大肠肿瘤组织中人乳头状瘤病毒DNA的分子原位杂交研究*
作者：黄培林1 陆伦根2 史志英1 尹克铮1 张晓明1
单位：
关键词：大肠/病理学；肠肿瘤/病理学；肠肿瘤/遗传学；乳头〔状〕/瘤病毒/遗传学；脱氧核糖核酸，病毒
华人消化杂志980917 Detection of human papillomavirus DNA in colorectal neoplasms by in situ hybridization with digoxin labelled DNA probes*
HUANG Pei-Lin1, LU Lun-Gen2, SHI Zhi-Ying1, YIN Ke-Zheng1 and ZHANG Xiao-Ming1
, 百拇医药
1Department of Pathology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
2Department of Pathology, Yangzhou Medical College, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Subject headings intestines, large/pathology; intestinal neoplasms/genetics; intestinal neoplasms/pathology; papillomavirus/genetics; DNA, viral
Abstract
, http://www.100md.com
AIM To study the relationship between human papillomavirus (HPV) infection and the development of colorectal neoplasms.
METHODS Thirty adenomas and 40 adenocarcinomas were analysed in this study by using in situ hybridization with digoxin labelled HPV16 and 18 DNA probes respectively.
RESULTS HPV DNA was detected in 8 (27%) of 30 adenomas and in 19 (48%) of 40 adenocarcinomas. The expression of HPV DNA in adenomas and adenocarcinomas was significantly different (χ2=3.14,P<0.05). There was no correlation, however, between HPV and the location, Dukes＇ stage, differentiation of colorectal adenocarcinomas.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The presence and typing of HPV DNA in colorectal neoplasms may be studied by in situ hybridization and there is a close association between colorectal adenocarcinomas and HPV16, 18 infection.
中国图书资料分类号 R?735.340.21
摘 要
目的 探讨HPV16和HPV18感染与大肠肿瘤发生的关系.
方法 采用地高辛标记的HPV16和HPV18 DNA探针分别在40例大肠癌和30例大肠腺瘤组织石蜡切片上进行原位杂交探测HPV DNA.
, 百拇医药 结果 受检大肠腺瘤组织HPV DNA阳性8例(27%)，其中HPV16 DNA 5例，HPV18 DNA 3例，主要见于管状绒毛状腺瘤和绒毛状腺瘤；大肠腺癌组织中HPV DNA阳性19例(48%)，其中HPV16 DNA 14例，HPV18 DNA 5例. HPV DNA主要见于肿瘤细胞核中，少部分见于胞质中. 研究表明，大肠癌组织中HPV16，18 DNA检出阳性率明显高于大肠腺瘤；且大肠绒毛状腺瘤中HPV DNA阳性率明显高于管状腺瘤，阳性率接近高分化腺癌.
结论 HPV16，18型感染并整合至宿主细胞DNA中与肠癌的发生有密切的关系.
0 引言
人乳头状瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染与生殖系肿瘤的发生发展有关. 近年报道，在非生殖系上皮起源的癌肿组织中可检出HPV16，18.
DNA，如口腔、食管、咽、肺、皮肤等部位癌肿[1-3]，认为HPV-DNA不但可感染鳞状上皮组织，而且也可感染柱状上皮组织. 我们应用地高辛(digoxin, Dig)标记的HPV16，18DNA探针对大肠良性腺瘤和腺癌组织进行分子原位杂交，研究HPV16，18DNA在大肠肿瘤组织的存在和分布，以探讨HPV感染与肠道肿瘤发生关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 大肠肿瘤手术标本70例，其中肠腺瘤30例，肠癌40例，标本经100?mL/?L福尔马林固定后，石蜡包埋切片.
