脂质体包裹EGFR反义寡脱氧核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖
作者：吴金生 何 勇 王述民
单位：
关键词：结直肠肿瘤；表皮生长因子受体；寡脱氧核苷酸类；细胞株；脂质体
脂质体包裹EGFR反义寡脱氧核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖 吴金生 何 勇 王述民 Inhibitory effects of EGFR antisense oligodeoxynucleotide with liposome in human colorectal
Inhibitory effects of EGFR antisense oligodeoxynucleotide with liposome in human colorectal cancer cell line
WU Jin-Sheng, HE Yong and WANG Shu-Min
, 百拇医药
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Subject headings colorectal neoplasms; oligonucleotides; epidermal growth factor receptor; cell line; liposome
Abstract
AIM To investigate the effect of antisense EGFR oligodeoxynucleotides (ODNs) on human rectal carcinoma cell line HR8348.
, 百拇医药 METHODS Acationic liposome and lipofectin were selected as a delivery vectoe. HR8348 cells were treated with antisense ODNs in vitro. HR8348 cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.
RESULTS HR8348 treated with antisense EGFR greatly inhibited the proliferation with a rate of 71% and DNA synthesis (PI of EGFR group vs control group, 0.361 vs 0.784) of HR8348 cell line, decreased coloning formation in anchorage-independent assay. In vivo tumorigenic rate was greatly reduced in athymic nude mice as compared with untreated cells group (25% vs 100%).
, 百拇医药
CONCLUSION Antisense EGFR ODNs could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo, the results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy.
中国图书资料分类号 R?735.34
摘 要
目的 研究用表皮生长因子受体(EGFR)反义寡脱氧核苷酸(ASODN)抑制人大肠癌细胞株HR8348的生长增殖，探讨大肠癌治疗的新途径.
方法 人工合成的EGFR反义ODN及无关对照ODN经脂质体包裹后作用HR8348细胞，采用MTT法，[3H]-TdR掺入试验，细胞周期分析，裸鼠体内接种等方法测定细胞体内外增殖的变化.
, 百拇医药
结果 经EGFR反义ODN处理的HR8348细胞与对照组HR8348细胞相比，体外增殖速度减慢(细胞增殖抑制率达71%)、DNA合成受抑(细胞增殖指数为0.361 vs 0.784，S期细胞数为34.8% vs 59.9%)、裸鼠体内成瘤率下降(25% vs 100%).
结论 EGFR反义ODN可有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖，可用于实验性肿瘤基因治疗研究.
0 引言
大肠癌是严重威胁人类健康的常见肿瘤之一，但传统的治疗方法均未使大肠癌的五年生存率有明显改善[1]. 为此国内外学者试图寻找一种新的治疗方法来改变这一状况，目前研究的一个热点就是基因治疗. 研究报道表皮生长因子受体(EGFR)的某些生物学功能与肿瘤有密切关系，并证实在结肠癌中有表达增高[2]. 本实验室也在人大肠癌细胞株HR8348中检测出EGFR的表达增高. 因此，我们认为选择性阻抑EGFR的表达，对大肠癌细胞的生长增殖具有普遍的影响. 在本研究中我们选用阳离子脂质体Lipofectin[3]作为载体，利用人工合成的EGFR反义寡脱氧核苷酸(ODN)处理人大肠癌细胞株HR8348，获得了对大肠癌细胞体内外生长增殖的抑制，以期为今后大肠癌的基因治疗提供实验依据.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 人大肠癌细胞株HR8348来源于1例男性直肠腺癌患者的手术切除标本，由中国医学科学院肿瘤研究所提供. 培养在含100?mL/?L小牛血清的RPMI1640(GIBCO公司)培养液，37℃，50?mL/?L CO2的环境中.
