胆囊结石患者结石需氧菌和厌氧菌分子生物学研究及意义
作者：方驰华 杨继震
单位：第一军医大学珠江医院普外科 广东省广州市 510282
关键词：胆囊结石/外科学；结石；细菌，脱氧核糖核酸；聚合酶链式反应
中国图书资料分类号 R657中国图书资料分类号 R657.4
0 引言
胆囊结石成因及发病机制仍不十分清楚. 为了探讨细菌在胆囊结石核心形成作用和证据，本研究采用聚合酶链式反应(PCR)从分子生物学水平对胆囊结石5种需氧菌和4种厌氧菌脱氧核糖核酸(DNA)进行研究.
1 方法
70例单纯胆囊结石，胆囊切除后，在无菌条件下取出结石，生理盐水冲洗，然后用生理盐水和酒精浸泡30min，切开结石，取中心部位结石检测. 9种细菌引物(表1，2)阳标对照来自解放军基因研究所. PCR检测采用DTC-3C型PCR-DNA扩增仪. 将结石捣碎后加处理液100μl，经水浴锅煮沸、离心，取上清液加入引物中，放入扩增仪进行循环，取扩增好引物点样，琼脂糖、TAE电泳，并与阳标对照.
, 百拇医药
2 结果
检测胆囊结石70例，细菌DNA总的存在60例. 需氧菌DNA 43例，其中单菌DNA 31例，双菌DNA 10例，多菌DNA 2例. 厌氧菌DNA 17例，其中单菌DNA 10例，双菌DNA 4例. 多菌DNA 3例. 此外，需氧菌和厌氧菌DNA共同存在11例，其中双菌DNA 5例，3菌DNA 3例，4菌DNA 2例，5菌DNA 1例. 9种细菌DNA检测出次数依次为大肠埃氏杆菌17次、幽门螺杆菌15次、伤寒杆菌13次、梭形芽孢杆菌10次、消化球菌9次、克雷伯氏杆菌8次、产气荚膜杆菌5次、变形杆菌4次、脆弱类杆菌3次.
表1 5种需氧细菌引物、扩增片段长度情况
细菌
引物
编号
, http://www.100md.com
引物序列
扩增片段
长度(bp)
大肠埃氏杆菌
P1
5＇ TCTCTATGTGCATACGGAG 3＇
P2
5＇ CCATACTGATTGCCGCAA 3＇
伤寒杆菌
P3
5＇ ACTGCTAAAACCACTACT 3＇
P4
, http://www.100md.com
5＇ TTAACGCAGTAAAGAGAG 3＇
幽门螺杆菌
P5
5＇ GCCAATGGTAAATTAGTT 3＇
P6
5＇ CTCCTTAATTGTTTTTAC 3＇
变形杆菌
P7
5＇ CTGGTAGGTATGGTGAGG 3＇
P8
5＇ CCAGGCCAACAATTATTTCC 3＇
, 百拇医药
克雷伯氏杆菌
P9
5＇ GCTGATCTTGACTATGTGGTG
P10
5＇ GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG
320
458
411
320
288
表2 4种厌氧菌引物情况
细菌
, 百拇医药
引物
编号
引物序列
脆弱类杆菌
P1
5＇ GAAGCTTATGGTACAGGTTGG 3＇
P2
5＇ ATTACCATCCTCCTTGTTGTAAGG 3＇
消化球菌
P3
5＇ TTAGCAGGTAATGGCTAGAG 3＇
, http://www.100md.com P4
5＇ CTCGGTTAACCTCAATTATG 3＇
梭形芽孢杆菌
P5
5＇ AAACTCAAATGAATTGACGG 3＇
P6
5＇ GACGGGCGGTGTGTACAA 3＇
产气荚膜杆菌
P7
5＇ GCTCTTGCAACTTCTATGTT 3＇
P8
, 百拇医药
5＇ CATTGTCGTCAGGTTGGCG 3＇
3 讨论
胆囊结石形成是一个较长的过程，在结石形成过程中包埋起来的细菌可能早已死亡崩解，因此，对术中取出胆囊结石进行细菌培养，常常得不到细菌存在证据. 本研究采用PCR技术对胆囊结石细菌进行体外扩增，总的细菌DNA存在率为85.71%，其中厌氧菌24.29%，需氧菌DNA 61.43%. 首次从15例结石中检测出幽门螺杆菌DNA，而在门脉血中未测出该菌DNA，证明该菌来自十二指肠乳头逆流. 研究表明，PCR为研究胆囊结石细菌DNA，重新认识和研究细菌在结石核心形成作用提供了分子生物学证据，同时对胆道感染细菌检测、细菌来源有重要意义.
