体外生物人工肝对无肝模型犬的支持效果
作者：王英杰 王宇明 聂青和 李梦东 陈国致
单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院
关键词：
中华外科杂志/980725 我们用悬浮高密度大量培养的肝细胞与中空纤维生物反应器及由血液透析仪改装的辅助循环装置共同构成一种体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，对无肝模型犬进行人工肝支持实验，以期推动我国生物人工肝的研究，为肝衰竭的治疗开辟新的途径。
一、材料与方法
1.EBLSS的构建：选择人肝细胞为生物材料，简易体外两步灌流法分离肝细胞，差速离心获取肝细胞和肝非实质细胞，综合限制贴壁技术进行混合球形聚集培养[1]。使用中空纤维管为生物反应器，以驱动和维持体外血液循环为目的，改血液透析仪为辅助循环装置。
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2.动物模型的制备：实验动物为犬，由本校实验动物中心提供，体重11～14 kg。戊巴比妥纳(30 mg/kg)静脉麻醉后，常规方法消毒、开腹、分离血管，行门静脉-下腔静脉侧侧吻合术。吻合成功后，结扎吻合上方门静脉和肝动脉。
3.实验方法与观察指标：实验犬随机分为2组(各5只)进行人工肝支持与空白循环对照实验，支持组所用细胞数约108个，对照组反应器内不加肝细胞。2组动物经股动、静脉插管连接EBLSS，30～50 ml/min循环血液，肝素抗凝。实验中观察犬生命征变化、存活时间，检测血氨、乳酸浓度和肝细胞活力。
二、结果
1.实验犬生命征变化及存活时间:实验初2组动物心率、血压、ECG及氧饱合度(SPO2)较前无显著变化。对照组在入肝血断流3小时左右心率呈减慢趋势，同时伴随血压降低，ECG有程度不等的ST段改变。在犬死亡前1～1.5小时内，上述变化加剧，并出现呼吸节律改变和SPO2下降。支持组上述监护指标改变于入肝血阻断的6～9小时，其血压、心率及SPO2的下降速度较缓慢、出现显著变化的时间与对照组大至相同。
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对照组犬的存活时间为5.2～6.5小时，平均5.8±0.5小时。EBLSS支持犬的最短存活时间为9.5小时，最长达12.2小时，平均10.7±1.1小时，两组相比差异有极显著性意义(P<0.01)。
2.实验犬血氨、乳酸浓度变化：随时间对照组血氨升高明显，而EBLSS支持组血氨升高速度相对较慢，两组在入肝血阻断3小时和5小时存在显著差异(P<0.01)。动态观察犬血乳酸变化显示，对照组血乳酸升高亦较支持组明显，其中在3小时和5小时两组差异有极显著性意义(P<0.01)。
3.EBLSS运行与肝细胞功能观察：EBLSS运行过程中，6例于循环1～2小时出现管道压力异常增高，表现为血流不畅和接头漏血，首例经股动脉推注生理盐水，以后5例经立即更换备用股静脉通道后恢复正常。除此以外，EBLSS各部分运行无故障。
支持组所用球形体肝细胞-肝非实质细胞在置反应器进行5小时人工肝支持实验后，细胞活力仍保持在52.3%～70.8%。置被覆胶原的培养板，约24小时常规条件1640培养液培养，重新贴壁率在50%左右。
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三、讨论
近年来，建立新型生物人工肝系统，并对暴发性肝衰竭(FHF)进行有效的人工肝支持是人工肝研究领域的重要课题[2]。本研究首先用体外两步灌流法分离出大量高质量的人肝细胞和肝非实质细胞，然后采用综合限制细胞贴壁技术进行高活性混合球形聚集培养，进一步将其置于由多孔质空心纤维组成的生物反应器，在辅助循环装置的配合下，对无肝犬进行EBLSS的人工肝支持研究。结果显示，在平均仅使用108个肝细胞-肝非实质细胞的EBLSS支持下，实验犬的生命征变化迟缓，存活时间几乎是无细胞空白循环对照组犬的1倍，血氨、乳酸的升高幅度明显低于对照组。该结果明显优于Kelly等[3]用C3A细胞株对无肝(肝切除)模型犬所进行的人工肝支持研究，推测除选用正常肝细胞外。本研究所用混合肝细胞球形聚集培养系统较好地维持了正常肝细胞的立体排列结构，保持良好的生物功能。而中空纤维型生物反应器的使用则有助于血液与培养肝细胞进行有效的物质交换，发挥生物人工肝的生物合成与解毒代谢功能。
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虽然因所用犬模型的局限性，以及培养肝细胞尚未达到尽可能最大数量，本研究无法使人工肝支持犬长期存活，但上述结果已表明以球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞为材料、空心纤维管为生物反应器以及改装血液透析仪为辅助循环装置的EBLSS基本解决了生物人工肝的关键技术，尤其因肝细胞的培养及在反应器的存活与正常体内存在方式较相似，使之更好地具备生物人工肝的基本功能，从而能够部分代偿FHF犬的肝脏功能。
参考文献
1王英杰，李梦东，王宇明，等.大鼠肝细胞的简易分离与聚集培养.中华肝脏病杂志，1996,4:167-168.
2Gerlach J,Ziemer R,Neuhaus P.Fulminant liver failure:relevance of extracorporeal hybrid liver support systems.Int J Artif Organs,1996,19:7-13.
3Kelly JH,Koussayer T,He D,et al.Assessment of an extracorporeal liver assist device in an hepatic dogs.Artif Organs,1992,16:418-422.