1.2 EGFR反义 ODN的合成由第四军医大学生物化学教研室设计合成. EGFR反义ODN与EGFR cDNA的上游部位(包含起始密码)共计21个碱基互补，序列为：5＇-CGT CCC GGA GGG TCG CAT CGC-3＇. 另经计算机检索与EGFR cDNA无互补性的一段21个碱基的ODN作为寡核苷酸毒性对照，序列为：5＇-GGC CTC GGA TCC TGC TTT GCA-3＇. 以上ODN均用硫代磷酸修饰.
1.3 脂质体-ODN复合物的制备 阳离子脂质体lipofectin购自GIBCO-BRL公司，制备前将ODN稀释于0.1?mL无血清无抗生素的RPMI1640中，加入同样方法稀释的lipofectin，混匀，室温放置5min～10min，即可形成脂质体-ODN复合物并立即用于细胞处理. 脂质体与ODN用量参考说明书.
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1.4 细胞处理 用无血清无抗生素的RPMI1640稀释HR8348细胞，接种0.8?mL细胞(约1.5×106个)于35?mm培养皿. 将脂质体-ODN复合物(0.2?mL)加入培养皿，充分混匀，培养5?h后，添加4?mL含血清RPMI1640继续培养43?h. 而后收集细胞.
1.5 ODN对HR8348细胞生长增殖的影响 采用MTT法及[3H]-TdR掺入试验取对数生长期细胞用无血清无抗生素RPMI1640稀释，接种40?μL细胞(约1×104个)于96孔培养板，充分混合，培养5?h后，添加200?μL，含血清RPMI1640继续培养39?h. 而后吸弃上清，以RPMI1640清洗两遍，加入RPMI1640液200?μL， MTT(5?g/?L) 20?μL，37℃培养4?h后吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200?μL，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490?nm波长处测其吸光值，每组复设3孔，取均值. 设空白对照、阴性对照各一组. 另一组96孔培养板中同上加入细胞及脂质体-ODN复合物，培养5?h后添加200?μL含血清RPMI1640继续培养19?h，向培养液中加入[3H]-TdR，培养24?h后按文献[4]进行测定.
, 百拇医药
1.6 细胞周期动力学分析 将处理细胞经胰蛋白酶消化后，制成1×104/?L细胞悬液，碘化丙啶(PI)染色，FACScan流式细胞仪测定.
1.7 裸鼠致瘤能力实验 裸鼠11只分成实验组、空白组、阴性对照组，分别为4只、3只、4只，分别于皮下注射1×107细胞.
2 结果
2.1 ODN对HR8348细胞DNA合成及生长增殖的抑制 EGFR反义ODN能抑制HR8348细胞的DNA合成及生长增殖. 与空白对照组相比，肿瘤细胞生长增殖的抑制率约为71%，[3H]-TdR掺入试验的抑制率为73%. 而经无关对照ODN处理的阴性对照组对HR8348细胞的生长增殖以及DNA合成无显著抑制.
2.2 细胞周期分析 EGFR反义ODN作用于HR8348细胞后，细胞G0/?G1期细胞数明显增多，S期细胞数相应减少，而G2+M期细胞数亦明显的减少，而无关ODN组作用明显减弱，差异明显(表1).
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表1 不同处理HR8348细胞周期分析
组 别
G0/?G1
S
G2/?M
PI
HR8348(空白对照组)
21.6
59.9
18.5
0.784
无关ODN(阴性对照组)
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29.5
54.9
15.6
0.705
EGFR反义ODN(实验组)
55.9
34.8
9.3
0.361
2.3 裸鼠皮下移植瘤生长 空白对照组3只及阴性对照组4只所有接种部位均有移植瘤形成且肿瘤体积大，成瘤率为100%(3/?3,4/?4)，EGFR反义ODN处理4只，成瘤率低下(25%，1/?4)，且移植瘤生长缓慢，瘤体小.