1.2 方法 探针制备：HPV16，18重组质粒均克隆于pBS322的ECORI位点，重组质粒扩增后，经碱变性法提取质粒DNA，按Boehringer Mannheim公司随机引物标记试剂盒的方法将探针标记上Dig-11-dUTP. 原位杂交：切片脱蜡水化后，0.2?mol/?L HCl 20min， pronase E (0.2?g/?L) 10min 37℃， 2?g/?L甘氨酸-PBS 5min 2次，40?mL/?L多聚甲醛-PBS 30min，逐级酒精脱水后，每片滴加20?L变性后的杂交液(HPV DNA探针浓度2?mg/?L)，盖上硅化的盖玻片，95℃变性10min，速冷3min后于37℃过夜. 去盖玻片，500?mg/?L甲酰胺，2×SSC 15min 42℃，逐级2×SSC，1×SSC， 0.5×SSC冲洗后，加入AP-anti Dig室温2?h，用NBT-BCTP混合液暗处显色4?h～8?h，中止反应，苏木素复染封片观察. 蓝紫色产物为核酸杂交信号. 阴性对照：①杂交液中不含Dig标记的HPV DNA探针；②切片后不加任何液体，直接用NBT-BCTP系统显色；③杂交后不加AP-anti Dig；④正常大肠粘膜组织. 阳性对照：多次重复试验，结果均为阳性，且用DNA酶I消化后，杂交信号减弱和消失. 10例正常大肠粘膜组织，30例大肠腺瘤组织，40例大肠癌组织，均分别用Dig标记HPV16，18DNA探针行原位杂交.
, 百拇医药
2 结果
正常大肠粘膜组织10例均为阴性. 大肠肿瘤组织中HPV16，18DNA杂交，结果显示，HPV16，18DNA阳性率在大肠腺瘤中为27%，其中管状腺瘤HPV16，18DNA阳性检出率为12.5%.管状绒毛腺瘤为30%，绒毛腺瘤33%，在绒毛状腺瘤中HPV DNA阳性检出率以HPV16为主(60%)；HPV16，18DNA在肠腺癌中为48%. 经统计学处理，差异显著(χ2=3.14，P<0.05).
在15例高分化腺癌中，HPV DNA阳性5例(33%)，其中HPV16DNA 4例，HPV18DNA 1例，16例中分化腺癌中，HPV DNA阳性9例(56%)，其中HPV16DNA 6例，HPV18DNA 3例；9例低分化腺癌中，HPV DNA阳性5例(55%)，其中HPV16DNA 4例，HPV18DNA 1例. 在我们实验中，HPV16DNA阳性率明显高于HPV18DNA阳性率(χ2=5.59，P<0.01).
, 百拇医药
HPV16，18DNA阳性率与癌组织的分化程度、分级及Dukes分期、性别、年龄等因素均无显著差异. HPV16，18DNA的杂交产物呈灶性或弥漫性分布，主要见于细胞核内，有时可见于胞质内. 肿瘤间质未见阳性产物(图1，2).
图1 大肠腺癌组织中HPV16DNA阳性. 苏木素复染 ×400
图2 大肠腺癌组织中HPV18DNA阳性. 苏木素复染 ×400
3 讨论
HPV能够诱发良性肿瘤，癌前病变及上皮组织恶性肿瘤的发生. 近年研究证实，HPV6，11型最常见于宫颈、外阴、肛门及阴茎的尖锐湿疣和宫颈上皮内肿瘤，而HPV16，18型与宫颈癌的发生关系密切[1]. 随着人们发现HPV16，18DNA在某些非生殖系上皮起源的癌肿中，认为HPV16，18DNA不仅可感染鳞状上皮，还可感染柱状上皮细胞[2，3]. Cheng et al[4，5]应用印迹杂交技术在人结肠癌细胞系(CC-M1, CC-M2，CC-M3)的DNA中发现有HPV16，18DNA的整合，认为HPV DNA可能参与肠癌的发生. 我们的研究结果表明，人大肠肿瘤细胞的DNA中确有HPV16，18DNA的整合. HPV16，18DNA阳性率在腺瘤中为27%；腺癌48%，与Danial et al[6]结果相近.
, 百拇医药
Cooper et al[7]认为，HPV DNA仅存在于感染的细胞核中. 根据阳性物质在核中的不同形态分为3型. Ⅰ型：游离型HPV DNA，阳性物质弥漫地出现于整个核中；Ⅱ型：整合型HPV DNA，阳性物质呈点状分布；Ⅲ型具有Ⅰ型和Ⅱ型的特点. 在本实验中，HPV DNA阳性的肿瘤细胞核中的阳性物质弥漫分布于核中，且染色较深，未见阳性物质呈点状分布. 因此，很难确定核中的HPV DNA是游离的还是整合的.
至于一些细胞核和胞质中均有阳性物质，这可能系HPV DNA的转录产物HPV mRNA的存在，提示HPV感染可能是从胞核到胞质或者从胞核开始.
