游离脂肪酸对大鼠肝脏和骨骼肌细胞PTP1B蛋白表达的影响
作者：邵建华 高妍 袁振芳 冯琦
单位：100034 北京医科大学第一医院内分泌科
关键词：脂肪酸类，非酯化；受体，胰岛素
中华医学杂志/981009 【摘要】 目的 研究游离脂肪酸对大鼠肝脏和骨骼肌细胞酪氨酸磷酸酶蛋白量的影响，以探讨游离脂肪酸在肥胖诱发的胰岛素抵抗中的作用机理。方法 分离培养Wistar大鼠肝脏和骨骼肌细胞，分别与软脂酸(0.25 mmol/L)或油酸(0.125 mmol/L)共同孵育6～24小时，应用Western杂交方法检测SH-PTP2和PTP1B的蛋白水平。结果 肝脏和骨骼肌细胞的PTP1B蛋白量显著增高(P<0.05)，以24小时为著；SH-PTP2蛋白量无改变(P>0.05)。结论 游离脂肪酸促进大鼠肝脏和骨骼肌细胞PTP1B表达，提示游离脂肪酸可能通过增高PTP1B蛋白量抑制胰岛素信号传导诱发胰岛素抵抗。
, 百拇医药
Free fatty acids Promoting PTP1B expression in rat skeletal muscle and hepatic cells
Shao Jianhua, Gao Yan, Yuan Zhenfang，et al. Department of Endocrinology, First Teaching Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To determine whether that free fatty acids (FFAs) impair glucose metabolism is associated with altered insulin signaling system. Methods After skeletal muscle and hepatic cells were incubated with palmitate (0.25mmol/L) or oleate (0.125mmol/L) for 6, 12 or 24 hours, the protein abundance of SH-PTP2 and PTP1B was assessed by western blot. Results SH-PTP2 protein levels showed no significant change in both fatty acids treated muscle and hepatic cells at all time points. The PTP1B was significantly elevated in both liver and muscle cells incubated with FFAs at 6, 12 and 24 hours. Conclusions FFAs promote the expression of PTP1B in rat skeletal muscle and liver cells, and the elevated PTP1B may mediate the insulin resistance induced by FFAs.
, 百拇医药
【Key words】 Fatty acids, nonesterified Receptors, insulin
(Natl Med J China, 1998, 78：753-755)
游离脂肪酸是否影响PTP1B和SH-PTP2的表达，是否通过改变其蛋白水平影响胰岛素信号传导目前尚不明确。为此，我们利用体外培养大鼠肝脏和骨骼肌细胞，研究了高浓度游离脂肪酸对PTP1B和SH-PTP2蛋白水平的影响
材料与方法
1.材料：软脂酸、油酸、Aprotinie、胶原酶和胰蛋白酶为美国Sigma产品。DMEM和199细胞培养粉购自美国GIBCO公司。胎牛血清为中国医学科学院血液研究所产品。ECL-化学发光试剂盒为英国Amersham公司产品。抗体购自美国Santa Cruz公司。
, 百拇医药
2.方法：(1) 细胞培养：肝脏细胞原代培养：200 g Wistar大鼠肌注戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，消毒后在超净台内打开腹腔，经门静脉和下腔静脉插管。先用Hank′s液开放灌注5分钟，肝脏呈灰白色，改用0.05%胶原酶灌注，流速为4～5ml/min，10分钟后取下肝脏，去掉肝脏被膜并收集细胞和组织块，用80目筛网过滤，37 ℃ Hank′s液洗涤细胞3次。DMEM培养液悬浮细胞，用台盼蓝染色法测定细胞活率、计数。按每皿(直径为6厘米)3×105个细胞种入细胞培养皿内，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。(2)骨骼肌细胞原代培养：处死出生1天的Wistar大鼠，取后肢骨骼肌，切碎后用37 ℃的消化液(0.05%胶原酶和0.25%的胰蛋白酶)消化2次，每次15分钟。收集细胞后用Hank′s液洗2次。199细胞培养液(10%胎牛血清)悬浮细胞，接种入细胞培养皿。37 ℃培养12小时后收集未贴壁细胞并计数，按每皿5×105个细胞种入用鼠尾胶原
附表 软脂酸和油酸对大鼠肝脏和骨骼肌细胞SH-PTP2和PTP1B水平的影响(A，
±s) 组织
, 百拇医药
鼠数
时间
(h)
SH-PTP2
PTP1B
软脂酸