, 百拇医药
3 讨论
随着分子生物学技术的发展和对癌基因，生长因子及生长因子受体研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子及其受体在介导细胞信号转导、促进细胞分裂和增殖转化中占有重要地位. 促瘤形成的自分泌和旁分泌机制的提出[5]，促进了肿瘤发生机制的深入研究. 有许多证据证明EGFR在肿瘤细胞的恶性增殖中起一定作用，在许多恶性肿瘤中都发现有EGFR的过度表达，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌[6]及前列腺癌等，EGFR可与转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)等配体结合而激活受体的酪氨酸酶活性，从而启动细胞有丝分裂，引起及诱导血管形成和肿瘤生长[7]. 已有实验证明，TGF-α可以通过自分泌机制在细胞的癌变中起一定作用，而EGFR在肿瘤细胞膜中存在过度表达，其在肿瘤发生和发展中起一定的作用.
本研究结果显示，EGFR反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的生长增殖和DNA合成均有抑制作用，经EGFR反义ODN处理后的肿瘤细胞的裸鼠体内致瘤能力明显下降，而经无关对照的ODN处理有的肿瘤细胞无此抑制作用，流式细胞仪的细胞周期分析结果也表明，EGFR反义ODN处理的肿瘤细胞生长明显被阻滞于G0/?G1期，增殖指数(Proliferation Index, PI)明显低于其他两组对照组，表明EGFR反义ODN可阻抑EGFR激活后所促发的细胞向S期过渡及由此导致的细胞过度增殖. EGFR反义ODN对EGFR表达的抑制机制可能为：①直接与EGFR的mRNA结合诱发内源性核酸酶对杂交体中RNA部分的水解；②封闭酶结合位点；③阻断前mRNA的剪切；④与双链DNA的某一段特异性结合，形成三螺旋结构[8].
, 百拇医药
脂质体是由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，无毒无免疫原性，使用方便. 一些阳离子脂质更被认为有应用前景[9]，因为这些阳离子脂质体一方面可以通过离子吸附方式结合带阴离子的DNA，ODN分子，另一方面能与细胞作用，通过融合、内吞等方式将所携带的DNA或ODN分子送入细胞.
本实验观察了应用人工合成的EGFR反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的作用. 结果表明，EGFR反义ODN能抑制HR8348的细胞生长增殖和DNA合成，抑制了其在裸鼠体内形成肿瘤的能力. 本研究对大肠癌发生机制的探讨和大肠癌的基因治疗有一定的理论意义和潜在的应用价值.
4 参考文献
1 Abulafi AM, Willams NS. Local recurrence of colorectal cancer: the problem, mechanisms, management and adjuvant therapy. Br J Surg, 1994;81(1):7-19
, 百拇医药
2 Steele RJC, Kelly P, Ellul B, Eremin O. Epidermal growth factor receptor expression in colorectal cancer. Br J Surg, 1990;77(12):1352-1354
3 Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Chan HW, Wenz M et al. Lipofectin: a highly efficient lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84(21):7413-7417
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版公司，1996：193-194
5 Ciaradiello F, Bianco C, Normanno N, Baldassarre G, Pepe S, Tortora G et al. Infection with a transforming growth factor α anti-sense retroviral expression vector reduces the in vitro growth and transformation of a human colon cancer cell line. Int J Cancer, 1993;54(6):952-958
, http://www.100md.com
6 Harris AL, Nicholson S, Sainsbury R, Wright C, Farndon J. Epidermal growth factor receptor and other oncogenes as prognostic marker. Natl Cancer Inst Monogr, 1992;11(2):181-187
7 Ekstrancl AJ, James CD, Cavenee WK, Seliger B, Pettersson RF et al. Genes for epidermal growth factor receptor, transforming growth factor, epidermal growth factor and their expression in human gliomas in vivo. Cancer Res, 1991;51(8):2164-2172
8 Mercola D, Cohen JS. Antisense approaches to cancer gene therapy. Cancer Gene Ther, 1995;21(1):47-51
9 Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, Tsai YJ, Border R et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem, 1994;269(4):2550-2561, 百拇医药
单位：
关键词：结直肠肿瘤；表皮生长因子受体；寡脱氧核苷酸类；细胞株；脂质体
脂质体包裹EGFR反义寡脱氧核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖 吴金生 何 勇 王述民 Inhibitory effects of EGFR antisense oligodeoxynucleotide with liposome in human colorectal
Inhibitory effects of EGFR antisense oligodeoxynucleotide with liposome in human colorectal cancer cell line
WU Jin-Sheng, HE Yong and WANG Shu-Min
, 百拇医药
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Subject headings colorectal neoplasms; oligonucleotides; epidermal growth factor receptor; cell line; liposome
Abstract
AIM To investigate the effect of antisense EGFR oligodeoxynucleotides (ODNs) on human rectal carcinoma cell line HR8348.