肿瘤的发生、发展是多因素引起癌基因激活和抑癌基因失活所致. 有文献报道，HPV DNA感染并整合至宿主细胞的基因组中，其整合部位靠近C-myc基因位点附近，近而使C-myc基因激活、扩增[1]. Cheng et al[5]报道HPV16DNA转染NIH3T3细胞，诱导其恶变. Chen et al[8]发现：HPV诱导的宫颈永生化细胞中有p53基因突变，认为HPV DNA经插入方式整合到人染色体的某一位点，致p53基因突变，参与肿瘤的发生. 我们的研究结果发现，大肠绒毛状腺瘤的HPV16，18阳性率33%，较管状腺瘤(12.5%)为高，阳性率接近高分化腺癌(33%). 提示HPV16，18可能启动大肠粘膜柱状上皮的恶变，确切的分子机制尚需进一步探究.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Durst M, Corce CM, Gissmann L, Schwarz E, Huebner K. Papillomavirus sequence integrate near cellular oncogenes in some cervical carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84(4):1070-1074
2 Chang F, Syrjanen S, Wang L, Syrjanen K. Infections agents in the etiology of esophageal cancer. Gastroenterology, 1992;103(4):1336-1348
3 管翼平，胡益去，陈乐真，吕亚利. 肺癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18(1)：27-29
, http://www.100md.com
4 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus type-related DNA and C-myc concogene alteration in colon cancer cell lines. Dis Colon Rectum, 1991;34(3):469-474
5 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus 16DNA in NIH3T3 cells transformed by colon cancer cell lines. Gut, 1993;34(8):1710-1713
6 Daniel K, Pacita M, Mark H, Byron M. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg, 1990;125(6):862-865
, 百拇医药
7 Cooper K, Herrington CS, Lo ESF, Evans MF, McGee JO. Integration of human papillomavirus type 16 in cervical adenocarcinoma. J Clin Pathol, 1992;45(5):382-385
8 Chen TM, Chen CA, Hsieh CY, Chang DY, Chen YH, Defend V. The state of p53 primary human cervical carcinoma and its effects in human papillomavirus immortalized human cervical cells. Oncogene, 1993;8(6):1511-1518, 百拇医药(黄培林1 陆伦根2 史志英1 尹克铮1 张晓明1)
单位：
关键词：大肠/病理学；肠肿瘤/病理学；肠肿瘤/遗传学；乳头〔状〕/瘤病毒/遗传学；脱氧核糖核酸，病毒
华人消化杂志980917 Detection of human papillomavirus DNA in colorectal neoplasms by in situ hybridization with digoxin labelled DNA probes*
HUANG Pei-Lin1, LU Lun-Gen2, SHI Zhi-Ying1, YIN Ke-Zheng1 and ZHANG Xiao-Ming1
, 百拇医药
1Department of Pathology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
2Department of Pathology, Yangzhou Medical College, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Subject headings intestines, large/pathology; intestinal neoplasms/genetics; intestinal neoplasms/pathology; papillomavirus/genetics; DNA, viral
Abstract
, http://www.100md.com
AIM To study the relationship between human papillomavirus (HPV) infection and the development of colorectal neoplasms.
METHODS Thirty adenomas and 40 adenocarcinomas were analysed in this study by using in situ hybridization with digoxin labelled HPV16 and 18 DNA probes respectively.
RESULTS HPV DNA was detected in 8 (27%) of 30 adenomas and in 19 (48%) of 40 adenocarcinomas. The expression of HPV DNA in adenomas and adenocarcinomas was significantly different (χ2=3.14,P<0.05). There was no correlation, however, between HPV and the location, Dukes＇ stage, differentiation of colorectal adenocarcinomas.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The presence and typing of HPV DNA in colorectal neoplasms may be studied by in situ hybridization and there is a close association between colorectal adenocarcinomas and HPV16, 18 infection.
中国图书资料分类号 R?735.340.21
摘 要
目的 探讨HPV16和HPV18感染与大肠肿瘤发生的关系.
方法 采用地高辛标记的HPV16和HPV18 DNA探针分别在40例大肠癌和30例大肠腺瘤组织石蜡切片上进行原位杂交探测HPV DNA.