本课题受国家“九五”攻关基金资助, http://www.100md.com
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关键词：
中华外科杂志/980725 我们用悬浮高密度大量培养的肝细胞与中空纤维生物反应器及由血液透析仪改装的辅助循环装置共同构成一种体外生物人工肝支持系统(EBLSS)，对无肝模型犬进行人工肝支持实验，以期推动我国生物人工肝的研究，为肝衰竭的治疗开辟新的途径。
一、材料与方法
1.EBLSS的构建：选择人肝细胞为生物材料，简易体外两步灌流法分离肝细胞，差速离心获取肝细胞和肝非实质细胞，综合限制贴壁技术进行混合球形聚集培养[1]。使用中空纤维管为生物反应器，以驱动和维持体外血液循环为目的，改血液透析仪为辅助循环装置。
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2.动物模型的制备：实验动物为犬，由本校实验动物中心提供，体重11～14 kg。戊巴比妥纳(30 mg/kg)静脉麻醉后，常规方法消毒、开腹、分离血管，行门静脉-下腔静脉侧侧吻合术。吻合成功后，结扎吻合上方门静脉和肝动脉。
3.实验方法与观察指标：实验犬随机分为2组(各5只)进行人工肝支持与空白循环对照实验，支持组所用细胞数约108个，对照组反应器内不加肝细胞。2组动物经股动、静脉插管连接EBLSS，30～50 ml/min循环血液，肝素抗凝。实验中观察犬生命征变化、存活时间，检测血氨、乳酸浓度和肝细胞活力。
二、结果
1.实验犬生命征变化及存活时间:实验初2组动物心率、血压、ECG及氧饱合度(SPO2)较前无显著变化。对照组在入肝血断流3小时左右心率呈减慢趋势，同时伴随血压降低，ECG有程度不等的ST段改变。在犬死亡前1～1.5小时内，上述变化加剧，并出现呼吸节律改变和SPO2下降。支持组上述监护指标改变于入肝血阻断的6～9小时，其血压、心率及SPO2的下降速度较缓慢、出现显著变化的时间与对照组大至相同。
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对照组犬的存活时间为5.2～6.5小时，平均5.8±0.5小时。EBLSS支持犬的最短存活时间为9.5小时，最长达12.2小时，平均10.7±1.1小时，两组相比差异有极显著性意义(P<0.01)。
2.实验犬血氨、乳酸浓度变化：随时间对照组血氨升高明显，而EBLSS支持组血氨升高速度相对较慢，两组在入肝血阻断3小时和5小时存在显著差异(P<0.01)。动态观察犬血乳酸变化显示，对照组血乳酸升高亦较支持组明显，其中在3小时和5小时两组差异有极显著性意义(P<0.01)。
3.EBLSS运行与肝细胞功能观察：EBLSS运行过程中，6例于循环1～2小时出现管道压力异常增高，表现为血流不畅和接头漏血，首例经股动脉推注生理盐水，以后5例经立即更换备用股静脉通道后恢复正常。除此以外，EBLSS各部分运行无故障。
支持组所用球形体肝细胞-肝非实质细胞在置反应器进行5小时人工肝支持实验后，细胞活力仍保持在52.3%～70.8%。置被覆胶原的培养板，约24小时常规条件1640培养液培养，重新贴壁率在50%左右。
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三、讨论
近年来，建立新型生物人工肝系统，并对暴发性肝衰竭(FHF)进行有效的人工肝支持是人工肝研究领域的重要课题[2]。本研究首先用体外两步灌流法分离出大量高质量的人肝细胞和肝非实质细胞，然后采用综合限制细胞贴壁技术进行高活性混合球形聚集培养，进一步将其置于由多孔质空心纤维组成的生物反应器，在辅助循环装置的配合下，对无肝犬进行EBLSS的人工肝支持研究。结果显示，在平均仅使用108个肝细胞-肝非实质细胞的EBLSS支持下，实验犬的生命征变化迟缓，存活时间几乎是无细胞空白循环对照组犬的1倍，血氨、乳酸的升高幅度明显低于对照组。该结果明显优于Kelly等[3]用C3A细胞株对无肝(肝切除)模型犬所进行的人工肝支持研究，推测除选用正常肝细胞外。本研究所用混合肝细胞球形聚集培养系统较好地维持了正常肝细胞的立体排列结构，保持良好的生物功能。而中空纤维型生物反应器的使用则有助于血液与培养肝细胞进行有效的物质交换，发挥生物人工肝的生物合成与解毒代谢功能。
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虽然因所用犬模型的局限性，以及培养肝细胞尚未达到尽可能最大数量，本研究无法使人工肝支持犬长期存活，但上述结果已表明以球形聚集培养的人肝细胞-肝非实质细胞为材料、空心纤维管为生物反应器以及改装血液透析仪为辅助循环装置的EBLSS基本解决了生物人工肝的关键技术，尤其因肝细胞的培养及在反应器的存活与正常体内存在方式较相似，使之更好地具备生物人工肝的基本功能，从而能够部分代偿FHF犬的肝脏功能。
参考文献
1王英杰，李梦东，王宇明，等.大鼠肝细胞的简易分离与聚集培养.中华肝脏病杂志，1996,4:167-168.
2Gerlach J,Ziemer R,Neuhaus P.Fulminant liver failure:relevance of extracorporeal hybrid liver support systems.Int J Artif Organs,1996,19:7-13.
3Kelly JH,Koussayer T,He D,et al.Assessment of an extracorporeal liver assist device in an hepatic dogs.Artif Organs,1992,16:418-422.
本课题受国家“九五”攻关基金资助, http://www.100md.com