膀胱移行上皮癌细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达研究
作者：陈凌武 王晓波 梅骅 陈炜
单位：510080 广州，中山医科大学附属孙逸仙医院泌尿外科
关键词：膀胱肿瘤；增殖细胞核抗原；凋亡
中华外科杂志/980813 【摘要】 目的 研究表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡及增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况,并初步探讨其与表浅膀胱移行细胞癌复发的关系。 方法 采用原位DNA末端标记法及免疫组织化学方法检测了87例表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡及PCNA表达情况，计算出细胞凋亡指数及PCNA表达指数，并对复发组与非复发组进行比较。 结果 复发组与非复发组细胞凋亡指数差异无显著意义,而凋亡指数与PCNA指数比值在复发组小于非复发组 (P<0.01)，显示在复发组癌细胞的增殖程度明显高于细胞凋亡程度。 结论 对凋亡指数及PCNA阳性指数的综合分析,即凋亡指数与PCNA阳性指数的比值,可更全面的反映细胞凋亡与增殖的平衡状态,对判断肿瘤的复发具有参考价值。
, 百拇医药
Apoptosis and expression of PCNA in superficial transitional cell bladder cancer as related to recurrence Chen Lingwu, Wang Xiaobo,Mei Hua,et al.Department of Urology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080.
【Abstract】 Objective To determine the expression of apoptosis and PCNA in superficial transitional cell bladder cancer and to evaluate its significance as a recurrence marker. Method 87 cases of superficial transitional cell bladder cancer were analysed for the expression of apoptosis and PCNA by using the 3-end labeling method of DNA and immunohistochemical staining in tissue sections. The apoptotic indexes and PCNA indexes were respectively the percentages of apoptotic cells or PCNA positive cells among tumor cells. Result The end labeling method allowed a precise evaluation of the expression of apoptosis. Apoptosis occurred in 89.6% of superficial transitional cell bladder cancer. In 17 patients who suffered from tumor recurrence,the ratio of apoptosis indexes to PCNA indexes was significantly higher than that in those without recurrence (P<0.01). Conclusion The ratio of apoptosis indexes to PCNA indexes was believed to be related to tumor recurrence and might be of value in the assessment of recurrence of superficial transitional cell bladder cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Bladder neoplasms Proliferating cell nuclear antigen Apoptosis
