干扰能和维甲酸对人卵巢癌联合诱导分化的实验研究
作者：周友珍 刘海伦 张素梅 吴澄宇
单位：100038 北京铁路总医院妇产科
关键词：
中华医学杂志/980927 实体瘤诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的新途径，α-干扰素和维甲酸联合治疗晚期宫颈癌和皮肤鳞癌已取得明显效果[1]，但卵巢癌的联合诱导分化尚少见报道。为此，我们观察了全反式维甲酸(RA)和干扰能(IFN-α-2b，简称IFN-α)联合对人卵巢癌(SKOV3)的体内外诱导分化作用。
一、材料与方法
1.材料：人卵巢上皮癌细胞株(SKOV3)[2]由北京协和医院提供 。雌性BALB/C裸鼠购于军事医学科学院动物中心。RA系国产，IFN-α系美国Renilorth公司生产。C-erbB-2探针标记试剂盒为华美公司产品。
, 百拇医药
2.细胞培养及毒性试验：SKOV3细
本课题为铁道部科研基金资助项目
胞按常规方法培养于RPMI-1640培养液中(含20%小牛血清)[3]，实验分4组：(1)对照组；(2) RA组：分别为10、1及0.1 μmol/L浓度；(3) IFN-α组：分别为2 000、1 000及100 U/ml的浓度；(4) 联合组：RA与IFN-α联合应用，采用台盼蓝拒染法测定药物对细胞的毒性反应，连续5天。
3.DNA合成及集落形成率的测定：采用3H-TdR掺入法测定细胞内DNA生物合成。用双层软琼脂法测定SKOV3细胞的集落形成能力[4]。
4.培养液中CA125含量的测定：采用上述药物处理方案，每天收集培养液并计数活细胞，用放射免疫法测定培养液中CA125分泌量。
, 百拇医药
5.RA和IFN-α联合对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响：将SKOV3细胞(5×106)接种于裸鼠背部皮下，16天后肿瘤界限清楚，随机分4组，每组6只：(1) RA组：2 mg*kg-1*d溶于0.2 ml玉米油中经胃管给予，每周4次，连用4周；(2) IFN-α组：20万U/d皮下注射，每周3次，同时用等体积玉米油灌胃；(3) 联合组：RA和IFN-α联用；(4) 对照组：用0.1 ml生理盐水皮下注射，0.2 ml玉米油灌胃。给药后每周测体重1次，每隔2天用电子游标卡尺测量肿瘤长宽径，计算肿瘤体积及抑瘤率。
6.病理学检查：末次给药后2天处死裸鼠，随机取材、固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察细胞密度及核分裂相变化。
7.RNA提取及斑点杂交：用异硫氰酸胍一步法提取肿瘤组织RNA，变性处理后常规点样、洗涤及烘干，C-erbB-2探针杂交，放射自显影3天洗片，吸光度扫描仪扫描。
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8.统计学方法：采用t检验。
二、结果
1.体外联合诱导分化的用药剂量：根据细胞毒性试验，选择2药联合后5天内未出现毒性反应的最大剂量(RA1 μmol/L，IFN-α 1 000U/ml)作为体外联合诱导分化的用药剂量。
2.RA和IFN-α联合对SKOV3细胞DNA合成及集落形成的影响：SKOV3细胞经RA或IFN-α单独作用3天，3H-TdR掺入抑制率为30.3%和28.6%；2药联合抑制率达59.3%，与单独用药比较P<0.01。集落形成试验显示：对照组集落数为177/皿，RA或IFN-α组为95/皿及132/皿，联合组集落数较其它组明显降低，为44/皿(P<0.01)。
3.CA125分泌量测定结果：药物作用96小时后，对照组CA125值为2 153±137 U/106细胞，RA和IFN-α组分别为1 451±229 U/106细胞和1 905±188 U/106细胞,2药合用后CA125分泌明显减少，达916±90 U/106细胞(P<0.05)。
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4.裸鼠种植瘤生长情况：RA和IFN-α处理4周，抑瘤率分别为33.5%和19.3%，两药合用后抑瘤率为56.3%，与单独用药组比较P<0.05。联合组裸鼠体重增加与其它组比较，差异无显著意义，表明两药联合后体内毒性并未增加。
