CD44V6 mRNA在大肠癌组织及大肠癌细胞株中的表达
作者：郭君其 丁彦青 李祖国 周晓丹
单位：510515 广州，第一军医大学病理学教研室(郭君其、丁彦青、李祖国)；中国人民解放军第二八一医院(周晓丹)
关键词：
中华医学杂志/981013 CD44V6是肿瘤转移的相关受体之一，其基因可能是一种肿瘤转移相关基因，但与人类大肠癌转移的关系尚不明确[1]，我们采用敏感、特异的原位逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)间接法，检测人类大肠癌组织及大肠癌细胞株中CD44 V6mRNA的表达，以探讨其与肿瘤转移的关系。
一、材料和方法
1.标本来源：大肠癌细胞株：HT29和LoVo细胞系。大肠癌冰冻组织：来自本校南方医院，其中转移癌患者的转移癌灶和原发灶18例，无转移患者的癌灶18例，大肠癌患者癌灶远端的正常粘膜组织15例。
, 百拇医药
2.仪器：原位PCR仪及原位PCR板。
3.原位RT-PCR：(1) 寡核苷酸引物：CD44基因的cDNA引物：P1：5′-GACACATATTGCTTCAATGCTICAGC-3′；P2：5′-GATGCCAAGATGATCAGCCTTICTGG AAT-3′。(2) CD44 V6 mRNA的D3探针：5′-TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3′。(3) CD44 cDNA的逆转录合成和原位PCR扩增。(4) 扩增后标本的原位杂交。(5) 用不含探针的杂交液的杂交标本作阴性对照。(6) 结果判断采用阳性记分法：在显微镜下随机记数300个HT29和LoVo细胞，组织切片按不同来源组织的染色强度划分，结果按公式：细胞系内CD44V6mRNA表达积分=(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3，公式中：+为胞浆内有稀疏蓝色颗粒的细胞数；
++为胞浆内有细小蓝色颗粒的细胞数；+++为胞浆内有明显致密蓝色颗粒的细胞数。
, 百拇医药
3.统计学处理：秩和检验。
二、结果
癌转移灶、转移原发灶、无转移原发灶及远端正常粘膜着色程度的阳性记分结果见附表。所设阴性对照组均无显色。经统计学处理，阳性积分在癌转移灶、有转移原发灶与正常粘膜比较，P<0.01；转移灶与无转移原发灶比较，P<0.01；未转移原发灶与正常粘膜比较，P<0.05；而其余各组两两比较均P>0.05。
附表 大肠癌组织阳性记分结果(例数) 组别
例数
染色情况
-
+
++
, 百拇医药
+++
转移灶
18
0
1
1
16
有转移原发灶
18
1
2
3
12
无转移原发灶
, 百拇医药
18
1
5
10
2
正常粘膜
15
11
4
0
0
光镜下见紫蓝色颗粒分布在胞浆内，细胞核内几乎见不到显色。阴性对照组内均无染色，CD44 V6mRNA表达积分比为HT29细胞：LoVo细胞=1.21∶2.98，两者积分比较差异有显著意义。
, 百拇医药
三、讨论
原位RT-PCR间接法,结合了原位杂交定位性和PCR扩增的敏感性的优点，扩增后产物经地高辛标记探针检测显色后，可以从镜下直接观察到mRNA的表达情况，本方法可以避免体细胞DNA的扩增。镜下见紫蓝色颗粒分布于胞浆内，而非细胞核内，确定了扩增产物是mRNA，用V6特异性cDNA探针检测，肯定了检出物是CD44V6mRNA的表达，而用RT-PCR扩增后杂交，难以排除组织内其他细胞的mRNA或DNA扩增，也可避免原位杂交检测低拷贝或单拷贝mRNA时出现的假阴性。
Wielenga等[2]认为，含V6序列的不同的CD44表达大部分限于肿瘤发展后期，V6在转移的结肠癌比不转移的肿瘤表达更多，密度更大。Rodrignez等[3]认为，参与转移有关的CD44变异体普遍存在结肠癌中，V6变异体的表达与结肠肿瘤远处转移有关。亦有学者认为V5外显子的表达是结肠癌早期的标志，而V6外显子在肿瘤的浸润中有增强的高频率的表达。本实验证实在人大肠癌细胞中高转移能力的LoVo细胞内CD44V6mRNA的表达明显高于低转移能力的HT29细胞, 提示了CD44V6mRNA的表达与转移能力呈正相关。在人大肠癌组织中研究显示，有肝转移及淋巴结转移的癌灶在显色时间和着色程度上与无转移的癌灶及正常肠粘膜比差异均有显著意义，有转移的大肠癌原发灶与正常粘膜比差异也有显著意义，提示有肝及淋巴结转移的大肠癌组织内CD44V6mRNA的表达明显增高，与人大肠癌细胞株表达情况相似，说明CD44V6mRNA的表达在参与大肠癌细胞的转移中起了重要作用。
, 百拇医药
本课题为军队“九五”重点攻关基金资助项目
参考文献
1 郭君其，丁彦青(综述).CD44基因表达与结肠癌的研究进展.国外医学肿瘤学分册，1997，24：92-94.
2 Wielenga VJ, Heider KH, Offerhaus GJ, et al. Expression of CD44 vaint proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res, 1993，53：6754-6756.