细胞的增殖与凋亡是反映细胞生长状态的两个方面,我们曾研究了表浅膀胱移行细胞癌中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达情况[1]。为进一步探讨表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡现象及其临床意义,我们用常规石蜡切片,进行原位的DNA断裂位点末端标记,计算凋亡指数,通过与PCNA表达的对比研究,以求更全面的了解肿瘤细胞的生长状态并探讨其与肿瘤复发的关系。
资料与方法
一、标本及临床资料
自1983年7月至1994年5月治疗表浅膀胱癌87例。患者年龄21～84岁,平均55.7岁。标本经膀胱镜钳取或开放手术得到,均经病理证实为表浅膀胱移行细胞癌,常规福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚切片备染。经随访观察15～121个月,治疗后临床及病理证实为癌肿复发者17例,复发多于术后半年至 2年内发生(非复发者随诊均在3年以上,平均63.6个月)。复发组中男性10例,女性7例，平均年龄52.7岁。肿瘤单发者8例,多发者9例。肿瘤直径大于0.5 cm者8例。开放手术者5例。肿瘤复发与年龄、性别、肿瘤大小、数目、手术方式无明显相关性(P>0.05)。因病例数较少,复发与肿瘤病理分期的相关性未进行统计学分析。
, 百拇医药
二、细胞凋亡的检测
采用美国Oncor公司原位凋亡检测试剂盒(Apop Taq Plus)。
1.原位DNA断裂位点的3'-基末端标记:切片于二甲苯中脱蜡,无水乙醇、95%和70%乙醇水化;以浓度为20 μg/ml蛋白酶K消化30分钟;3%H2O2，封闭内源性过氧化物酶30分钟；配制含末端核苷酸转移酶和地高辛连接的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)的反应混合液,滴加后37℃孵育1小时,磷酸缓冲液(PBS) 洗3次,再滴加连接有过氧化物酶的抗地高辛抗体,室温孵育30分钟;滴加入3,3二氨基联苯胺(DAB),见到棕黄色的阳性细胞后终止反应,甲基绿复染,树脂封片。
2.细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)的计算:每张切片选择5个阳性染色最明显的高倍视野(×400),计数500个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。
, 百拇医药
三、PCNA表达的免疫组化检测
PCNA的表达阳性指数的计算方法与参考文献[1]相同。
四、统计方法
各组患者之间的临床病理数据资料即两组均数的比较用t检验,多个样本均数的比较用方差分析。
结果
1.膀胱癌凋亡细胞的形态特征:以原位DNA断裂位点的3′-羟基末端标记法将凋亡细胞、凋亡小体同非凋亡细胞区别开来。凋亡细胞染色呈棕黄色,定位于细胞核,浓缩的核质紧贴于核膜,部分呈均匀的染色;凋亡小体也可在切片中见到,呈散在分布。
2.表浅膀胱癌中细胞凋亡的发生率及凋亡指数与临床病理特征的关系:87例表浅膀胱癌中,仅9例未发现凋亡细胞,78例有不同程度的凋亡发生,凋亡发生率89.6%。87例表浅膀胱癌病理分级均为Ⅰ～Ⅱ级,术后均行定期卡介苗(BCG)膀胱灌注,凋亡细胞指数与患者临床表现、肿瘤数目、临床分期及手术方式等方面的差异均无显著性意义,P>0.05(附表)。
, 百拇医药
3.表浅膀胱癌中凋亡指数与PCNA指数比值与临床病理特征的关系:凋亡指数/PCNA指数比值与患者临床表现、肿瘤数目、临床分期及手术方式等方面的差异无显著性意义,P>0.05(附表)。
4.凋亡指数与PCNA指数比值与膀胱癌复发的
附表 临床病理表现、肿瘤数目、大小、分期等与凋亡指数及
凋亡指数与PCNA指数比值的关系(
±s)
例数
凋亡指数(%)
凋亡指数/PCNA指数
, 百拇医药
年龄(岁)
>50
63
45.38±32.81
1.39±0.96
<50
24
46.66±28.75
1.48±1.32
性别
男
62
49.32±32.58
, 百拇医药
1.43±1.07
女
25
45.42±30.09
1.33±1.10
肿瘤数目
单发
58
49.58±33.78
1.44±1.07
多发
29
39.68±29.29
, 百拇医药
1.32±1.16
肿瘤分期
T0
10
43.33±35.02
1.41±1.37
Tis
21
36.00±28.63
1.34±0.94
Ta
39
48.57±35.79
, 百拇医药
1.47±1.41
T1
17
41.25±29.00
1.33±1.00
肿瘤大小(cm)
>0.5
55
46.15±29.87
1.34±1.20
<0.5
32
, http://www.100md.com
48.66±35.47
1.43±1.12
手术方式
TUR
58
45.38±30.98