通讯作者 方驰华
收稿日期 1998-06-10, 百拇医药
单位：第一军医大学珠江医院普外科 广东省广州市 510282
关键词：胆囊结石/外科学；结石；细菌，脱氧核糖核酸；聚合酶链式反应
中国图书资料分类号 R657中国图书资料分类号 R657.4
0 引言
胆囊结石成因及发病机制仍不十分清楚. 为了探讨细菌在胆囊结石核心形成作用和证据，本研究采用聚合酶链式反应(PCR)从分子生物学水平对胆囊结石5种需氧菌和4种厌氧菌脱氧核糖核酸(DNA)进行研究.
1 方法
70例单纯胆囊结石，胆囊切除后，在无菌条件下取出结石，生理盐水冲洗，然后用生理盐水和酒精浸泡30min，切开结石，取中心部位结石检测. 9种细菌引物(表1，2)阳标对照来自解放军基因研究所. PCR检测采用DTC-3C型PCR-DNA扩增仪. 将结石捣碎后加处理液100μl，经水浴锅煮沸、离心，取上清液加入引物中，放入扩增仪进行循环，取扩增好引物点样，琼脂糖、TAE电泳，并与阳标对照.
, 百拇医药
2 结果
检测胆囊结石70例，细菌DNA总的存在60例. 需氧菌DNA 43例，其中单菌DNA 31例，双菌DNA 10例，多菌DNA 2例. 厌氧菌DNA 17例，其中单菌DNA 10例，双菌DNA 4例. 多菌DNA 3例. 此外，需氧菌和厌氧菌DNA共同存在11例，其中双菌DNA 5例，3菌DNA 3例，4菌DNA 2例，5菌DNA 1例. 9种细菌DNA检测出次数依次为大肠埃氏杆菌17次、幽门螺杆菌15次、伤寒杆菌13次、梭形芽孢杆菌10次、消化球菌9次、克雷伯氏杆菌8次、产气荚膜杆菌5次、变形杆菌4次、脆弱类杆菌3次.
表1 5种需氧细菌引物、扩增片段长度情况
细菌
引物
编号
, http://www.100md.com
引物序列
扩增片段
长度(bp)
大肠埃氏杆菌
P1
5＇ TCTCTATGTGCATACGGAG 3＇
P2
5＇ CCATACTGATTGCCGCAA 3＇
伤寒杆菌
P3
5＇ ACTGCTAAAACCACTACT 3＇
P4
, http://www.100md.com
5＇ TTAACGCAGTAAAGAGAG 3＇
幽门螺杆菌
P5
5＇ GCCAATGGTAAATTAGTT 3＇
P6
5＇ CTCCTTAATTGTTTTTAC 3＇
变形杆菌
P7
5＇ CTGGTAGGTATGGTGAGG 3＇
P8
5＇ CCAGGCCAACAATTATTTCC 3＇
, 百拇医药
克雷伯氏杆菌
P9
5＇ GCTGATCTTGACTATGTGGTG
P10
5＇ GGCTCAGGATCTGTCCTTCGG
320
458
411
320
288
表2 4种厌氧菌引物情况
细菌
, 百拇医药
引物
编号
引物序列
脆弱类杆菌
P1
5＇ GAAGCTTATGGTACAGGTTGG 3＇
P2
5＇ ATTACCATCCTCCTTGTTGTAAGG 3＇
消化球菌
P3
5＇ TTAGCAGGTAATGGCTAGAG 3＇
, http://www.100md.com P4
5＇ CTCGGTTAACCTCAATTATG 3＇
梭形芽孢杆菌
P5
5＇ AAACTCAAATGAATTGACGG 3＇
P6
5＇ GACGGGCGGTGTGTACAA 3＇
产气荚膜杆菌
P7
5＇ GCTCTTGCAACTTCTATGTT 3＇
P8
, 百拇医药
5＇ CATTGTCGTCAGGTTGGCG 3＇
3 讨论
胆囊结石形成是一个较长的过程，在结石形成过程中包埋起来的细菌可能早已死亡崩解，因此，对术中取出胆囊结石进行细菌培养，常常得不到细菌存在证据. 本研究采用PCR技术对胆囊结石细菌进行体外扩增，总的细菌DNA存在率为85.71%，其中厌氧菌24.29%，需氧菌DNA 61.43%. 首次从15例结石中检测出幽门螺杆菌DNA，而在门脉血中未测出该菌DNA，证明该菌来自十二指肠乳头逆流. 研究表明，PCR为研究胆囊结石细菌DNA，重新认识和研究细菌在结石核心形成作用提供了分子生物学证据，同时对胆道感染细菌检测、细菌来源有重要意义.
通讯作者 方驰华
收稿日期 1998-06-10, 百拇医药