, 百拇医药 METHODS Acationic liposome and lipofectin were selected as a delivery vectoe. HR8348 cells were treated with antisense ODNs in vitro. HR8348 cells with or without pretreatment were inoculated into nude mice.
RESULTS HR8348 treated with antisense EGFR greatly inhibited the proliferation with a rate of 71% and DNA synthesis (PI of EGFR group vs control group, 0.361 vs 0.784) of HR8348 cell line, decreased coloning formation in anchorage-independent assay. In vivo tumorigenic rate was greatly reduced in athymic nude mice as compared with untreated cells group (25% vs 100%).
, 百拇医药
CONCLUSION Antisense EGFR ODNs could inhibit the proliferation of human colon cancer cell line in vitro as well as in vivo, the results implicate the potential value in colorectal cancer gene therapy.
中国图书资料分类号 R?735.34
摘 要
目的 研究用表皮生长因子受体(EGFR)反义寡脱氧核苷酸(ASODN)抑制人大肠癌细胞株HR8348的生长增殖，探讨大肠癌治疗的新途径.
方法 人工合成的EGFR反义ODN及无关对照ODN经脂质体包裹后作用HR8348细胞，采用MTT法，[3H]-TdR掺入试验，细胞周期分析，裸鼠体内接种等方法测定细胞体内外增殖的变化.
, 百拇医药
结果 经EGFR反义ODN处理的HR8348细胞与对照组HR8348细胞相比，体外增殖速度减慢(细胞增殖抑制率达71%)、DNA合成受抑(细胞增殖指数为0.361 vs 0.784，S期细胞数为34.8% vs 59.9%)、裸鼠体内成瘤率下降(25% vs 100%).
结论 EGFR反义ODN可有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖，可用于实验性肿瘤基因治疗研究.
0 引言
大肠癌是严重威胁人类健康的常见肿瘤之一，但传统的治疗方法均未使大肠癌的五年生存率有明显改善[1]. 为此国内外学者试图寻找一种新的治疗方法来改变这一状况，目前研究的一个热点就是基因治疗. 研究报道表皮生长因子受体(EGFR)的某些生物学功能与肿瘤有密切关系，并证实在结肠癌中有表达增高[2]. 本实验室也在人大肠癌细胞株HR8348中检测出EGFR的表达增高. 因此，我们认为选择性阻抑EGFR的表达，对大肠癌细胞的生长增殖具有普遍的影响. 在本研究中我们选用阳离子脂质体Lipofectin[3]作为载体，利用人工合成的EGFR反义寡脱氧核苷酸(ODN)处理人大肠癌细胞株HR8348，获得了对大肠癌细胞体内外生长增殖的抑制，以期为今后大肠癌的基因治疗提供实验依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 人大肠癌细胞株HR8348来源于1例男性直肠腺癌患者的手术切除标本，由中国医学科学院肿瘤研究所提供. 培养在含100?mL/?L小牛血清的RPMI1640(GIBCO公司)培养液，37℃，50?mL/?L CO2的环境中.