1.41±1.31
开放性
29
47.50±34.20
1.46±0.91
关系:复发组与非复发组细胞凋亡指数分别为42.33±28.82及49.10±29.32,差异无显著意义;而凋亡指数与PCNA指数比值在复发组小于非复发组,分别为 0.92±0.73及1.49±1.06,其差异有显著意义(P<0.01),显示在复发组肿瘤细胞的增殖程度明显高于细胞凋亡程度。 讨 论
, 百拇医药
细胞凋亡的研究方法已从最初的形态学向分子生物学发展[2]。细胞凋亡是因DNA在核小体间特异性的断裂[3]。DNA断裂位点的3'-羟基末端标记法，结合组织化学方法,可准确定位,有利于发现凋亡发生中早期的DNA断裂[4]。我们发现镜下有细胞核质聚集于核膜下，提示凋亡早期阶段染色质浓聚;细胞核内染色均匀一致则表明DNA片段化分布于整个细胞核,凋亡在进一步发展;此后凋亡小体释出,凋亡细胞核缩小,胞质浓缩。因此,本法较形态学标准可发现更多的凋亡细胞,凋亡指数也相对提高,可更准确的反映凋亡发生的程度。增殖细胞核抗原是一种分子量为36000的非组蛋白核内多肽[5]，是DNA合成的辅助蛋白 ,其含量反映了细胞的增殖程度[6]。免疫组化染色可使PCNA在常规固定的石蜡包埋组织切片中准确显示出来,有助于估计细胞的增殖程度。
PCNA指数及凋亡指数是分别反映细胞增殖和凋亡程度的指标。理论上认为PCNA阳性指数越低或凋亡指数越高,则肿瘤生长慢,预后较好,但若只用一个指标来判断细胞的生长状态则难免会造成偏差。Lipponen等[7]认为肿瘤生长至一定程度,肿瘤细胞增殖和死亡维持相对平衡,增殖快,恶性程度高的肿瘤细胞,凋亡也势必增加。这与我们的研究结果相符。我们观察到某些以后有复发的肿瘤中凋亡指数高的现象,若单用凋亡指数这一个指标去判断,势必会推断出肿瘤生长慢,预后较好的结论。相反,某些有复发的肿瘤中PCNA指数较低,势必也会得出肿瘤生长慢,预后较好的结论。但若将凋亡指数与PCNA指数进行对比观察,则发现那些有复发的凋亡指数高的肿瘤中PCNA指数同样很高,甚至更高;PCNA指数较低且有复发的肿瘤中凋亡指数也低，甚至更低;而在大多数标本中凋亡指数与PCNA阳性指数呈相对平衡的状态。我们发现细胞的凋亡指数与表浅膀胱癌的复发无明显相关性。但将凋亡指数与PCNA阳性指数结合起来综合评价,二者的比值与表浅膀胱癌的复发则有明显相关性,说明二者的比值能更好的反映细胞的生长状态。
, http://www.100md.com
无论是DNA断裂原位标记法的凋亡细胞检测,还是PCNA表达的免疫组化显色,均只是检测某一时刻细胞生长的状态,而肿瘤细胞凋亡与增殖之间的平衡受内外因素的影响也在不断的变化之中。目前还没有在肿瘤组织中研究细胞进程的技术,因此,在肿瘤治疗过程中对其增殖和凋亡指数进行追踪检测,对于动态的观察肿瘤生长状态的变化,判断其复发或预后可能具有临床应用价值。
参考文献
1陈凌武,梅骅,王晓波.表浅膀胱移行细胞癌中PCNA表达及其与复发的关系.中华泌尿外科杂志,1996,17:524-526.
2Sgonc R,Wick G.Methods for the detection of apoptosis. Int Arch Allergy Immunol,1994,105:327-332.
3Kerr JFR,Winterford CM,Harmon BN.Apoptosis:its significance in cancer and cancer therapy.Cancer,1994,73:2013-2026.
, 百拇医药
4Gorczyca W,Gong J,Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.Cancer Res,1993,53:1945-1951.
5Bravo R,Frank R,Blindell PA.Cyclin/PCNA is the anxillary protein to DNA polymerase-delta.Nature,1987,326:515-517.
6Dietrich DR.Toxicological and pathological applications of PCNA: a novel endogenous marker for cell proliferation.Crit Rev Toxicol,1993,23:77-109.
7Lipponen PK,Eskelinen MJ.Cell proliferation of transitional cell bladder tumour determined by PCNA/cyclin immunostaining and its prognostic value. Br J Cancer,1992,66:171-176.
