from three old and 4 young donors were cultured and cells were cloned. The mineralizing ability were detected with or without bFGF treatment in the presence of dexamethasone. The cell cloning technic was employed in present study.Results The results indicated that the frequency of mineralized tissue progenitors (old donor: 4.1%) and the numbers of cell clones that mineralized with bFGF treated in the PDL cultures derived from old donors (3.4%) is considerably less than that of cultures obtained from young donors (17.7% and 16.9%). bFGF enhanced the mineralization of cell clone but not the parent population.Conclusion It is concluded that the poor stem cell and progenitors in PDL and the low reaction of progenitors to growth factors in PDL are responsible for the limited regenerative capacity of periodontium in old patient.
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【Key words】 Periodontium Aging Regeneration Mineralization
牙周组织再生是一复杂的过程，取决于牙周膜(periodontal ligament, PDL)中参与组织再生的细胞，包括牙周干细胞和前体细胞。随着年龄的增长，牙周组织再生不能达到预期的效果，提示牙周组织再生能力的减弱。这种现象可能与老年人牙周膜中参与组织再生的细胞减少或功能的丧失有关。有实验表明，小鼠颅盖骨中的骨前体细胞数量受年龄的影响而变化[1]。这种变化是否也反应在牙周组织中，尚未见研究报道。本实验利用PDL细胞克隆技术，观察青老年PDL细胞中前体细胞的数量与分化能力，为今后进一步研究和临床治疗提供依据。
材料与方法
1.PDL细胞克隆化：青年组：共4例(4颗牙)，年龄20～25岁，本组重复实验3次(共4次)；老年组：共3例(3颗牙)，年龄50～62岁，重复实验2次(共3次)。两组标本均取自健康男性因正畸或义齿修复需要而拔除的正常牙，患者无系统性疾病。取其正常牙周膜组织进行原代培养，培养基为含15%小牛血清(FCS)的α-MEM(α-modified minimum essential medium)组织培养液，内含青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素-B(0.25μg/ml)。待细胞生长一定数量后，采用稀释法进行细胞克隆化。每颗牙的PDL细胞取10块96孔组织培养板进行克隆。标准条件下培养。每3天换液。当细胞生长覆盖孔底面积70%左右时，将细胞在24孔板中进行扩传，再行以下实验。
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2.克隆细胞体外钙化能力的表达：取96孔组织培养板，每克隆6孔，细胞接种浓度为5×103/孔，24小时后用含15%FCS，β-磷酸甘油(10mmol/L)，实验用地塞米松(10-8mol/L)，抗坏血酸(50μg/ml)的α-MEM进行培养，其中3孔加入碱基成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Sigma Chamical Co.,St.Louis,MO)3μg/L。另外3孔不加bFGF。每3天换液。第28天终止培养，饱和茜红素溶液染色，肉眼及相差显微镜观察。
结果
1.生长克隆的不同：每组细胞克隆接种总数为300个，青年组平均获生长克隆125.4±13.2个；老年组平均生长克隆46.6±9.5个。这些生长克隆是PDL中具有增殖或分化潜力的细胞，被认为是PDL中的前体细胞。可见老年人PDL中这类细胞明显低于青年人。证实老年人PDL中参与组织再生的细胞总数较低。
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2.不同年龄组钙化细胞的不同和bFGF的作用：体外钙化实验结果显示，青年组平均获钙化克隆53.2±6.6个；老年组获钙化细胞克隆12.3±3.4个。即在整体PDL细胞中，青年组钙化细胞约占17.7%，而老年组仅占4.1%。可见老年人PDL细胞的钙化能力明显低于青年人。
青年组细胞克隆体外钙化平均占生长克隆的42.4%；当bFGF作用后，所获钙化细胞克隆数较前平均增加了21.2±4.4个，占生长克隆的16.9%(图1)。老年组细胞克隆体外钙化占生长细胞克隆的26.3%；当bFGF作用后，钙化细胞克隆平均增加了1.6个，占生长细胞克隆的3.4%(图2)。
讨论
本组实验结果表明，年龄因素之所以造成老年人牙周组织再生能力降低，其直接原因是由于老年人PDL中参与组织再生的细胞数量和分化能力降低，具有钙化能力的细胞减少。
, 百拇医药
图1 碱基成纤维细胞生长因子(bFGF)对
青年组牙周膜细胞克隆体外钙化表达的影响
图2 碱基成纤维细胞生长因子(bFGF)对
老年组牙周膜细胞克隆体外钙化表达的影响
老年PDL细胞克隆对bFGF的反应较低，从本实验结果看存在着两种因素：①老年组PDL体外生长细胞克隆的减少，提示前体细胞数量上的减少，造成bFGF或其它生长因子的靶细胞数量降低；②老年组生长细胞克隆在bFGF作用后，细胞钙化增长率远低于青年组，提示老年PDL细胞中的前体细胞信息分子传递能力减弱、改变或消失。由此可见，年龄的增长可造成牙周干细胞池(the pool of stem cells)的减少，直接导致前体细胞数量的降低；同时也可造成牙周组织中生长因子表达能力和生物学信号的逐渐减弱或丢失(包括bFGF的表达)，导致细胞分化和增殖能力减弱是影响牙周组织再生的主要原因[2]。
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已有资料表明，多种生长因子具有维持骨的自身稳定和促进骨再生的作用，bFGF就是其中的一种。有研究报道，bFGF在体外可促进骨髓细胞钙化样组织的形成[3～5]。
本实验结果显示，bFGF在体外可以明显促进青年人PDL细胞克隆的钙化表达，包括2种可能：①使原有钙化能力的细胞其钙化程度得以加强；②使未表现出钙化的细胞具有了钙化样组织表达的能力。
根据本实验结果，我们认为，老年人牙周组织再生的研究方向和治疗原则应有别于青年人。如何增加老年人PDL干细胞的数量，激活前体细胞对相应生物因子的生物学应答，是促进老年人牙周组织再生的关键。
国家自然科学基金(39770798)和国家教委留学回国人员科研启动基金(1997 436)资助课题
参考文献
, http://www.100md.com
1 Liang CT, Barnes J, Sedor JG, et al. Impaired bone activity in old rats: alterations at the cellular and molecular levels. Bone, 1992, 13:435-441.
2 Gao J, Jordan TW, Cutress TW. Immunolocalization of basic fibroblast growth factor (bFGF) in human periodontal ligament (PDL) tissue. J Periodont Res, 1996, 31:260-264.
3 Canalis E, McCarthy T, Centrella M. Growth factors and the regulation of bone remodeling. J Clin Invest, 1988, 81:277-281.
, http://www.100md.com
4 Hauschka PV, Mavrakos AE, Iafrati MD, et al. Growth factors in bone matrix: isolation of multiple types by affinity chromatography on beparin sipharose. J Biol Chem, 1986, 261:12665-12674.
5 Pitaru S, Kotev-Emeth S, Noff D, et al. Basic fibroblast growth factor stimulates mineralized bone-like tissue formation in vitro by enchancing the proliferation, differentiation and protein synthezis of stromal bone marrow cells. J Bone Miner Res, 1993, 8:919-929.
(收稿：1998-03-05 修回：1998-07-29), 百拇医药