5.SKOV3种植瘤病理检查结果：如附表所示，RA和IFN-α联合应用后，细胞密度和核分裂数明显降低，核碎裂细胞并未增加，与其它组比较，差异有显著意义(P<0.01)。
6.种植瘤癌基因表达的变化：对照组癌基因C-erbB-2表达最高，为797.5[吸光度值(A)]；RA和IFN-α单用分别为422 A和503 A；联合组最低，为419.5 A。
附表 各组种植瘤细胞密度和核分裂相
结果(
±s) 组别
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肿瘤细胞密度
(个/0.04 mmm3视野)
核分裂数
对照组
944±120
(100.0)
18.2±4.4
(100.0)
RA组
727±124
(77.0)
15.4±3.9
, 百拇医药
(84.6)
IFN-α组
842±175
(89.1)
16.8±3.8
(92.3)
联合组
517±141
(54.8*)
9.2±2.2
(50.6*)
注：* 与其它组比较P<0.05；括号内为百分比
, 百拇医药
三、讨论
持续分裂和不断增殖是癌细胞的主要特征，细胞增殖速度减慢常常是细胞分化的结果[5]。研究发现：1 μmol/L RA和1 000 U/ml IFN-α联合在体外能明显抑制SKOV3细胞的增殖及DNA合成，降低软琼脂中的集落形成，毒性试验显示其抑制作用为非细胞毒的生长抑制效应。体内实验中我们首先以人卵巢癌裸鼠移植瘤为模型，采用体内给药来观察诱导分化效果，与其它作者将细胞在体外用诱导分化剂处理后再接种裸鼠成瘤相比，与临床的相关性更强。结果表明，低剂量RA和IFN-α联合能明显降低移植瘤的生长速度和核分裂指数，且药物毒性并未增加。
CA125是卵巢上皮癌细胞表面肿瘤相关抗原，CA125分泌量的多少反映了卵巢癌恶性程度的高低。SKOV3细胞经RA和IFN-α联合作用后，CA125分泌量较单独用药及对照组明显减少，表明RA和IFN-α联合能诱导SKOV3细胞向良性方向分化。
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近年研究发现，原癌基因C-erbB-2在卵巢组织中的表达水平与其恶性程度成正相关[6]。SKOV3细胞为C-erbB-2高表达的卵巢癌细胞系，经RA和IFN-α联合处理后，癌组织中C-erbB-2基因表达均较单独用药组减少，表明该移植瘤的恶性生物学行为降低。上述研究结果提示：小剂量RA和IFN-α联合对人卵巢癌SKOV3细胞有明显的诱导分化作用，两药联合可用于卵巢上皮癌的临床治疗。参考文献
1 John J. 13-cis-retinoic acid and interferon-α-2a combination therapy in advanced squamous cell carcinoma. Mol Cell Differ,1994,1：396-401.
2 Fogh J,Trampe G. New human tumor cell lines. In: Fogh J,ed.Human tumor cell in vitro. New York：Plenum, 1975.155-160.
, http://www.100md.com
3 陈秀珍主编.体细胞培养技术，上海：上海医科大学出版社，1989.10-12.
4 鄂征主编. 组织培养技术. 北京：人民卫生出版社，1988.157.
5 Zou CP,Clifford JL, Xu XC,et al. Modulation by retinoic acid (RA) of squamous cell differentiation ,cellular RA-binding proteins ,and nuclear RA receptors in human head and neck squamous cell carcinoma cell lines. Cancer Res,1994,54:5479-5487.