本课题受广东省重点科技攻关项目基金资助, 百拇医药
单位：510080 广州，中山医科大学附属孙逸仙医院泌尿外科
关键词：膀胱肿瘤；增殖细胞核抗原；凋亡
中华外科杂志/980813 【摘要】 目的 研究表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡及增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况,并初步探讨其与表浅膀胱移行细胞癌复发的关系。 方法 采用原位DNA末端标记法及免疫组织化学方法检测了87例表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡及PCNA表达情况，计算出细胞凋亡指数及PCNA表达指数，并对复发组与非复发组进行比较。 结果 复发组与非复发组细胞凋亡指数差异无显著意义,而凋亡指数与PCNA指数比值在复发组小于非复发组 (P<0.01)，显示在复发组癌细胞的增殖程度明显高于细胞凋亡程度。 结论 对凋亡指数及PCNA阳性指数的综合分析,即凋亡指数与PCNA阳性指数的比值,可更全面的反映细胞凋亡与增殖的平衡状态,对判断肿瘤的复发具有参考价值。
, 百拇医药
Apoptosis and expression of PCNA in superficial transitional cell bladder cancer as related to recurrence Chen Lingwu, Wang Xiaobo,Mei Hua,et al.Department of Urology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080.
【Abstract】 Objective To determine the expression of apoptosis and PCNA in superficial transitional cell bladder cancer and to evaluate its significance as a recurrence marker. Method 87 cases of superficial transitional cell bladder cancer were analysed for the expression of apoptosis and PCNA by using the 3-end labeling method of DNA and immunohistochemical staining in tissue sections. The apoptotic indexes and PCNA indexes were respectively the percentages of apoptotic cells or PCNA positive cells among tumor cells. Result The end labeling method allowed a precise evaluation of the expression of apoptosis. Apoptosis occurred in 89.6% of superficial transitional cell bladder cancer. In 17 patients who suffered from tumor recurrence,the ratio of apoptosis indexes to PCNA indexes was significantly higher than that in those without recurrence (P<0.01). Conclusion The ratio of apoptosis indexes to PCNA indexes was believed to be related to tumor recurrence and might be of value in the assessment of recurrence of superficial transitional cell bladder cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Bladder neoplasms Proliferating cell nuclear antigen Apoptosis
