基质金属蛋白酶在肝癌侵袭转移中的作用
作者：卜文 汤钊猷 刘康达 叶胜龙 薛琼
单位：200032 上海医科大学中山医院肝癌研究所
关键词：
中华外科杂志980926 在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类(Matrix metallo proteinases,MMPs)是主要的直接作用者，而其中的IV型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9)与肿瘤侵袭转移的关系最为密切，因为IV型胶原酶不但可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜主要成分IV型胶原[1]。已有大量研究显示IV型胶原酶与多种肿瘤的侵袭转移有关。然而MMP在我国常见的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用研究的还较少。这包括：(1)IV型胶原酶与HCC侵袭转移的关系目前国内外研究的还较少，意见尚不完全一致[2，3]；(2)基质金属蛋白酶抑制剂对HCC生长和侵袭转移的影响尚无人研究；(3)HCC组织中各种MMP的表达情况。我们试图就这些问题进行研究。
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一、材料
1.标本：HCC标本取自在上海医科大学肝癌研究所接受手术切除并经病理证实为HCC的患者32例。
2.药盒(BB-94)：BB-94由英国生物技术药品公司提供。用药方法为30 mg/kg，腹腔注射，每天1次。
3.原位移植的转移性人肝癌裸鼠模型(LCI-D20)：LCI-D20为上海医科大学肝癌研究所于1994年用原位移植方法建立的裸鼠人肝癌高转移模型。
二、方法
1.标本处理：标本离体后迅速置液氮中，然后放入-85℃冰箱储存备用。
2.明胶酶谱法：根据Kleiner等[4]方法。上样5 μl，孵育43小时。
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3.肝和肺转移的观察方法：动物解剖后观察肝脏表面是否有转移灶，每只动物完整的肺包埋于同一石蜡块中，随机切1张进行HE染色，显微镜下观察是否有转移灶形成。
4.RT-PCR：总RNA抽提使用一步法(方法简略)。
5. 统计方法：两组间均数采用t检验，两组间率采用χ2检验。
三、结果
1.HCC癌组织中MMP-2、MMP-9含量与癌栓形成间的关系：有癌栓HCC患者癌组织(n=9)中MMP-2、MMP-9含量(灰度面积179.2±39.3 mg/ml和36.46±9.02 mg/ml)显著高于无癌栓形成患者癌组织(n=23)中MMP-2、MMP-9含量(灰度面积47.2±11.3 mg/ml和6.34±2.42 mg/ml)，P<0.01。
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2. BB-94对LCI-D20肿瘤生长及侵袭转移等的影响：BB-94治疗组(n=9)与对照组(n=10)腹壁侵袭发生率分别为22%和80%，P<0.05；肝内播散发生率分别为33%和80%，P>0.05；肺转移发生率分别为44%和100%，P<0.05；肿瘤大小分别为2.27±1.17 g和3.13±0.84 g，P<0.05。
3.LCI-D20癌组织中MMPs的表达：明胶酶谱法检测显示LCI-D20组织中存在MMP-2、MMP-9。RT-PCR显示LCI-D20组织中存在MMP-1的mRNA表达，但未见MMP-10的mRNA表达。
四、讨论
本研究显示HCC组织中MMP-2、MMP-9含量升高与癌栓形成相关，而癌栓形成是HCC侵袭转移性最为可靠的指标之一，从而说明MMP-2、MMP-9与HCC侵袭转移有关。这一关系的认识对今后通过MMP-2、MMP-9判断HCC侵袭转移性及通过MMPs抑制剂来抑制HCC转移复发提供了理论依据。
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肿瘤细胞在侵袭过程中需要基质金属蛋白酶对细胞外基质进行酶解，肿瘤细胞在转移过程中要先后经过进出毛细血管两个过程，在这两个过程中肿瘤细胞必须穿过内皮细胞基底膜，而这一过程又必须依赖MMPs尤其是MMP-2、MMP-9对基底膜成分的酶解，因此，对MMPs的抑制将产生对肿瘤细胞侵袭和转移的抑制。
肿瘤生长时必然破坏周围正常组织来为其生长提供空间，肿瘤生长到一定大小后又必须有肿瘤血管形成来为其提供营养，而肿瘤细胞对周围正常组织的破坏以及肿瘤血管形成过程中内皮细胞的移行均需要基质金属蛋白酶的参与，因此，基质金属蛋白酶抑制剂可以间接地抑制肿瘤生长。
(志谢 英国生物技术药品公司提供了BB-94, 该公司的 Peter D. Brown、 Alan Drummond和Pam McHale博士在BB-94研究过程中给予了热情友好的支持)
本课题受上海市医学领先学科基金和美国中华医学基金会基金资助
, 百拇医药
参考文献
1Aznavoorian S, Murphy AN, Stetler-Stevenson WG, et al. Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis. Cancer,1993,71:1368.
2Grigioni WF, Garbisa S, Errico AD, et al. Evaluation of hepatocellular carcinoma aggressiveness by a panel of extracellular matrix antigens. Am J Pathol,1991,138:647.
3Lichtinghagen R, Helmbrecht T, Arndt B, et al. Expression pattern of matrix metalloproteinases in human liver. Eur J Clin Chem Biochem,1995,33:65.