油酸
软脂酸
油酸
0
0.96±0.03
0.85±0.02
0.26±0.03
, 百拇医药
0.35±0.01
肝脏
9
6
0.87±0.05
0.82±0.03
0.47±0.04*
0.52±0.03*
12
0.90±0.06
0.86±0.01
0.60±0.03*
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0.64±0.02*
24
1.02±0.04
0.91±0.02
0.72±0.02**
0.71±0.05**
0
0.88±0.02
0.92±0.03
0.23±0.02
0.22±0.01
, 百拇医药
骨骼肌
9
6
0.94±0.04
0.93±0.03
0.35±0.01*
0.37±0.02*
12
0.85±0.01
0.87±0.05
0.54±0.02*
, 百拇医药 0.56±0.02*
24
0.82±0.02
0.89±0.04
0.52±0.03**
0.59±0.03**
注：与0小时相比，* P<0.05，与6小时相比，**P<0.05，(A)吸光度
涂布的细胞培养皿(直径为6 cm)，37 ℃培养。待细胞生长并融合，出现自主收缩时开始如下实验：加入游离脂肪酸，吸出原培养液，分别加入含0.25 mmol软脂酸或0.125 mmol油酸的DMED或199培养液，分别培养6、12和24小时。同时设立空白对照。裂解细胞后提取蛋白，用BioRad微量蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。(3)SH-PTP2和PTP1B蛋白水平检测[1]：取各样本50 μg总蛋白，混入含100 mmol DTT的Laemmli上样Buffer，煮沸3分钟。7.5%(SH-PTP2)或10%(PTP1B)的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移法使蛋白转移至硝酸纤维膜上，封膜后加入抗SH-PTP2(1：2 000)或抗PTP1B抗体(1：2 000)。4℃轻摇过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2 000)，室温轻摇1小时。增强化学发光法显象暴光。应用激光扫描仪测定各条带光密度。
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3.统计学处理：结果以±s表示，应用方差分析、q检验以及直线相关进行统计学处理。结果
1.软脂酸和油酸对肝脏和骨骼肌细胞SH-PTP2蛋白水平的影响(附表)。
2.软脂酸或油酸对肝脏和骨骼肌细胞PTP1B蛋白水平的影响：肝脏和骨骼肌细胞与软脂酸共同孵育6小时后，PTP1B蛋白水平即升高(P<0.05)，并随着作用时间的延长PTP1B蛋白量升高更明显(r=0.9542，P<0.05；r=0.8486,P<0.05)。经过与油酸共同孵育6～24小时后，2种细胞的PTP1B蛋白水平也显著增高(P<0.05)。同样随着作用时间的延长PTP1B升高更明显，以24小时最为明显(r=0.9351，P<0.05；r=0.9066,P<0.05)。
讨论
, 百拇医药
本研究发现，软脂酸或油酸与大鼠肝脏和骨骼肌细胞共同孵育6～24小时后，细胞SH-PTP2蛋白水平无改变。国外的胰岛素抵抗动物模型研究却发现SH-PTP2是升高的。我们认为这可能是实验方法差异引起的。仅从本实验的角度讲，软脂酸和油酸在24小时内对大鼠肝脏和骨骼肌细胞的SH-PTP2蛋白水平无影响，提示游离脂肪酸并不通过SH-PTP2途径影响胰岛素信号传导。经过与软脂酸或油酸共同孵育6～24小时后，大鼠肝脏和骨骼肌细胞的PTP1B蛋白水平明显升高，且随着作用时间的延长而更明显。Pugazhenthi[1]和Ahmad[2]发现，肥胖伴胰岛素抵抗Zucker大鼠肝脏和骨骼肌组织的PTP1B活性和蛋白量均增高，本研究结果与此相似。Ahmad等[3]还发现，肥胖伴胰岛素抵抗患者的骨骼肌组织内PTP1B的蛋白量明显增高，体重减低后PTP1B活性和蛋白量均降低[4]。
PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一个成员，主要分布于细胞浆内。胰岛素与受体结合后，胰岛素受体自磷酸化并与PTP1B直接结合[5]，在胰岛素受体，由细胞膜向细胞浆的转移过程中，PTP1B促使胰岛素受体β亚单位的磷酸酪氨酸残基去磷酸[6]。体外研究发现，PTP1B高表达细胞在胰岛素刺激后，GLUT4由细胞浆向细胞膜的转移明显减少，提示PTP1B负调节胰岛素刺激的葡萄糖摄取[7]。本研究结果显示，游离脂肪酸促进肝脏和骨骼肌细胞PTP1B的蛋白水平，表明游离脂肪酸可能通过升高PTP1B抑制胰岛素信号传导，可能在胰岛素抵抗的发病过程中起到一定的作用。
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参考文献
1 Pugazhenthi S, Khandelwal RL, Dahl B, et al. Decrease in protein tyrosine phosphatase activities in vanadate-treated obese Zucker(fa/fa) rat liver. Mol Cell Biochem, 1995,153: 125-129.