细胞的增殖与凋亡是反映细胞生长状态的两个方面,我们曾研究了表浅膀胱移行细胞癌中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达情况[1]。为进一步探讨表浅膀胱移行细胞癌中细胞凋亡现象及其临床意义,我们用常规石蜡切片,进行原位的DNA断裂位点末端标记,计算凋亡指数,通过与PCNA表达的对比研究,以求更全面的了解肿瘤细胞的生长状态并探讨其与肿瘤复发的关系。
资料与方法
一、标本及临床资料
自1983年7月至1994年5月治疗表浅膀胱癌87例。患者年龄21～84岁,平均55.7岁。标本经膀胱镜钳取或开放手术得到,均经病理证实为表浅膀胱移行细胞癌,常规福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚切片备染。经随访观察15～121个月,治疗后临床及病理证实为癌肿复发者17例,复发多于术后半年至 2年内发生(非复发者随诊均在3年以上,平均63.6个月)。复发组中男性10例,女性7例，平均年龄52.7岁。肿瘤单发者8例,多发者9例。肿瘤直径大于0.5 cm者8例。开放手术者5例。肿瘤复发与年龄、性别、肿瘤大小、数目、手术方式无明显相关性(P>0.05)。因病例数较少,复发与肿瘤病理分期的相关性未进行统计学分析。
, 百拇医药
二、细胞凋亡的检测
采用美国Oncor公司原位凋亡检测试剂盒(Apop Taq Plus)。
1.原位DNA断裂位点的3'-基末端标记:切片于二甲苯中脱蜡,无水乙醇、95%和70%乙醇水化;以浓度为20 μg/ml蛋白酶K消化30分钟;3%H2O2，封闭内源性过氧化物酶30分钟；配制含末端核苷酸转移酶和地高辛连接的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)的反应混合液,滴加后37℃孵育1小时,磷酸缓冲液(PBS) 洗3次,再滴加连接有过氧化物酶的抗地高辛抗体,室温孵育30分钟;滴加入3,3二氨基联苯胺(DAB),见到棕黄色的阳性细胞后终止反应,甲基绿复染,树脂封片。
2.细胞凋亡指数(apoptotic index,AI)的计算:每张切片选择5个阳性染色最明显的高倍视野(×400),计数500个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。
, 百拇医药
三、PCNA表达的免疫组化检测
PCNA的表达阳性指数的计算方法与参考文献[1]相同。
四、统计方法
各组患者之间的临床病理数据资料即两组均数的比较用t检验,多个样本均数的比较用方差分析。
结果
1.膀胱癌凋亡细胞的形态特征:以原位DNA断裂位点的3′-羟基末端标记法将凋亡细胞、凋亡小体同非凋亡细胞区别开来。凋亡细胞染色呈棕黄色,定位于细胞核,浓缩的核质紧贴于核膜,部分呈均匀的染色;凋亡小体也可在切片中见到,呈散在分布。
2.表浅膀胱癌中细胞凋亡的发生率及凋亡指数与临床病理特征的关系:87例表浅膀胱癌中,仅9例未发现凋亡细胞,78例有不同程度的凋亡发生,凋亡发生率89.6%。87例表浅膀胱癌病理分级均为Ⅰ～Ⅱ级,术后均行定期卡介苗(BCG)膀胱灌注,凋亡细胞指数与患者临床表现、肿瘤数目、临床分期及手术方式等方面的差异均无显著性意义,P>0.05(附表)。
, 百拇医药
3.表浅膀胱癌中凋亡指数与PCNA指数比值与临床病理特征的关系:凋亡指数/PCNA指数比值与患者临床表现、肿瘤数目、临床分期及手术方式等方面的差异无显著性意义,P>0.05(附表)。
4.凋亡指数与PCNA指数比值与膀胱癌复发的
附表 临床病理表现、肿瘤数目、大小、分期等与凋亡指数及
凋亡指数与PCNA指数比值的关系(
±s)例数
凋亡指数(%)
凋亡指数/PCNA指数
, 百拇医药
年龄(岁)
>50
63
45.38±32.81
1.39±0.96
<50
24
46.66±28.75
1.48±1.32
性别
男
62
49.32±32.58
, 百拇医药
1.43±1.07
女
25
45.42±30.09
1.33±1.10
肿瘤数目
单发
58
49.58±33.78
1.44±1.07
多发
29
39.68±29.29
, 百拇医药
1.32±1.16
肿瘤分期
T0
10
43.33±35.02
1.41±1.37
Tis
21
36.00±28.63
1.34±0.94
Ta
39
48.57±35.79
, 百拇医药
1.47±1.41
T1
17
41.25±29.00
1.33±1.00
肿瘤大小(cm)
>0.5
55
46.15±29.87
1.34±1.20
<0.5
32
, http://www.100md.com
48.66±35.47
1.43±1.12
手术方式
TUR
58
45.38±30.98
1.41±1.31
开放性
29
47.50±34.20
1.46±0.91