1.2 EGFR反义 ODN的合成由第四军医大学生物化学教研室设计合成. EGFR反义ODN与EGFR cDNA的上游部位(包含起始密码)共计21个碱基互补，序列为：5＇-CGT CCC GGA GGG TCG CAT CGC-3＇. 另经计算机检索与EGFR cDNA无互补性的一段21个碱基的ODN作为寡核苷酸毒性对照，序列为：5＇-GGC CTC GGA TCC TGC TTT GCA-3＇. 以上ODN均用硫代磷酸修饰.
1.3 脂质体-ODN复合物的制备 阳离子脂质体lipofectin购自GIBCO-BRL公司，制备前将ODN稀释于0.1?mL无血清无抗生素的RPMI1640中，加入同样方法稀释的lipofectin，混匀，室温放置5min～10min，即可形成脂质体-ODN复合物并立即用于细胞处理. 脂质体与ODN用量参考说明书.
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1.4 细胞处理 用无血清无抗生素的RPMI1640稀释HR8348细胞，接种0.8?mL细胞(约1.5×106个)于35?mm培养皿. 将脂质体-ODN复合物(0.2?mL)加入培养皿，充分混匀，培养5?h后，添加4?mL含血清RPMI1640继续培养43?h. 而后收集细胞.
1.5 ODN对HR8348细胞生长增殖的影响 采用MTT法及[3H]-TdR掺入试验取对数生长期细胞用无血清无抗生素RPMI1640稀释，接种40?μL细胞(约1×104个)于96孔培养板，充分混合，培养5?h后，添加200?μL，含血清RPMI1640继续培养39?h. 而后吸弃上清，以RPMI1640清洗两遍，加入RPMI1640液200?μL， MTT(5?g/?L) 20?μL，37℃培养4?h后吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)200?μL，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490?nm波长处测其吸光值，每组复设3孔，取均值. 设空白对照、阴性对照各一组. 另一组96孔培养板中同上加入细胞及脂质体-ODN复合物，培养5?h后添加200?μL含血清RPMI1640继续培养19?h，向培养液中加入[3H]-TdR，培养24?h后按文献[4]进行测定.
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1.6 细胞周期动力学分析 将处理细胞经胰蛋白酶消化后，制成1×104/?L细胞悬液，碘化丙啶(PI)染色，FACScan流式细胞仪测定.
1.7 裸鼠致瘤能力实验 裸鼠11只分成实验组、空白组、阴性对照组，分别为4只、3只、4只，分别于皮下注射1×107细胞.
2 结果
2.1 ODN对HR8348细胞DNA合成及生长增殖的抑制 EGFR反义ODN能抑制HR8348细胞的DNA合成及生长增殖. 与空白对照组相比，肿瘤细胞生长增殖的抑制率约为71%，[3H]-TdR掺入试验的抑制率为73%. 而经无关对照ODN处理的阴性对照组对HR8348细胞的生长增殖以及DNA合成无显著抑制.
2.2 细胞周期分析 EGFR反义ODN作用于HR8348细胞后，细胞G0/?G1期细胞数明显增多，S期细胞数相应减少，而G2+M期细胞数亦明显的减少，而无关ODN组作用明显减弱，差异明显(表1).
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表1 不同处理HR8348细胞周期分析
组 别
G0/?G1
S
G2/?M
PI
HR8348(空白对照组)
21.6
59.9
18.5
0.784
无关ODN(阴性对照组)
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29.5
54.9
15.6
0.705
EGFR反义ODN(实验组)
55.9
34.8
9.3
0.361
2.3 裸鼠皮下移植瘤生长 空白对照组3只及阴性对照组4只所有接种部位均有移植瘤形成且肿瘤体积大，成瘤率为100%(3/?3,4/?4)，EGFR反义ODN处理4只，成瘤率低下(25%，1/?4)，且移植瘤生长缓慢，瘤体小.