6 Yu D,Wolf JK,Scanlon M, et al. C-erbB-2/neu expression in human ovarian cancer cells correlates with more severe malignancy that can be suppressed by EIA. Cancer Res,1993,53:891-898., 百拇医药
单位：100038 北京铁路总医院妇产科
关键词：
中华医学杂志/980927 实体瘤诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的新途径，α-干扰素和维甲酸联合治疗晚期宫颈癌和皮肤鳞癌已取得明显效果[1]，但卵巢癌的联合诱导分化尚少见报道。为此，我们观察了全反式维甲酸(RA)和干扰能(IFN-α-2b，简称IFN-α)联合对人卵巢癌(SKOV3)的体内外诱导分化作用。
一、材料与方法
1.材料：人卵巢上皮癌细胞株(SKOV3)[2]由北京协和医院提供 。雌性BALB/C裸鼠购于军事医学科学院动物中心。RA系国产，IFN-α系美国Renilorth公司生产。C-erbB-2探针标记试剂盒为华美公司产品。
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2.细胞培养及毒性试验：SKOV3细
本课题为铁道部科研基金资助项目
胞按常规方法培养于RPMI-1640培养液中(含20%小牛血清)[3]，实验分4组：(1)对照组；(2) RA组：分别为10、1及0.1 μmol/L浓度；(3) IFN-α组：分别为2 000、1 000及100 U/ml的浓度；(4) 联合组：RA与IFN-α联合应用，采用台盼蓝拒染法测定药物对细胞的毒性反应，连续5天。
3.DNA合成及集落形成率的测定：采用3H-TdR掺入法测定细胞内DNA生物合成。用双层软琼脂法测定SKOV3细胞的集落形成能力[4]。
4.培养液中CA125含量的测定：采用上述药物处理方案，每天收集培养液并计数活细胞，用放射免疫法测定培养液中CA125分泌量。
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5.RA和IFN-α联合对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响：将SKOV3细胞(5×106)接种于裸鼠背部皮下，16天后肿瘤界限清楚，随机分4组，每组6只：(1) RA组：2 mg*kg-1*d溶于0.2 ml玉米油中经胃管给予，每周4次，连用4周；(2) IFN-α组：20万U/d皮下注射，每周3次，同时用等体积玉米油灌胃；(3) 联合组：RA和IFN-α联用；(4) 对照组：用0.1 ml生理盐水皮下注射，0.2 ml玉米油灌胃。给药后每周测体重1次，每隔2天用电子游标卡尺测量肿瘤长宽径，计算肿瘤体积及抑瘤率。
6.病理学检查：末次给药后2天处死裸鼠，随机取材、固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察细胞密度及核分裂相变化。
7.RNA提取及斑点杂交：用异硫氰酸胍一步法提取肿瘤组织RNA，变性处理后常规点样、洗涤及烘干，C-erbB-2探针杂交，放射自显影3天洗片，吸光度扫描仪扫描。
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8.统计学方法：采用t检验。
二、结果
1.体外联合诱导分化的用药剂量：根据细胞毒性试验，选择2药联合后5天内未出现毒性反应的最大剂量(RA1 μmol/L，IFN-α 1 000U/ml)作为体外联合诱导分化的用药剂量。
2.RA和IFN-α联合对SKOV3细胞DNA合成及集落形成的影响：SKOV3细胞经RA或IFN-α单独作用3天，3H-TdR掺入抑制率为30.3%和28.6%；2药联合抑制率达59.3%，与单独用药比较P<0.01。集落形成试验显示：对照组集落数为177/皿，RA或IFN-α组为95/皿及132/皿，联合组集落数较其它组明显降低，为44/皿(P<0.01)。
3.CA125分泌量测定结果：药物作用96小时后，对照组CA125值为2 153±137 U/106细胞，RA和IFN-α组分别为1 451±229 U/106细胞和1 905±188 U/106细胞,2药合用后CA125分泌明显减少，达916±90 U/106细胞(P<0.05)。
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4.裸鼠种植瘤生长情况：RA和IFN-α处理4周，抑瘤率分别为33.5%和19.3%，两药合用后抑瘤率为56.3%，与单独用药组比较P<0.05。联合组裸鼠体重增加与其它组比较，差异无显著意义，表明两药联合后体内毒性并未增加。