关系:复发组与非复发组细胞凋亡指数分别为42.33±28.82及49.10±29.32,差异无显著意义;而凋亡指数与PCNA指数比值在复发组小于非复发组,分别为 0.92±0.73及1.49±1.06,其差异有显著意义(P<0.01),显示在复发组肿瘤细胞的增殖程度明显高于细胞凋亡程度。 讨 论
, 百拇医药
细胞凋亡的研究方法已从最初的形态学向分子生物学发展[2]。细胞凋亡是因DNA在核小体间特异性的断裂[3]。DNA断裂位点的3'-羟基末端标记法，结合组织化学方法,可准确定位,有利于发现凋亡发生中早期的DNA断裂[4]。我们发现镜下有细胞核质聚集于核膜下，提示凋亡早期阶段染色质浓聚;细胞核内染色均匀一致则表明DNA片段化分布于整个细胞核,凋亡在进一步发展;此后凋亡小体释出,凋亡细胞核缩小,胞质浓缩。因此,本法较形态学标准可发现更多的凋亡细胞,凋亡指数也相对提高,可更准确的反映凋亡发生的程度。增殖细胞核抗原是一种分子量为36000的非组蛋白核内多肽[5]，是DNA合成的辅助蛋白 ,其含量反映了细胞的增殖程度[6]。免疫组化染色可使PCNA在常规固定的石蜡包埋组织切片中准确显示出来,有助于估计细胞的增殖程度。
PCNA指数及凋亡指数是分别反映细胞增殖和凋亡程度的指标。理论上认为PCNA阳性指数越低或凋亡指数越高,则肿瘤生长慢,预后较好,但若只用一个指标来判断细胞的生长状态则难免会造成偏差。Lipponen等[7]认为肿瘤生长至一定程度,肿瘤细胞增殖和死亡维持相对平衡,增殖快,恶性程度高的肿瘤细胞,凋亡也势必增加。这与我们的研究结果相符。我们观察到某些以后有复发的肿瘤中凋亡指数高的现象,若单用凋亡指数这一个指标去判断,势必会推断出肿瘤生长慢,预后较好的结论。相反,某些有复发的肿瘤中PCNA指数较低,势必也会得出肿瘤生长慢,预后较好的结论。但若将凋亡指数与PCNA指数进行对比观察,则发现那些有复发的凋亡指数高的肿瘤中PCNA指数同样很高,甚至更高;PCNA指数较低且有复发的肿瘤中凋亡指数也低，甚至更低;而在大多数标本中凋亡指数与PCNA阳性指数呈相对平衡的状态。我们发现细胞的凋亡指数与表浅膀胱癌的复发无明显相关性。但将凋亡指数与PCNA阳性指数结合起来综合评价,二者的比值与表浅膀胱癌的复发则有明显相关性,说明二者的比值能更好的反映细胞的生长状态。
, http://www.100md.com
无论是DNA断裂原位标记法的凋亡细胞检测,还是PCNA表达的免疫组化显色,均只是检测某一时刻细胞生长的状态,而肿瘤细胞凋亡与增殖之间的平衡受内外因素的影响也在不断的变化之中。目前还没有在肿瘤组织中研究细胞进程的技术,因此,在肿瘤治疗过程中对其增殖和凋亡指数进行追踪检测,对于动态的观察肿瘤生长状态的变化,判断其复发或预后可能具有临床应用价值。
参考文献
1陈凌武,梅骅,王晓波.表浅膀胱移行细胞癌中PCNA表达及其与复发的关系.中华泌尿外科杂志,1996,17:524-526.
2Sgonc R,Wick G.Methods for the detection of apoptosis. Int Arch Allergy Immunol,1994,105:327-332.
3Kerr JFR,Winterford CM,Harmon BN.Apoptosis:its significance in cancer and cancer therapy.Cancer,1994,73:2013-2026.
, 百拇医药
4Gorczyca W,Gong J,Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.Cancer Res,1993,53:1945-1951.
5Bravo R,Frank R,Blindell PA.Cyclin/PCNA is the anxillary protein to DNA polymerase-delta.Nature,1987,326:515-517.
6Dietrich DR.Toxicological and pathological applications of PCNA: a novel endogenous marker for cell proliferation.Crit Rev Toxicol,1993,23:77-109.
7Lipponen PK,Eskelinen MJ.Cell proliferation of transitional cell bladder tumour determined by PCNA/cyclin immunostaining and its prognostic value. Br J Cancer,1992,66:171-176.
本课题受广东省重点科技攻关项目基金资助, 百拇医药