2 Ahmad F，Goldstein BJ. Increased abundance of specific skeletal muscle protein-tyrosine phosphatases in a genetic model of insulin-resistance obesity and diabetes mellitus. Metabolism, 1995, 44: 1175-1184.
, 百拇医药 3 Ahmad F, Goldstein BJ, Dohm GL, et al. Alterations in skeletal muscle protein-tyrosine phosphatase activity and expression in insulin-resistant human obesity and diabetes. J Clin Invest, 1997, 100: 449-458.
4 Ahmad F, Goldstein BJ, Marco CC, et al. Improved sensitivity to insulin in obese subjects following weight loss is accompanied by reduced protein-tyrosine phosphatases in adipose tissue. Metabolism, 1997, 46:1140-1145.
5 Bandyopadhyay D, Kusari A, Kenner KA, et al. Protein tyrosine phosphatase 1B complexes with the insulin receptor in vivo and is tyrosine phosphorylated in the presence of insulin. J Biol Chem, 1997, 272: 1639-1645.
, http://www.100md.com
6 Lammers R, Ullrich A, Moller NP. The transmembrane protein tyrosine phosphatase alpha dephosphorylates the insulin receptor in intact cells. FEBS Lett，1997, 404: 37-40.
7 Chen H, Quon MJ, Burn P, et al. Protein-tyrosine phosphatases PTP1B and syo are modulations of insulin-stimulated translocation of GLUT4 in transfected rat adipose cells. J Biol Chem, 1997, 272: 8026-8031.
(收稿：1998-02-16 修回：1998-05-26), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院内分泌科
关键词：脂肪酸类，非酯化；受体，胰岛素
中华医学杂志/981009 【摘要】 目的 研究游离脂肪酸对大鼠肝脏和骨骼肌细胞酪氨酸磷酸酶蛋白量的影响，以探讨游离脂肪酸在肥胖诱发的胰岛素抵抗中的作用机理。方法 分离培养Wistar大鼠肝脏和骨骼肌细胞，分别与软脂酸(0.25 mmol/L)或油酸(0.125 mmol/L)共同孵育6～24小时，应用Western杂交方法检测SH-PTP2和PTP1B的蛋白水平。结果 肝脏和骨骼肌细胞的PTP1B蛋白量显著增高(P<0.05)，以24小时为著；SH-PTP2蛋白量无改变(P>0.05)。结论 游离脂肪酸促进大鼠肝脏和骨骼肌细胞PTP1B表达，提示游离脂肪酸可能通过增高PTP1B蛋白量抑制胰岛素信号传导诱发胰岛素抵抗。
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Free fatty acids Promoting PTP1B expression in rat skeletal muscle and hepatic cells
Shao Jianhua, Gao Yan, Yuan Zhenfang，et al. Department of Endocrinology, First Teaching Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To determine whether that free fatty acids (FFAs) impair glucose metabolism is associated with altered insulin signaling system. Methods After skeletal muscle and hepatic cells were incubated with palmitate (0.25mmol/L) or oleate (0.125mmol/L) for 6, 12 or 24 hours, the protein abundance of SH-PTP2 and PTP1B was assessed by western blot. Results SH-PTP2 protein levels showed no significant change in both fatty acids treated muscle and hepatic cells at all time points. The PTP1B was significantly elevated in both liver and muscle cells incubated with FFAs at 6, 12 and 24 hours. Conclusions FFAs promote the expression of PTP1B in rat skeletal muscle and liver cells, and the elevated PTP1B may mediate the insulin resistance induced by FFAs.