4Kleiner D E, Stetler-Stevenson WG. Quantitative zymography:detection of picogran quantities of gelatinases. Anal Biochem, 1994,218:325.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-06-11), http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学中山医院肝癌研究所
关键词：
中华外科杂志980926 在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类(Matrix metallo proteinases,MMPs)是主要的直接作用者，而其中的IV型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9)与肿瘤侵袭转移的关系最为密切，因为IV型胶原酶不但可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜主要成分IV型胶原[1]。已有大量研究显示IV型胶原酶与多种肿瘤的侵袭转移有关。然而MMP在我国常见的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用研究的还较少。这包括：(1)IV型胶原酶与HCC侵袭转移的关系目前国内外研究的还较少，意见尚不完全一致[2，3]；(2)基质金属蛋白酶抑制剂对HCC生长和侵袭转移的影响尚无人研究；(3)HCC组织中各种MMP的表达情况。我们试图就这些问题进行研究。
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一、材料
1.标本：HCC标本取自在上海医科大学肝癌研究所接受手术切除并经病理证实为HCC的患者32例。
2.药盒(BB-94)：BB-94由英国生物技术药品公司提供。用药方法为30 mg/kg，腹腔注射，每天1次。
3.原位移植的转移性人肝癌裸鼠模型(LCI-D20)：LCI-D20为上海医科大学肝癌研究所于1994年用原位移植方法建立的裸鼠人肝癌高转移模型。
二、方法
1.标本处理：标本离体后迅速置液氮中，然后放入-85℃冰箱储存备用。
2.明胶酶谱法：根据Kleiner等[4]方法。上样5 μl，孵育43小时。
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3.肝和肺转移的观察方法：动物解剖后观察肝脏表面是否有转移灶，每只动物完整的肺包埋于同一石蜡块中，随机切1张进行HE染色，显微镜下观察是否有转移灶形成。
4.RT-PCR：总RNA抽提使用一步法(方法简略)。
5. 统计方法：两组间均数采用t检验，两组间率采用χ2检验。
三、结果
1.HCC癌组织中MMP-2、MMP-9含量与癌栓形成间的关系：有癌栓HCC患者癌组织(n=9)中MMP-2、MMP-9含量(灰度面积179.2±39.3 mg/ml和36.46±9.02 mg/ml)显著高于无癌栓形成患者癌组织(n=23)中MMP-2、MMP-9含量(灰度面积47.2±11.3 mg/ml和6.34±2.42 mg/ml)，P<0.01。
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2. BB-94对LCI-D20肿瘤生长及侵袭转移等的影响：BB-94治疗组(n=9)与对照组(n=10)腹壁侵袭发生率分别为22%和80%，P<0.05；肝内播散发生率分别为33%和80%，P>0.05；肺转移发生率分别为44%和100%，P<0.05；肿瘤大小分别为2.27±1.17 g和3.13±0.84 g，P<0.05。
3.LCI-D20癌组织中MMPs的表达：明胶酶谱法检测显示LCI-D20组织中存在MMP-2、MMP-9。RT-PCR显示LCI-D20组织中存在MMP-1的mRNA表达，但未见MMP-10的mRNA表达。
四、讨论
本研究显示HCC组织中MMP-2、MMP-9含量升高与癌栓形成相关，而癌栓形成是HCC侵袭转移性最为可靠的指标之一，从而说明MMP-2、MMP-9与HCC侵袭转移有关。这一关系的认识对今后通过MMP-2、MMP-9判断HCC侵袭转移性及通过MMPs抑制剂来抑制HCC转移复发提供了理论依据。
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肿瘤细胞在侵袭过程中需要基质金属蛋白酶对细胞外基质进行酶解，肿瘤细胞在转移过程中要先后经过进出毛细血管两个过程，在这两个过程中肿瘤细胞必须穿过内皮细胞基底膜，而这一过程又必须依赖MMPs尤其是MMP-2、MMP-9对基底膜成分的酶解，因此，对MMPs的抑制将产生对肿瘤细胞侵袭和转移的抑制。
肿瘤生长时必然破坏周围正常组织来为其生长提供空间，肿瘤生长到一定大小后又必须有肿瘤血管形成来为其提供营养，而肿瘤细胞对周围正常组织的破坏以及肿瘤血管形成过程中内皮细胞的移行均需要基质金属蛋白酶的参与，因此，基质金属蛋白酶抑制剂可以间接地抑制肿瘤生长。
(志谢 英国生物技术药品公司提供了BB-94, 该公司的 Peter D. Brown、 Alan Drummond和Pam McHale博士在BB-94研究过程中给予了热情友好的支持)
本课题受上海市医学领先学科基金和美国中华医学基金会基金资助
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参考文献
1Aznavoorian S, Murphy AN, Stetler-Stevenson WG, et al. Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis. Cancer,1993,71:1368.
2Grigioni WF, Garbisa S, Errico AD, et al. Evaluation of hepatocellular carcinoma aggressiveness by a panel of extracellular matrix antigens. Am J Pathol,1991,138:647.
3Lichtinghagen R, Helmbrecht T, Arndt B, et al. Expression pattern of matrix metalloproteinases in human liver. Eur J Clin Chem Biochem,1995,33:65.
4Kleiner D E, Stetler-Stevenson WG. Quantitative zymography:detection of picogran quantities of gelatinases. Anal Biochem, 1994,218:325.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-06-11), http://www.100md.com