3 Rodriguez C, Monges G, Rouanet P, et al. CD44 expression patterns in breast and colon tumors: a PCR-based study of splice variants.Int J Cancer, 1995, 64：347-354.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-04-10)
(本文编辑：刘小梅), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学病理学教研室(郭君其、丁彦青、李祖国)；中国人民解放军第二八一医院(周晓丹)
关键词：
中华医学杂志/981013 CD44V6是肿瘤转移的相关受体之一，其基因可能是一种肿瘤转移相关基因，但与人类大肠癌转移的关系尚不明确[1]，我们采用敏感、特异的原位逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)间接法，检测人类大肠癌组织及大肠癌细胞株中CD44 V6mRNA的表达，以探讨其与肿瘤转移的关系。
一、材料和方法
1.标本来源：大肠癌细胞株：HT29和LoVo细胞系。大肠癌冰冻组织：来自本校南方医院，其中转移癌患者的转移癌灶和原发灶18例，无转移患者的癌灶18例，大肠癌患者癌灶远端的正常粘膜组织15例。
, 百拇医药
2.仪器：原位PCR仪及原位PCR板。
3.原位RT-PCR：(1) 寡核苷酸引物：CD44基因的cDNA引物：P1：5′-GACACATATTGCTTCAATGCTICAGC-3′；P2：5′-GATGCCAAGATGATCAGCCTTICTGG AAT-3′。(2) CD44 V6 mRNA的D3探针：5′-TGAGATTGGGTTGAAGAAATC-3′。(3) CD44 cDNA的逆转录合成和原位PCR扩增。(4) 扩增后标本的原位杂交。(5) 用不含探针的杂交液的杂交标本作阴性对照。(6) 结果判断采用阳性记分法：在显微镜下随机记数300个HT29和LoVo细胞，组织切片按不同来源组织的染色强度划分，结果按公式：细胞系内CD44V6mRNA表达积分=(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3，公式中：+为胞浆内有稀疏蓝色颗粒的细胞数；
++为胞浆内有细小蓝色颗粒的细胞数；+++为胞浆内有明显致密蓝色颗粒的细胞数。
, 百拇医药
3.统计学处理：秩和检验。
二、结果
癌转移灶、转移原发灶、无转移原发灶及远端正常粘膜着色程度的阳性记分结果见附表。所设阴性对照组均无显色。经统计学处理，阳性积分在癌转移灶、有转移原发灶与正常粘膜比较，P<0.01；转移灶与无转移原发灶比较，P<0.01；未转移原发灶与正常粘膜比较，P<0.05；而其余各组两两比较均P>0.05。
附表 大肠癌组织阳性记分结果(例数) 组别
例数
染色情况
-
+
++
, 百拇医药
+++
转移灶
18
0
1
1
16
有转移原发灶
18
1
2
3
12
无转移原发灶
, 百拇医药
18
1
5
10
2
正常粘膜
15
11
4
0
0
光镜下见紫蓝色颗粒分布在胞浆内，细胞核内几乎见不到显色。阴性对照组内均无染色，CD44 V6mRNA表达积分比为HT29细胞：LoVo细胞=1.21∶2.98，两者积分比较差异有显著意义。
, 百拇医药
三、讨论
原位RT-PCR间接法,结合了原位杂交定位性和PCR扩增的敏感性的优点，扩增后产物经地高辛标记探针检测显色后，可以从镜下直接观察到mRNA的表达情况，本方法可以避免体细胞DNA的扩增。镜下见紫蓝色颗粒分布于胞浆内，而非细胞核内，确定了扩增产物是mRNA，用V6特异性cDNA探针检测，肯定了检出物是CD44V6mRNA的表达，而用RT-PCR扩增后杂交，难以排除组织内其他细胞的mRNA或DNA扩增，也可避免原位杂交检测低拷贝或单拷贝mRNA时出现的假阴性。
Wielenga等[2]认为，含V6序列的不同的CD44表达大部分限于肿瘤发展后期，V6在转移的结肠癌比不转移的肿瘤表达更多，密度更大。Rodrignez等[3]认为，参与转移有关的CD44变异体普遍存在结肠癌中，V6变异体的表达与结肠肿瘤远处转移有关。亦有学者认为V5外显子的表达是结肠癌早期的标志，而V6外显子在肿瘤的浸润中有增强的高频率的表达。本实验证实在人大肠癌细胞中高转移能力的LoVo细胞内CD44V6mRNA的表达明显高于低转移能力的HT29细胞, 提示了CD44V6mRNA的表达与转移能力呈正相关。在人大肠癌组织中研究显示，有肝转移及淋巴结转移的癌灶在显色时间和着色程度上与无转移的癌灶及正常肠粘膜比差异均有显著意义，有转移的大肠癌原发灶与正常粘膜比差异也有显著意义，提示有肝及淋巴结转移的大肠癌组织内CD44V6mRNA的表达明显增高，与人大肠癌细胞株表达情况相似，说明CD44V6mRNA的表达在参与大肠癌细胞的转移中起了重要作用。
, 百拇医药
本课题为军队“九五”重点攻关基金资助项目
参考文献
1 郭君其，丁彦青(综述).CD44基因表达与结肠癌的研究进展.国外医学肿瘤学分册，1997，24：92-94.
2 Wielenga VJ, Heider KH, Offerhaus GJ, et al. Expression of CD44 vaint proteins in human colorectal cancer is related to tumor progression. Cancer Res, 1993，53：6754-6756.
3 Rodriguez C, Monges G, Rouanet P, et al. CD44 expression patterns in breast and colon tumors: a PCR-based study of splice variants.Int J Cancer, 1995, 64：347-354.
(收稿：1997-07-28 修回：1998-04-10)
(本文编辑：刘小梅), 百拇医药