, 百拇医药 结果 受检大肠腺瘤组织HPV DNA阳性8例(27%)，其中HPV16 DNA 5例，HPV18 DNA 3例，主要见于管状绒毛状腺瘤和绒毛状腺瘤；大肠腺癌组织中HPV DNA阳性19例(48%)，其中HPV16 DNA 14例，HPV18 DNA 5例. HPV DNA主要见于肿瘤细胞核中，少部分见于胞质中. 研究表明，大肠癌组织中HPV16，18 DNA检出阳性率明显高于大肠腺瘤；且大肠绒毛状腺瘤中HPV DNA阳性率明显高于管状腺瘤，阳性率接近高分化腺癌.
结论 HPV16，18型感染并整合至宿主细胞DNA中与肠癌的发生有密切的关系.
0 引言
人乳头状瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染与生殖系肿瘤的发生发展有关. 近年报道，在非生殖系上皮起源的癌肿组织中可检出HPV16，18.
DNA，如口腔、食管、咽、肺、皮肤等部位癌肿[1-3]，认为HPV-DNA不但可感染鳞状上皮组织，而且也可感染柱状上皮组织. 我们应用地高辛(digoxin, Dig)标记的HPV16，18DNA探针对大肠良性腺瘤和腺癌组织进行分子原位杂交，研究HPV16，18DNA在大肠肿瘤组织的存在和分布，以探讨HPV感染与肠道肿瘤发生关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 大肠肿瘤手术标本70例，其中肠腺瘤30例，肠癌40例，标本经100?mL/?L福尔马林固定后，石蜡包埋切片.
1.2 方法 探针制备：HPV16，18重组质粒均克隆于pBS322的ECORI位点，重组质粒扩增后，经碱变性法提取质粒DNA，按Boehringer Mannheim公司随机引物标记试剂盒的方法将探针标记上Dig-11-dUTP. 原位杂交：切片脱蜡水化后，0.2?mol/?L HCl 20min， pronase E (0.2?g/?L) 10min 37℃， 2?g/?L甘氨酸-PBS 5min 2次，40?mL/?L多聚甲醛-PBS 30min，逐级酒精脱水后，每片滴加20?L变性后的杂交液(HPV DNA探针浓度2?mg/?L)，盖上硅化的盖玻片，95℃变性10min，速冷3min后于37℃过夜. 去盖玻片，500?mg/?L甲酰胺，2×SSC 15min 42℃，逐级2×SSC，1×SSC， 0.5×SSC冲洗后，加入AP-anti Dig室温2?h，用NBT-BCTP混合液暗处显色4?h～8?h，中止反应，苏木素复染封片观察. 蓝紫色产物为核酸杂交信号. 阴性对照：①杂交液中不含Dig标记的HPV DNA探针；②切片后不加任何液体，直接用NBT-BCTP系统显色；③杂交后不加AP-anti Dig；④正常大肠粘膜组织. 阳性对照：多次重复试验，结果均为阳性，且用DNA酶I消化后，杂交信号减弱和消失. 10例正常大肠粘膜组织，30例大肠腺瘤组织，40例大肠癌组织，均分别用Dig标记HPV16，18DNA探针行原位杂交.
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2 结果
正常大肠粘膜组织10例均为阴性. 大肠肿瘤组织中HPV16，18DNA杂交，结果显示，HPV16，18DNA阳性率在大肠腺瘤中为27%，其中管状腺瘤HPV16，18DNA阳性检出率为12.5%.管状绒毛腺瘤为30%，绒毛腺瘤33%，在绒毛状腺瘤中HPV DNA阳性检出率以HPV16为主(60%)；HPV16，18DNA在肠腺癌中为48%. 经统计学处理，差异显著(χ2=3.14，P<0.05).
在15例高分化腺癌中，HPV DNA阳性5例(33%)，其中HPV16DNA 4例，HPV18DNA 1例，16例中分化腺癌中，HPV DNA阳性9例(56%)，其中HPV16DNA 6例，HPV18DNA 3例；9例低分化腺癌中，HPV DNA阳性5例(55%)，其中HPV16DNA 4例，HPV18DNA 1例. 在我们实验中，HPV16DNA阳性率明显高于HPV18DNA阳性率(χ2=5.59，P<0.01).
, 百拇医药
HPV16，18DNA阳性率与癌组织的分化程度、分级及Dukes分期、性别、年龄等因素均无显著差异. HPV16，18DNA的杂交产物呈灶性或弥漫性分布，主要见于细胞核内，有时可见于胞质内. 肿瘤间质未见阳性产物(图1，2).