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【Key words】 Fatty acids, nonesterified Receptors, insulin
(Natl Med J China, 1998, 78：753-755)
游离脂肪酸是否影响PTP1B和SH-PTP2的表达，是否通过改变其蛋白水平影响胰岛素信号传导目前尚不明确。为此，我们利用体外培养大鼠肝脏和骨骼肌细胞，研究了高浓度游离脂肪酸对PTP1B和SH-PTP2蛋白水平的影响
材料与方法
1.材料：软脂酸、油酸、Aprotinie、胶原酶和胰蛋白酶为美国Sigma产品。DMEM和199细胞培养粉购自美国GIBCO公司。胎牛血清为中国医学科学院血液研究所产品。ECL-化学发光试剂盒为英国Amersham公司产品。抗体购自美国Santa Cruz公司。
, 百拇医药
2.方法：(1) 细胞培养：肝脏细胞原代培养：200 g Wistar大鼠肌注戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，消毒后在超净台内打开腹腔，经门静脉和下腔静脉插管。先用Hank′s液开放灌注5分钟，肝脏呈灰白色，改用0.05%胶原酶灌注，流速为4～5ml/min，10分钟后取下肝脏，去掉肝脏被膜并收集细胞和组织块，用80目筛网过滤，37 ℃ Hank′s液洗涤细胞3次。DMEM培养液悬浮细胞，用台盼蓝染色法测定细胞活率、计数。按每皿(直径为6厘米)3×105个细胞种入细胞培养皿内，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。(2)骨骼肌细胞原代培养：处死出生1天的Wistar大鼠，取后肢骨骼肌，切碎后用37 ℃的消化液(0.05%胶原酶和0.25%的胰蛋白酶)消化2次，每次15分钟。收集细胞后用Hank′s液洗2次。199细胞培养液(10%胎牛血清)悬浮细胞，接种入细胞培养皿。37 ℃培养12小时后收集未贴壁细胞并计数，按每皿5×105个细胞种入用鼠尾胶原
附表 软脂酸和油酸对大鼠肝脏和骨骼肌细胞SH-PTP2和PTP1B水平的影响(A，
±s) 组织, 百拇医药
鼠数
时间
(h)
SH-PTP2
PTP1B
软脂酸
油酸
软脂酸
油酸
0
0.96±0.03
0.85±0.02
0.26±0.03
, 百拇医药
0.35±0.01
肝脏
9
6
0.87±0.05
0.82±0.03
0.47±0.04*
0.52±0.03*
12
0.90±0.06
0.86±0.01
0.60±0.03*
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0.64±0.02*
24
1.02±0.04
0.91±0.02
0.72±0.02**
0.71±0.05**
0
0.88±0.02
0.92±0.03
0.23±0.02
0.22±0.01
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骨骼肌
9
6
0.94±0.04
0.93±0.03
0.35±0.01*
0.37±0.02*
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0.87±0.05
0.54±0.02*
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0.82±0.02
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0.52±0.03**
0.59±0.03**
注：与0小时相比，* P<0.05，与6小时相比，**P<0.05，(A)吸光度
涂布的细胞培养皿(直径为6 cm)，37 ℃培养。待细胞生长并融合，出现自主收缩时开始如下实验：加入游离脂肪酸，吸出原培养液，分别加入含0.25 mmol软脂酸或0.125 mmol油酸的DMED或199培养液，分别培养6、12和24小时。同时设立空白对照。裂解细胞后提取蛋白，用BioRad微量蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。(3)SH-PTP2和PTP1B蛋白水平检测[1]：取各样本50 μg总蛋白，混入含100 mmol DTT的Laemmli上样Buffer，煮沸3分钟。7.5%(SH-PTP2)或10%(PTP1B)的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移法使蛋白转移至硝酸纤维膜上，封膜后加入抗SH-PTP2(1：2 000)或抗PTP1B抗体(1：2 000)。4℃轻摇过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1：2 000)，室温轻摇1小时。增强化学发光法显象暴光。应用激光扫描仪测定各条带光密度。
, http://www.100md.com
3.统计学处理：结果以
±s表示，应用方差分析、q检验以及直线相关进行统计学处理。结果1.软脂酸和油酸对肝脏和骨骼肌细胞SH-PTP2蛋白水平的影响(附表)。