5.SKOV3种植瘤病理检查结果：如附表所示，RA和IFN-α联合应用后，细胞密度和核分裂数明显降低，核碎裂细胞并未增加，与其它组比较，差异有显著意义(P<0.01)。
6.种植瘤癌基因表达的变化：对照组癌基因C-erbB-2表达最高，为797.5[吸光度值(A)]；RA和IFN-α单用分别为422 A和503 A；联合组最低，为419.5 A。
附表 各组种植瘤细胞密度和核分裂相
结果(
±s) 组别, http://www.100md.com
肿瘤细胞密度
(个/0.04 mmm3视野)
核分裂数
对照组
944±120
(100.0)
18.2±4.4
(100.0)
RA组
727±124
(77.0)
15.4±3.9
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(84.6)
IFN-α组
842±175
(89.1)
16.8±3.8
(92.3)
联合组
517±141
(54.8*)
9.2±2.2
(50.6*)
注：* 与其它组比较P<0.05；括号内为百分比
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三、讨论
持续分裂和不断增殖是癌细胞的主要特征，细胞增殖速度减慢常常是细胞分化的结果[5]。研究发现：1 μmol/L RA和1 000 U/ml IFN-α联合在体外能明显抑制SKOV3细胞的增殖及DNA合成，降低软琼脂中的集落形成，毒性试验显示其抑制作用为非细胞毒的生长抑制效应。体内实验中我们首先以人卵巢癌裸鼠移植瘤为模型，采用体内给药来观察诱导分化效果，与其它作者将细胞在体外用诱导分化剂处理后再接种裸鼠成瘤相比，与临床的相关性更强。结果表明，低剂量RA和IFN-α联合能明显降低移植瘤的生长速度和核分裂指数，且药物毒性并未增加。
CA125是卵巢上皮癌细胞表面肿瘤相关抗原，CA125分泌量的多少反映了卵巢癌恶性程度的高低。SKOV3细胞经RA和IFN-α联合作用后，CA125分泌量较单独用药及对照组明显减少，表明RA和IFN-α联合能诱导SKOV3细胞向良性方向分化。
, http://www.100md.com
近年研究发现，原癌基因C-erbB-2在卵巢组织中的表达水平与其恶性程度成正相关[6]。SKOV3细胞为C-erbB-2高表达的卵巢癌细胞系，经RA和IFN-α联合处理后，癌组织中C-erbB-2基因表达均较单独用药组减少，表明该移植瘤的恶性生物学行为降低。上述研究结果提示：小剂量RA和IFN-α联合对人卵巢癌SKOV3细胞有明显的诱导分化作用，两药联合可用于卵巢上皮癌的临床治疗。参考文献
1 John J. 13-cis-retinoic acid and interferon-α-2a combination therapy in advanced squamous cell carcinoma. Mol Cell Differ,1994,1：396-401.
2 Fogh J,Trampe G. New human tumor cell lines. In: Fogh J,ed.Human tumor cell in vitro. New York：Plenum, 1975.155-160.
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3 陈秀珍主编.体细胞培养技术，上海：上海医科大学出版社，1989.10-12.
4 鄂征主编. 组织培养技术. 北京：人民卫生出版社，1988.157.
5 Zou CP,Clifford JL, Xu XC,et al. Modulation by retinoic acid (RA) of squamous cell differentiation ,cellular RA-binding proteins ,and nuclear RA receptors in human head and neck squamous cell carcinoma cell lines. Cancer Res,1994,54:5479-5487.
6 Yu D,Wolf JK,Scanlon M, et al. C-erbB-2/neu expression in human ovarian cancer cells correlates with more severe malignancy that can be suppressed by EIA. Cancer Res,1993,53:891-898., 百拇医药