图1 大肠腺癌组织中HPV16DNA阳性. 苏木素复染 ×400
图2 大肠腺癌组织中HPV18DNA阳性. 苏木素复染 ×400
3 讨论
HPV能够诱发良性肿瘤，癌前病变及上皮组织恶性肿瘤的发生. 近年研究证实，HPV6，11型最常见于宫颈、外阴、肛门及阴茎的尖锐湿疣和宫颈上皮内肿瘤，而HPV16，18型与宫颈癌的发生关系密切[1]. 随着人们发现HPV16，18DNA在某些非生殖系上皮起源的癌肿中，认为HPV16，18DNA不仅可感染鳞状上皮，还可感染柱状上皮细胞[2，3]. Cheng et al[4，5]应用印迹杂交技术在人结肠癌细胞系(CC-M1, CC-M2，CC-M3)的DNA中发现有HPV16，18DNA的整合，认为HPV DNA可能参与肠癌的发生. 我们的研究结果表明，人大肠肿瘤细胞的DNA中确有HPV16，18DNA的整合. HPV16，18DNA阳性率在腺瘤中为27%；腺癌48%，与Danial et al[6]结果相近.
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Cooper et al[7]认为，HPV DNA仅存在于感染的细胞核中. 根据阳性物质在核中的不同形态分为3型. Ⅰ型：游离型HPV DNA，阳性物质弥漫地出现于整个核中；Ⅱ型：整合型HPV DNA，阳性物质呈点状分布；Ⅲ型具有Ⅰ型和Ⅱ型的特点. 在本实验中，HPV DNA阳性的肿瘤细胞核中的阳性物质弥漫分布于核中，且染色较深，未见阳性物质呈点状分布. 因此，很难确定核中的HPV DNA是游离的还是整合的.
至于一些细胞核和胞质中均有阳性物质，这可能系HPV DNA的转录产物HPV mRNA的存在，提示HPV感染可能是从胞核到胞质或者从胞核开始.
肿瘤的发生、发展是多因素引起癌基因激活和抑癌基因失活所致. 有文献报道，HPV DNA感染并整合至宿主细胞的基因组中，其整合部位靠近C-myc基因位点附近，近而使C-myc基因激活、扩增[1]. Cheng et al[5]报道HPV16DNA转染NIH3T3细胞，诱导其恶变. Chen et al[8]发现：HPV诱导的宫颈永生化细胞中有p53基因突变，认为HPV DNA经插入方式整合到人染色体的某一位点，致p53基因突变，参与肿瘤的发生. 我们的研究结果发现，大肠绒毛状腺瘤的HPV16，18阳性率33%，较管状腺瘤(12.5%)为高，阳性率接近高分化腺癌(33%). 提示HPV16，18可能启动大肠粘膜柱状上皮的恶变，确切的分子机制尚需进一步探究.
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4 参考文献
1 Durst M, Corce CM, Gissmann L, Schwarz E, Huebner K. Papillomavirus sequence integrate near cellular oncogenes in some cervical carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84(4):1070-1074
2 Chang F, Syrjanen S, Wang L, Syrjanen K. Infections agents in the etiology of esophageal cancer. Gastroenterology, 1992;103(4):1336-1348
3 管翼平，胡益去，陈乐真，吕亚利. 肺癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18(1)：27-29
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4 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus type-related DNA and C-myc concogene alteration in colon cancer cell lines. Dis Colon Rectum, 1991;34(3):469-474
5 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus 16DNA in NIH3T3 cells transformed by colon cancer cell lines. Gut, 1993;34(8):1710-1713
6 Daniel K, Pacita M, Mark H, Byron M. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg, 1990;125(6):862-865
, 百拇医药
7 Cooper K, Herrington CS, Lo ESF, Evans MF, McGee JO. Integration of human papillomavirus type 16 in cervical adenocarcinoma. J Clin Pathol, 1992;45(5):382-385
8 Chen TM, Chen CA, Hsieh CY, Chang DY, Chen YH, Defend V. The state of p53 primary human cervical carcinoma and its effects in human papillomavirus immortalized human cervical cells. Oncogene, 1993;8(6):1511-1518, 百拇医药(黄培林1 陆伦根2 史志英1 尹克铮1 张晓明1)