2.软脂酸或油酸对肝脏和骨骼肌细胞PTP1B蛋白水平的影响：肝脏和骨骼肌细胞与软脂酸共同孵育6小时后，PTP1B蛋白水平即升高(P<0.05)，并随着作用时间的延长PTP1B蛋白量升高更明显(r=0.9542，P<0.05；r=0.8486,P<0.05)。经过与油酸共同孵育6～24小时后，2种细胞的PTP1B蛋白水平也显著增高(P<0.05)。同样随着作用时间的延长PTP1B升高更明显，以24小时最为明显(r=0.9351，P<0.05；r=0.9066,P<0.05)。
讨论
, 百拇医药
本研究发现，软脂酸或油酸与大鼠肝脏和骨骼肌细胞共同孵育6～24小时后，细胞SH-PTP2蛋白水平无改变。国外的胰岛素抵抗动物模型研究却发现SH-PTP2是升高的。我们认为这可能是实验方法差异引起的。仅从本实验的角度讲，软脂酸和油酸在24小时内对大鼠肝脏和骨骼肌细胞的SH-PTP2蛋白水平无影响，提示游离脂肪酸并不通过SH-PTP2途径影响胰岛素信号传导。经过与软脂酸或油酸共同孵育6～24小时后，大鼠肝脏和骨骼肌细胞的PTP1B蛋白水平明显升高，且随着作用时间的延长而更明显。Pugazhenthi[1]和Ahmad[2]发现，肥胖伴胰岛素抵抗Zucker大鼠肝脏和骨骼肌组织的PTP1B活性和蛋白量均增高，本研究结果与此相似。Ahmad等[3]还发现，肥胖伴胰岛素抵抗患者的骨骼肌组织内PTP1B的蛋白量明显增高，体重减低后PTP1B活性和蛋白量均降低[4]。
PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一个成员，主要分布于细胞浆内。胰岛素与受体结合后，胰岛素受体自磷酸化并与PTP1B直接结合[5]，在胰岛素受体，由细胞膜向细胞浆的转移过程中，PTP1B促使胰岛素受体β亚单位的磷酸酪氨酸残基去磷酸[6]。体外研究发现，PTP1B高表达细胞在胰岛素刺激后，GLUT4由细胞浆向细胞膜的转移明显减少，提示PTP1B负调节胰岛素刺激的葡萄糖摄取[7]。本研究结果显示，游离脂肪酸促进肝脏和骨骼肌细胞PTP1B的蛋白水平，表明游离脂肪酸可能通过升高PTP1B抑制胰岛素信号传导，可能在胰岛素抵抗的发病过程中起到一定的作用。
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参考文献
1 Pugazhenthi S, Khandelwal RL, Dahl B, et al. Decrease in protein tyrosine phosphatase activities in vanadate-treated obese Zucker(fa/fa) rat liver. Mol Cell Biochem, 1995,153: 125-129.
2 Ahmad F，Goldstein BJ. Increased abundance of specific skeletal muscle protein-tyrosine phosphatases in a genetic model of insulin-resistance obesity and diabetes mellitus. Metabolism, 1995, 44: 1175-1184.
, 百拇医药 3 Ahmad F, Goldstein BJ, Dohm GL, et al. Alterations in skeletal muscle protein-tyrosine phosphatase activity and expression in insulin-resistant human obesity and diabetes. J Clin Invest, 1997, 100: 449-458.
4 Ahmad F, Goldstein BJ, Marco CC, et al. Improved sensitivity to insulin in obese subjects following weight loss is accompanied by reduced protein-tyrosine phosphatases in adipose tissue. Metabolism, 1997, 46:1140-1145.
5 Bandyopadhyay D, Kusari A, Kenner KA, et al. Protein tyrosine phosphatase 1B complexes with the insulin receptor in vivo and is tyrosine phosphorylated in the presence of insulin. J Biol Chem, 1997, 272: 1639-1645.
, http://www.100md.com
6 Lammers R, Ullrich A, Moller NP. The transmembrane protein tyrosine phosphatase alpha dephosphorylates the insulin receptor in intact cells. FEBS Lett，1997, 404: 37-40.
7 Chen H, Quon MJ, Burn P, et al. Protein-tyrosine phosphatases PTP1B and syo are modulations of insulin-stimulated translocation of GLUT4 in transfected rat adipose cells. J Biol Chem, 1997, 272: 8026-8031.
(收稿：1998-02-16 修回：1998-05-26), 百拇医药