, 百拇医药
3 讨论
随着分子生物学技术的发展和对癌基因，生长因子及生长因子受体研究的不断深入，人们逐渐认识到生长因子及其受体在介导细胞信号转导、促进细胞分裂和增殖转化中占有重要地位. 促瘤形成的自分泌和旁分泌机制的提出[5]，促进了肿瘤发生机制的深入研究. 有许多证据证明EGFR在肿瘤细胞的恶性增殖中起一定作用，在许多恶性肿瘤中都发现有EGFR的过度表达，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、大肠癌[6]及前列腺癌等，EGFR可与转化生长因子-α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)等配体结合而激活受体的酪氨酸酶活性，从而启动细胞有丝分裂，引起及诱导血管形成和肿瘤生长[7]. 已有实验证明，TGF-α可以通过自分泌机制在细胞的癌变中起一定作用，而EGFR在肿瘤细胞膜中存在过度表达，其在肿瘤发生和发展中起一定的作用.
本研究结果显示，EGFR反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的生长增殖和DNA合成均有抑制作用，经EGFR反义ODN处理后的肿瘤细胞的裸鼠体内致瘤能力明显下降，而经无关对照的ODN处理有的肿瘤细胞无此抑制作用，流式细胞仪的细胞周期分析结果也表明，EGFR反义ODN处理的肿瘤细胞生长明显被阻滞于G0/?G1期，增殖指数(Proliferation Index, PI)明显低于其他两组对照组，表明EGFR反义ODN可阻抑EGFR激活后所促发的细胞向S期过渡及由此导致的细胞过度增殖. EGFR反义ODN对EGFR表达的抑制机制可能为：①直接与EGFR的mRNA结合诱发内源性核酸酶对杂交体中RNA部分的水解；②封闭酶结合位点；③阻断前mRNA的剪切；④与双链DNA的某一段特异性结合，形成三螺旋结构[8].
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脂质体是由脂质双分子层组成的环形封闭囊泡，无毒无免疫原性，使用方便. 一些阳离子脂质更被认为有应用前景[9]，因为这些阳离子脂质体一方面可以通过离子吸附方式结合带阴离子的DNA，ODN分子，另一方面能与细胞作用，通过融合、内吞等方式将所携带的DNA或ODN分子送入细胞.
本实验观察了应用人工合成的EGFR反义ODN对人大肠癌细胞株HR8348的作用. 结果表明，EGFR反义ODN能抑制HR8348的细胞生长增殖和DNA合成，抑制了其在裸鼠体内形成肿瘤的能力. 本研究对大肠癌发生机制的探讨和大肠癌的基因治疗有一定的理论意义和潜在的应用价值.
4 参考文献
1 Abulafi AM, Willams NS. Local recurrence of colorectal cancer: the problem, mechanisms, management and adjuvant therapy. Br J Surg, 1994;81(1):7-19
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2 Steele RJC, Kelly P, Ellul B, Eremin O. Epidermal growth factor receptor expression in colorectal cancer. Br J Surg, 1990;77(12):1352-1354
3 Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Chan HW, Wenz M et al. Lipofectin: a highly efficient lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84(21):7413-7417
4 司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版公司，1996：193-194
5 Ciaradiello F, Bianco C, Normanno N, Baldassarre G, Pepe S, Tortora G et al. Infection with a transforming growth factor α anti-sense retroviral expression vector reduces the in vitro growth and transformation of a human colon cancer cell line. Int J Cancer, 1993;54(6):952-958
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6 Harris AL, Nicholson S, Sainsbury R, Wright C, Farndon J. Epidermal growth factor receptor and other oncogenes as prognostic marker. Natl Cancer Inst Monogr, 1992;11(2):181-187
7 Ekstrancl AJ, James CD, Cavenee WK, Seliger B, Pettersson RF et al. Genes for epidermal growth factor receptor, transforming growth factor, epidermal growth factor and their expression in human gliomas in vivo. Cancer Res, 1991;51(8):2164-2172
8 Mercola D, Cohen JS. Antisense approaches to cancer gene therapy. Cancer Gene Ther, 1995;21(1):47-51
9 Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, Tsai YJ, Border R et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem, 1994;269(4):2550-2561, 百拇医药